稻草粉基混合菌发酵产纤维素酶研究

以稻草粉为主要原料,对白腐菌(White-rot fungi)NS75和黑曲霉(Aspergillus niger)NS83进行固态混合发酵产纤维素酶进行研究。混合菌固态发酵与单菌固态发酵实验结果比较表明,混合菌发酵产生的纤维素酶总体酶活明显高于单菌种发酵,其β-葡萄糖苷酶(β-G)酶活较白腐菌NS75单菌发酵提高了120.9%;葡聚糖内切酶(CMC)酶活比黑曲霉NS83单菌发酵提高了140.8%。单因素实验和正交实验结果表明,当稻草粉麸皮质量比为9∶1,料水比为1∶2,白腐菌NS75与黑曲霉NS83的接种比例为1∶1(v∶v)时,培养第3d开始搅拌,每天搅拌一次,于30℃,培养5d,稻草粉基混合菌发酵产纤维素酶中CMC酶活达到16650U/g,β-G酶活为16108U/g、滤纸酶活(FPA)酶活为3164U/g。     

三株产几丁质酶菌株的筛选、产酶条件优化及水解虾壳的研究

目的:筛选鉴定产几丁质酶的菌株并优化其发酵条件,最终应用于虾壳降解研究。方法:以盐城市滩涂海泥为样品,利用平板筛选水解几丁质的菌株,运用生物信息学方法鉴定菌株,通过单因素优化其发酵条件,并将筛选得到的菌株和优化后的发酵条件用于虾壳发酵。结果:鉴定得到三株显著降解胶体几丁质的菌,分别是发光杆菌（Photobacterium sp. LYM-1）、需钠弧菌（Vibrio sp. WM-1）和希瓦氏菌（Shewanella sp. ZXY-1）;优化发酵条件:发光杆菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为NH₄Cl 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为6.5,温度为32 ℃,发酵1 d酶活最高为15.37±0.55 U/mL,是优化前的4.37倍;需钠弧菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为NH₄Cl 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为7.5,温度为22 ℃,发酵2 d酶活最高为40.82±6.03 U/mL,是优化前的1.60倍;希瓦氏菌的碳源为几丁质10 g/L,氮源为(NH₄)₂SO₄ 2.0 g/L,接种量为3%,发酵液pH为6.5,温度为22 ℃,发酵1 d酶活最高为25.64±3.29 U/mL,是优化前的2.47倍;三株菌均能利用虾壳产几丁质酶,但利用效率均低于几丁质,酶活力分别为10.25±0.95、32.16±2.25和21.81±4.27 U/mL。结论:本研究从盐碱地筛选得到三株产几丁质酶的菌株,优化后酶活力均得到提高,且均能利用虾壳产几丁质酶,为发酵虾壳制备几丁质酶提供新的菌株来源。     

一株产胶原蛋白酶细菌的鉴定及产酶条件优化

采用形态学特征、生理生化特征结合16S rDNA对一株产胞外胶原蛋白酶的菌株AL-13进行鉴定。获得安全、高效、高产量的生产胶原蛋白酶工艺。以胶原蛋白酶活性为指标,采用单因素实验优化温度、pH、接种量等产酶培养条件后,利用单因素结合响应曲面法优化产酶培养基。结果表明,AL-13鉴定为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus),最适产酶培养条件为:培养时间48 h、培养温度25 ℃、初始pH8.0、接种量6%(v/v),最适产酶培养基为:葡萄糖8.14 g/L、牛肉膏11.63 g/L、氯化钙0.17 g/L、磷酸氢二钾2.08 g/L、氯化钠9.48 g/L,在该产酶条件下胶原蛋白酶活力预测值为154.89 U/mL,验证结果显示酶活为(153.06±3.73) U/mL,此结果与预测值接近,相对误差为0.04%。本实验成功优化了一株产胶原蛋白酶细菌的产酶条件,产酶条件优化后的酶活(153.06 U/mL)较优化前(16.14 U/mL)提高了9.5倍。     

山西老陈醋高产糖化酶霉菌的筛选、鉴定及产酶条件优化

从山西老陈醋大曲中共分离出75株霉菌,对高产糖化酶霉菌进行筛选、鉴定及产酶条件优化。结果表明,筛选出1株优良黑曲霉(Aspergillus niger)186,在麸皮固态培养基中其糖化酶、蛋白酶和纤维素酶酶活分别为3 963.79 U/g、368.80 U/g和4 476.60 U/g。糖化酶基因聚合酶链反应(PCR)测序结果显示,该酶脱氧核糖核酸(DNA)序列编码区长1 449 bp,共编码482个氨基酸,预测酶的分子质量为51.75 kDa,等电点为3.99。最佳产酶条件为:麸皮4%,硫酸铵0.5%,初始pH值为7.0,接种量8%,装液量100 m L/250 m L,转速145 r/min,培养7 d。在此优化条件下,黑曲霉186糖化酶活力可达892.98 U/m L,是优化前的1.77倍。     

