传统分离培养结合DGGE技术研究新疆传统发酵酸驼乳中乳酸菌的多样性

目的:分析新疆传统发酵酸驼乳中乳酸菌多样性,为我国传统乳制品微生物资源的利用提供基础数据。方法:采用传统分离培养和基于16S r DNA的PCR-DGGE方法,对12份酸驼乳样品中分离出的87株可培养乳酸菌进行形态、生理生化结合16S r DNA分子法鉴定菌株;对DGGE图谱上的15条16S r DNA目标条带切胶回收测序。结果:传统培养法显示样品中乳酸菌总数在106~108CFU/m L之间,其中植物乳杆菌为优势菌群,次优势菌群为乳酸片球菌;通过DGGE目标条带序列分析与相似性比对,植物乳杆菌、瑞士乳杆菌丰度最高,是优势菌群。此外,鉴定出干酪乳杆菌、屎肠球菌、乳明串珠菌、芽孢杆菌。DGGE图谱显示:样品混合菌群中有5条条带无对应的纯菌株,而纯菌株在混合菌群的图谱上都有相应的条带。结论:传统分离培养与PCR-DGGE在分析优势细菌种群上结果一致,均为植物乳杆菌;用传统分离培养未鉴定到屎肠球菌和芽孢杆菌。DGGE图谱能更全面地反映样品中的弱势菌群,体现样品细菌多样性的真实水平。     

豆豉中主要分离细菌对小鼠生化指标及肠道菌群的影响

采用豆豉样品进行细菌分离培养和细菌16S rDNA基因PCR扩增、测序分析,并将分离所得细菌进行小鼠灌胃实验。结果显示,豆豉中的主要分离细菌为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、类肠膜魏斯氏菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、发酵乳杆菌、表皮葡萄球菌。并且,各菌对小鼠丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、肌酐(CREA)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)各项生化指标基本无影响。然而,其中解淀粉芽孢杆菌DC02能极显著性地降低小鼠血糖(GLU)水平,该菌有望成为治疗糖尿病的潜在菌株。活菌计数结果表明,除表皮葡萄菌以外,豆豉中分离所得其它细菌均能改善肠道菌群结构。可见,豆豉中分离所得主要细菌对正常机体安全、无致病性。     

基于NRPS基因筛选鉴定产生环脂肽葡萄附生细菌的研究

本研究采用平板稀释法和斜面分离纯化技术,从夏黑葡萄中筛选分离到5株附生细菌,提取菌株的基因组DNA,PCR扩增16S r DNA序列,产物纯化后进行克隆测序,利用MEGA 6.0软件对序列进行同源性比对分析,构建系统进化树后,将5株附生细菌分别鉴定为克雷伯肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、克考氏菌(Kocuria marina)、嗜气芽孢杆菌(Bacillus aerophilus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus agaridevorans)。在此基础上,以非核糖体多肽合成酶基因(non-ribosomal peptide compounds synthetase,NRPS)为靶点,筛选到含有目的条带的菌株PTWA2,经系统发育树预测该菌株能够产生环脂肽类化合物。该菌株发酵产物经有机溶剂萃取、常压硅胶柱层析、Sephedex LH-20等分离手段纯化得到一个单体化合物,采用核磁共振和质谱方法鉴定该化合物为环脂肽Surfactin A。该研究结果为以功能基因定向筛选产生环脂肽化合物的菌株提供了新的研究方法与理论依据。     

PCR-DGGE技术检测羊羔美酒大曲中细菌多样性

目的：使用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denatured gradientgelelectrophoresis,PCR-DGGE）技术检测羊羔美酒大曲中的细菌,探寻酒曲中细菌菌群的多样性组成,研究羊羔美酒的风味特征。方法：对羊羔美酒大曲进行样品处理、提取总DNA、PCR扩增、DGGE条带的切胶与测序分析。结果：利用PCR-DGGE技术检测到羊羔美酒大曲中包含魏斯氏菌属（Weissella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌（Pediococcus）、芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）和4 个不可培养的细菌种类。结论：羊羔美酒大曲中细菌菌群多样性丰富,其中乳酸菌菌群是最大的细菌群系。     

胀气食醋中污染微生物的分离鉴定及其生理生化特性

本文对比分析了胀气食醋与正常食醋的理化性质,对胀气食醋的顶隙气体进行了分析,并分离鉴定了胀气食醋中的潜在污染微生物。结果表明,与正常食醋相比,胀气食醋中总固形物含量增加了65%,总酸度增加了47.4%,氨基态氮含量增加了2.3倍;胀气食醋顶隙气体成分主要为二氧化碳;从胀气食醋中分离到6株细菌,经鉴定1号、4号、RT1、RT2、RT3、RT4分别与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis)、Bacillus velezensis、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus stubtilis)的相似度均达到98%及以上。且各菌株均可在糖发酵培养基中产生白色絮状物沉淀,其中1号和4号菌产生沉淀较多。4号菌能产生气体,是造成食醋胀气的主要潜在微生物。     

