鲢鱼肝脏中高分子CPIs提取方法的建立及其鉴定

研究了不同浓度的丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)、热处理条件及pH值对鲢鱼肝脏中高分子半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cysteine proteinase inhibitors,CPIs)提取过程中的作用,根据其对CPIs在TSK液相上高分子质量部分的蛋白峰值和比活力(荧光合成肽底物法)的影响,确定了最佳粗提条件为:以含5 mmol/L的苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF),100mmol/L的Tris,3 mmol/L的EDTA(pH 7.5)作为提取缓冲液,而后在pH 8.7碱处理条件下经90℃加热5 min后,再回调到pH 7.0。用该法制备的鲢鱼肝脏CPIs粗提物经制备型Sephacryl S-200分子筛层析,分离得到的高分子活性部分,进一步经过反相酶谱法鉴定得到一种高相对分子质量的活性CPI,推测其可能是与某些蛋白结合形成了复合物,或是高分子CPIs的二聚体形式。     

鲢鱼卵中低分子CPIs的纯化鉴定及改善鱼糜凝胶强度的效果研究

通过比较鲢鱼卵半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine proteinase inhibitors,CPIs）粗提过程中的比活力（Azocasein法）,确定其最佳粗提条件为：以含0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF）的20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0）作为匀浆缓冲液,并于30 ℃对匀浆样进行pH 3.0酸处理10 min,然后碱回调至pH 8.0,CPIs纯度提高了15.54 倍。进一步经SP Sepharose Fast Flow阳离子层析验证表明,与pH 4.0相比,pH 3.0酸处理能高效除去活性峰Ⅱ中的酸碱及热不稳定杂蛋白,使CPIs比活力提高了48.22 倍。采用SephacrylS-200分子筛层析,获得部分纯化的低分子CPIs组分Ⅱ-b和Ⅱ-c,比活力和纯化倍数分别为1 098.59 U/mg、312.10 倍和1 769.23 U/mg、502.62 倍。电泳分析表明,明胶底物-SDS-反相酶谱法无法鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c的抑制活性;而与木瓜蛋白酶在适宜条件下反应后进行的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）则初步鉴定Ⅱ-b和Ⅱ-c中均含有至少7 kD和10 kD两种低分子CPIs。最后经质构分析表明,Ⅱ-b和Ⅱ-c以5 U/g添加入鲢鱼鱼糜时,均能够极显著提高鲢鱼鱼糜凝胶强度（48.77%和55.55%）,抑制软化。     

鲢鱼和草鱼下脚料中CPIs抑制活性比较及其分子量分布的鉴定

本研究首先确定偶氮酪蛋白(Azocasein)法和荧光合成肽法测定CPIs抑制活性的适宜反应体系,并证实Azocasein法更适合在鲢、草鱼下脚料(卵、皮)粗提过程中监测CPIs的抑制活性,而在层析过程中需采用高灵敏度的荧光合成肽法。Azocasein法测定表明,草鱼卵(349600units、332units/mg)和皮(25600units、87units/mg)中总活和比活均分别显著高于鲢鱼卵(10620units、3.98units/mg)和皮(3726units、14.14units/mg);同时,草鱼卵中CPIs抑制总活、比活均高于皮;鲢鱼卵中CPIs抑制总活高于皮,但抑制比活则低于皮;此外,根据Sephacryl S-200分子筛层析中活性峰位置,初步判断两种鱼卵和皮组织中均存在高(50~128ku)、低(7~19ku)分子量形式的CPIs,但明胶底物-SDS-PAGE反相酶谱中仅可见高分子CPIs形成的条带,而小于20ku的低分子CPIs均无法得到鉴定。     

鲢鱼卵中两种高分子半胱氨酸蛋白酶抑制因子的纯化与鉴定

以鲢鱼卵为材料,通过匀浆、酸处理和超滤制备半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cystine proteinase inhibitors,CPIs）粗提液,进而经Sephacryl S-100分子筛层析、Blue Sepharose 6 Fast Flow染料亲和层析、SP-SepharoseFast Flow阳离子交换层析、ConA Sepharose 4B亲和层析,获得两种纯化的高分子CPIs,即ConA不吸附部分a-1和吸附部分的糖蛋白a-2。二者分别被纯化了102.62 倍和274.28 倍,酶活回收率分别为2.02%和1.42%。通过TSK G2000 SWXL凝胶过滤高效液相色谱结合十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及其反相酶谱法分析,表明a-2及再次经高效液相色谱法回收的a-1在电泳图上均呈单一带,a-2为单一峰,且a-1的分子质量为139 ku,a-2的分子质量为92 ku。二者均能抑制半胱氨酸蛋白酶（木瓜蛋白酶和鲢鱼组织蛋白酶L）但不抑制丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）。根据a-1和a-2的分子质量及抑制活性特征和糖蛋白特性,推测二者可能为鲢鱼卵Kininogens的不同形式。