响应面法优化小刺青霉16-7产纤维素酶液体发酵工艺

在单因素试验的基础上,采用Plackett-Burman试验设计及响应面分析,利用Minitab软件,对纤维素酶高产菌小刺青霉（Penicillium spinulosum）16-7进行发酵工艺条件的优化。通过Plackett-Burman试验筛选出影响产酶的3 个主要因素,即稻草-麸皮（碳源）添加量、培养温度和培养时间。在此基础上通过最陡爬坡试验和响应面分析法进行回归分析。结果表明：当稻草-麸皮添加量为3.45 g/100 mL、培养温度为27.11 ℃和培养时间为146.27 h时,酶活力最高,此条件下滤纸酶酶活力预测值为132.53 U/mL。经过修正,选择稻草-麸皮添加量3.45 g/100 mL、培养温度27 ℃、培养时间146 h,此条件下测得羧甲基纤维素酶酶活力为387.58 U/mL、滤纸酶酶活力为128.86 U/mL,滤纸酶酶活力比优化前提高49.07%。     

酒曲源曲霉的分离及其产蛋白酶条件优化

利用稀释平板法从曲样中分离获得4株曲霉1#、2#、3#和4#,将各菌株分别制米曲后测定酶活力,并通过正交实验及单因素实验确定蛋白酶发酵的培养基和最佳工艺条件。在优化的发酵培养基和发酵条件下(温度、培养时间、培养基起始pH、接种量),产蛋白酶活力分别达到:1#菌11545.7U/g,2#菌8240.4U/g,3#菌9146.0U/g,4#菌4527.7U/g。最后,将活力比较高的三株菌进行Biolog微生物系统鉴定,分别为栖土曲霉(Aspergillus terricola Marchal),寄生曲霉(Aspergillus parasiticus Speare)和杂色曲霉(Aspergillus versicolor)。     

重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a（＋）-bgl诱导表达β-葡聚糖酶的条件优化

研究自行构建的产β-葡聚糖酶的工程菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl在LB培养基中的生长特性,考察种子液的菌龄、培养基起始pH、接种量及诱导起始时发酵液菌浓度等对β-葡聚糖酶产生水平的影响;通过正交试验确定诱导剂IPTG及乳糖添加量、诱导温度及诱导剂作用时间.结果表明:培养基起始pH 7.0,对数生长中期的种子液(OD600为0.35)以接种量(体积分数)10%接入摇瓶发酵培养,37 ℃,200 r/min培养约3 h,菌液OD值达到1.0左右,添加终浓度分别为0.033 6 mmol/L的IPTG及10 mmol/L乳糖,24℃诱导6 h,发酵液清液中酶活达到最高(336.33 U/mL),菌体生长量为1.12 g/L,发酵液中总酶活达到459.32 U/mL,是原始菌株在相同条件下所产酶活的6.62倍.采用优化培养条件及诱导剂作用条件,重组菌在TB培养基中酶活水平进一步提高,诱导剂作用10 h,发酵清液中酶活为1 090.31 U/mL,总酶活1 570.83 U/mL,是原始菌在该条件下酶活的19.73倍,显示出重组菌具有广阔的工业化应用前景.     

里氏木霉Rut-C30发酵热水预处理稻草产纤维素酶

为提高工业生产菌Trichoderma reesei Rut-C30产酶能力,以热水预处理稻草(hot water pretreated rice straw,HWPRS)为碳源,开展系统优化培养基与培养条件以及采用添加剂等方面的实验工作。菌株初始摇瓶发酵HWPR产纤维素酶在168 h时滤纸酶活(FPA)为1.20 U/m L。通过单因素实验与正交实验,获得最佳培养基(g/L):HWPRS 50.0、玉米浆6.0、(NH_4)_2SO_44.0、KH_2PO_41.0、尿素0.2、MgSO_4·7H_2O 0.4、CaCl_20.3;最佳培养条件:pH6.0、转速220 r/min、温度30℃、接种量φ6%;优化后菌株产酶FPA达2.69 U/m L,是优化前2倍以上。添加吐温-80能显著提高产酶,β-葡萄糖苷酶活(BG)提高26%;添加乳糖主要能提高BG酶活;实验中首次发现壳聚糖类物质能促进纤维素酶发酵,其中壳聚糖效果最明显,添加1.5 g/L壳聚糖时纤维素酶FPA与BG分别提高了10%和30%,使纤维素酶FPA、CMCase和BG分别达到3.67、8.65和1.76 U/m L。该产酶稳定性为上罐实验证实,所产纤维素酶FPA水平是初始摇瓶发酵的3倍,初步显示了其工业发酵潜力。     