新鲜哈密瓜汁中可培养细菌的分离鉴定及系统发育分析

采用稀释平板法从新鲜哈密瓜汁中分离出48株可培养细菌,通过传统的形态特征鉴定,将其归为10个类群。利用细菌通用引物PCR扩增10个类群代表菌株的16S rRNA基因,并进行序列测定。将获得的序列通过Blast在GenBank数据库中搜索相关菌株的同源性序列,采用Clustal1.81软件比对,用Mega4.1软件构建系统发育树。系统发育分析结合表型特征研究表明,新鲜哈密瓜汁中可培养细菌以芽孢杆菌属为优势微生物类群,主要为枯草芽孢杆菌Bacillus sub-tilis,其次为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis、苏云金芽孢杆菌Bacillus mojavensis。此外还有铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、洋葱伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepaciastrain、鲍曼不动杆菌Acinetobacter baumannii,以及肠球菌属Enterococcussp、克雷伯氏菌属Klebsiellasp的菌株。     

贵州大方豆酱中优势细菌种群分析与分离鉴定

应用PCR-DGGE技术分析贵州大方县特色豆酱中细菌种群,并通过传统分离培养方法得到其主要优势菌株。PCR-DGGE指纹图谱在大方豆酱中共鉴定到食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等10种菌,其中主要优势菌是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）,其次为乳酸片球菌（Pediococcus sacidilactici）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）;并利用传统分离培养方法在大方豆酱中分离得到枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）,以便后期研究。     

PCR-DGGE结合传统分离培养分析盒装豆腐腐败菌多样性

研究了盒装豆腐中腐败菌多样性特征及与盒装豆腐的种类、产地的相关性,以期为盒装豆腐的加工贮藏提供理论依据。采用传统培养分离及PCR-DGGE方法对3个产地的盒装内酯豆腐、盒装老豆腐、盒装嫩豆腐中腐败菌多样性进行研究比较。传统培养分离方法观察了豆腐中主要腐败菌的形态及菌落特征,并结合生化试验对腐败菌株进行了鉴定;PCR-DGGE技术提取豆腐中腐败细菌的基因组DNA,扩增细菌16s rDNA V3可变区,PCR产物经DGGE电泳分析,选取优势条带割胶回收,克隆子测序,序列比对及构建菌株系统发育树,同时做样品相似性分析。结果表明:芽孢杆菌为盒装豆腐主要腐败菌,盒装豆腐腐败菌多样性与豆腐产地相关性较高,而与豆腐种类相关性不高。     

蜂粮中芽孢杆菌的分离鉴定及其耐酸耐高糖特性的分析

为丰富人工发酵蜂花粉生产蜂粮的菌种资源,从天然蜂粮中筛选芽孢杆菌。通过平板涂布法从中蜂蜂粮样品中分离产芽孢的细菌,利用16S rRNA基因同源比对及系统发育分析对其进行初步鉴定,并分析其耐酸耐高糖特性。共分离到16株隶属于Bacillus tequilensis、Bacillus aerophilus、Fictibacillus nanhaiensis、Bacillus sonorensis、Lysinibacillus xylanilyticus、Lysinibacillus fusiformis、Bacillus invictus、Bacillus methylotrophicus的芽孢杆菌。其中10株菌能在低酸和高糖条件下正常生长,菌株Br7、Br9和Br11的芽孢生成量较少,有潜力应用于人工发酵蜂花粉制备蜂粮。     

酸土脂环酸芽孢杆菌对玉米果汁饮料挥发性成分及色度的影响

从市售异味玉米果汁饮料中分离、筛选嗜酸耐热菌,对其进行分子生物学鉴定,并研究分离菌株对玉米果汁饮料挥发性成分和色度的影响。结果表明,市售异味玉米果汁饮料中分离筛选出一株嗜酸耐热芽孢杆菌,该菌最适生长温度为45~50℃,最适pH为3.5~4.0,16S rDNA测序鉴定为酸土脂环酸芽孢杆菌。将分离菌株接种于正常样品于45℃培养30 d,气相色谱-质谱联用技术(Gas Chromatograph-Mass Spectrometer,GC-MS)分析表明,正常样品和接种样品挥发性成分的种类相似,但在关键性气味物质的含量上有显著差异。接种样品中14种挥发性物质含量极显著高于正常样品,其中愈创木酚和邻乙氧基苯酚具有类似草药、消毒水等异味,且两种物质在接种样品中气味活度分别高达1696.58和398.40,为酸土脂环酸芽孢杆菌污染该饮料产生的特征性异味物质。色差分析表明接种样品L值显著高于正常样品,表明污染饮料产生异味的同时产品白度增加。     