纤维素降解芽孢菌的筛选及产酶条件优化

为筛选高效的纤维素降解芽孢菌,利用刚果红平板染色法初筛,纤维素酶活性（以滤纸酶活表示）为评价指标进行复筛,从腐木中分离筛选出2株高产纤维素酶菌株K1、K2;结合形态学观察、生理生化特征和16S rDNA基因序列同源性分析,分别鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。对培养条件进行单因素优化和正交试验优化,初步确定菌株K1最佳产酶条件为培养时间3 d,培养温度34 ℃、初始pH值7.0、接种量5%、装液量40%,在此优化条件下滤纸酶活为98.4 U/mL,是优化前的2.1倍。菌株K2最佳产酶条件为培养时间2 d,培养温度34 ℃、初始pH值7.0、接种量6%、装液量为30%,在此优化条件下,滤纸酶活为86.7 U/mL,是优化前的1.8倍。     

混合菌固态发酵产纤维素酶条件的研究

以稻草秸秆粉为碳源,利用绿色木霉和黑曲霉进行固体发酵产纤雏素酶的研究。以混合菌接种比例、麦麸与稻草粉质量比、发酵时间和三角瓶装量4因素为考察对象,通过单因素实验和正交实验优化混合菌固体发酵条件。确定该混合菌株的最优产酶条件,结果表明,混合菌最佳固体发酵条件为：绿色木霉和黑曲霉接种比例为1：1、麦麸与稻草粉质量比为1：3．0、发酵时间为4d、装量为50mL／1000mL三角瓶。在此最佳发酵条件下,FPA酶活、CMC酶活、β-G酶活分别为5．291U／mL、9．33IU／mL和49．91IU／mL,分别是单菌发酵的2．28～2．47倍、2．39～2．45倍、1．38～2．09倍。混合菌发酵产生的各酶活性均高于各种菌单独发酵产生的各酶活性。     

混菌降解稻草纤维素产葡萄糖的条件研究

利用从环境中筛选出的一株木霉与一株曲霉,在以稻草粉为主要碳源的液体培养基中混菌发酵,所得的粗酶液催化降解经预处理的稻草粉得到葡萄糖液。在单因素实验基础上进行正交实验,正交实验表明,粗酶液用量对稻草粉降解为葡萄糖影响最大,其次为温度,然后是pH,稻草粉浓度对降解影响最小。稻草粉最优降解条件为：粗酶液用量为降解液总体积的3%,降解液初始稻草粉浓度60gL,pH4.8,降解温度50℃,此条件下降解率可达80%。     

黑曲霉液体发酵桔粉产纤维素酶的研究

以桔粉为原料,以黑曲霉（Aspergillus niger）为发酵菌株,采用液体发酵法生产纤维素酶。通过单因素试验考查了麸皮和蛋白胨的比例（C/N）、装液量及接种量3个因素对产酶的影响,并在此基础上,通过正交试验确定了发酵产酶的工艺条件为：添加桔粉80 g/L,麸皮和蛋白胨质量比为1∶2、250 mL三角瓶装30 mL Mandels氏营养液、接种量3 mL,于30℃下培养72 h,纤维素酶产量达到1885.71 U/g。     

以水稻秸秆为基质里氏木霉产酶条件优化

以里氏木霉（Trichoderma reesei）为研究对象,对水稻秸秆进行糖化试验。通过单因素试验及响应面法优化里氏木霉产酶培养基及产酶条件。结果表明,里氏木霉产酶最佳培养基为：水稻秸秆15.0 g/L、（NH4）2SO4 2.0 g/L、KH2PO4 3.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、吐温-80 0.5 mL/L、微量元素液10.0 mL/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L。此优化条件下,菌株的滤纸酶酶活为0.612 PFU/mL,提高了52.6%。最佳发酵条件为：发酵温度29 ℃,初始pH 6、接种量5.0%、转速150 r/min、发酵时间8 d。在此优化条件下,滤纸酶酶活为1.12 PFU/mL,提高了83.2%。     

液态发酵原位酶解糖化水稻秸秆工艺优化

为探究以原位酶解方式整合产酶菌株的发酵条件和酶解条件差异的可行性,以木质纤维结构典型的水稻秸秆为对象,里氏木霉为产酶微生物,通过研究液态发酵原位酶解糖化水稻秸秆,对发酵过程和酶解过程协同控制条件进行优化。结果显示,最优产酶发酵条件为水稻秸秆添加量30 g/L,发酵温度30℃,初始pH 6.5,发酵时间48 h;最优酶解条件为酶解pH 4.8,酶解温度50℃,酶解时间24 h,最终的秸秆比产糖量为0.350 g/g。通过在酶解阶段时补加少量的粗酶液(体积分数5%),可以提升最终的比产糖量,由0.332 g/g提升至0.400 g/g,约提升了20%。原位酶解糖化秸秆纤维素是实现水稻秸秆高效降解利用的可行方式。该研究可为纤维素酶解工艺提供技术参考,为秸秆纤维素资源化利用提供一定理论依据。     

秸秆纤维素降解菌的分离筛选、复合菌系构建及产酶条件优化

该研究采用刚果红染色法和滤纸条崩解法从山西老陈醋源中分离筛选纤维素降解菌,通过形态观察及分子生物学技术对其进行菌种鉴定。以滤纸酶活性为筛选指标构建复合菌系,采用单因素试验及响应面试验对其产酶发酵条件进行优化,并评价其对不同秸秆的降解效果。结果表明,筛选出3株纤维素降解菌,编号为J1、J2和J3,分别被鉴定为灿烂类芽胞杆菌（Paenibacillus lautus）、千叶类芽胞杆菌（Paenibacillus chibensis）和窖泥类芽胞杆菌（Paenibacillus vini）。3株菌等比例复配得到最佳复合菌系D,其最优产酶发酵条件为初始pH 7.4,接种量9%,发酵温度40℃。在此优化条件下,滤纸酶活性达到35.10 U/m L,是优化前的1.6倍。复合菌系D对不同秸秆均具有较好的降解效果,且对小麦秸秆的降解率最高,达27.63%。     

纳豆激酶发酵条件的优化

利用Plackett-Burman 方法对影响纳豆芽孢杆菌液体发酵的各因素进行评价,筛选出对产纳豆激酶有显著效应的主要因素是豆饼粉浓度。在此基础上,用响应面分析法对发酵培养基中的豆饼粉浓度、CaCl2 浓度、葡萄糖浓度进行优化。所得的最优培养基成分为葡萄糖 1%、豆饼粉 3%、KH2PO4 0.2%、K2HPO4·3H2O 0.26%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCl2 0.12%。拟合实验结果显示,纳豆激酶液体发酵液的酶活由初始培养条件的约1800U/ml提高到优化后的2226.06U/ml。     

灰绿曲霉突变株降解稻草秸秆及联合产氢的研究

对灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)突变株EU7-22进行单因子和正交实验,确定菌株利用稻草产纤维素酶的液态发酵优化组合条件为:稻草粉3%、蛋白胨0.5%、温度35℃、起始pH 5。在优化条件下培养4~5 d可达到产酶高峰。利用优化培养后的酶液水解稻草粉产糖,在最适条件下,稻草粉酶解反应24 h后,糖化率可达49%。利用稻草粉做底物,EU7-22和产氢克雷伯氏菌HP1联合发酵,1 g稻草粉可产氢23.7 mL。     

产柚苷酶黑曲霉SL2K发酵条件优化

该研究以黑曲霉（Aspergillus niger）SL2K为研究对象,对其产柚苷酶的液态发酵条件进行优化。 通过单因素试验对碳源、氮 源、诱导物、接种量、初始pH值和培养时间进行考查,在单因素基础上,选取麸皮粉添加量、蛋白胨添加量、接种量、初始pH值4个因素 进行4水平正交试验优化。 结果表明,优化后的产酶发酵条件为麸皮粉添加量3%,蛋白胨添加量5%,接种量8%,初始pH值为5.0,鼠李 糖0.08%、KH2PO4 1 g/L,KCl 0.5 g/L,MgSO·4 7H2O 0.5 g/L,FeSO4 0.01 g/L,装液量为100 mL/250 mL,摇床转速180 r/min,培养温度28 ℃, 培养时间96 h。 在此优化条件下,柚苷酶活力为233.89 U/mL,是优化前的2.13倍。     

汽爆玉米秸秆固态发酵生产饲料的研究

以汽爆玉米秸秆为原料 ,进行固态发酵生产蛋白饲料的研究 ,优化了发酵的工艺条件。实验结果表明 :发酵温度为 37℃ ,固液比为 1∶3,培养基中 (NH4 ) 2 SO4 的添加量为 4.5 % ,经过 4d发酵 ,蛋白含量为 16 .7% ,FPA酶活为9.5U/g .min ,失重率为 2 7%。汽爆秸秆发酵结果好于未处理的秸秆。