小米乳酸菌发酵饮料胀罐微生物的分离及鉴定

目的 对小米乳酸菌饮料胀罐微生物进行分离和菌株鉴定,并对所分离菌株的产气特性进行研究。方法 使用孟加拉红琼脂培养基、营养肉汤琼脂培养基和改良MRS琼脂培养基对小米乳酸菌饮料胀罐微生物进行分离和纯化,根据菌落形态观察、菌体形态观察、16S rRNA 序列分析并结合基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(ALDI-TOF MS)技术对分离菌株进行鉴定。最后将分离菌株接种到无菌小米乳酸菌饮料产品中,培养观察产气现象。结果 共分离出6株细菌,编号为B001、B002、B003、B003、B005、B006,菌种鉴定结果均为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei),6株细菌均具有产气现象。结论 副干酪乳杆菌是引起本研究产品胀罐的主要原因。     

柳州酸笋中降亚硝酸盐乳酸菌的筛选及鉴定

为了获得适用于柳州酸笋发酵的降亚硝酸盐乳酸菌,利用MRS培养基对柳州酸笋中的乳酸菌进行分离、纯化及鉴定,并探讨影响菌株降解亚硝酸盐能力的因素。结果表明,共分离获得22株乳酸菌,用盐酸萘乙二胺法对这22株乳酸菌进行降亚硝酸盐能力测试,得到一株降解能力较强的乳酸菌LC-3-3,经分子生物学鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）;该菌株在以葡萄糖为碳源（20 g/L）、蛋白胨为氮源（10 g/L）、接种量为6%、pH值为6.0、温度为37 ℃的条件下,亚硝酸盐的降解率为76.58%,降解效果较好。     

啤酒有害菌的PCR检测和SYBR Green实时PCR定量

啤酒有害菌是一些能在啤酒中存活并使啤酒的外观和风味发生改变的细菌,对其进行快速检测和定量是啤酒生产急待解决的问题。我们从华润雪花啤酒（中国）有限公司各工厂提供的样品中分离到28株啤酒有害菌,16S rDNA序列的系统进化分析表明,其中26个菌株属于乳杆菌属（Lactobacillus spp．）、1个菌株为明串珠菌属（Leuconostoc spp．）,1个菌株为片球菌属（Pediococcu sp．）。根据酒花（hop）抗性基因horA、horB和horC的保守序列设计了扩增这3个基因的PCR引物,用这些引物对28株啤酒有害菌进行了常规PCR检测,检出率分别为89％、79％和75％,用hor A—horC双引物进行检测,检出率为100％。用SYBR Green实时定量PCR技术,以horA基因为靶序列,建立了对啤酒有害菌的细胞数进行快速定量的新方法,用该方法测定的污染啤酒样品中有害菌的浓度与平板培养法相近。     

一种改进的产生物胺乳酸菌的检测方法

本文自行设计了一种对产生物胺(BA)乳酸菌进行检测的双层培养基法，利用该方法对实验室保藏菌种和一些发酵食品中的菌株进行了检测，实验证明此方法可在同一块平板上区分开产生物胺菌和不产生物胺菌，且方法简单、易于识别、准确性高，对生产和优良菌种发酵剂的开发很有帮助。     

发酵乳球菌菌株的分离鉴定

对9株发酵乳球菌菌株进行MRS固体平板培养基划线分离和形态学比较观察，井采用生化试验和RAPD对其进行鉴定。划线分离得到11株菌：通过菌体常规磷钨酸负染色标本的透射电镜观察，描述了各菌体的大小、形状以及裂殖方式；依据各菌种生化代谢差异设计生化试验．得到了2个发酵型，将其鉴定为2个菌群（乳酸乳球菌乳酸亚种和嗜热链球菌）；20个随机引物的RAPD筛选得到了9个不同的基因型．将其鉴定为9株细菌。     

胀袋红烧肉和酱料包中产气微生物的分离与鉴定

为解决红烧肉和酱料包的胀袋和腐败问题,该研究对胀袋红烧肉、牛排酱与番茄酱的微生物进行分离鉴定,并通过16S rDNA鉴定和产气验证试验确定导致产品胀袋的主要产气微生物。结果显示,从3种胀袋产品中共分离出9株优势菌,编号为1~9。其中菌株1号和5号为革兰氏阳性球菌,经鉴定1号菌株为枝状葡萄球菌（Staphylococcus edaphicus）、5号菌株为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）;4号和8号菌为革兰氏阴性杆菌,经鉴定4号菌株为巴氏柠檬酸杆菌（Citrobacter braakii）、8号菌株为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）;2号、3号、6号、7号和9号为革兰氏阳性杆菌,经鉴定2号菌株为魏斯氏菌（Weissella cibaria）、3号菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、6号菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、7号菌株为太平洋芽孢杆菌（Bacillus pacificus）、9号菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。经产气验证试验,可以确定Bacillus velezensis、Citrobacter braakii、Bacillus cereus、Bacillus pacificus和Citrobacter freundii为产气微生物,是引起红烧肉和酱料包胀袋的主要污染微生物。综合分析,芽孢杆菌是导致包装食品胀袋的主要产气微生物之一,有效控制芽孢及芽孢杆菌的污染是解决食品胀袋问题的关键。     

产1- 脱氧野尻霉素微生物菌株的筛选与鉴定

本研究从桑园土壤中经过初筛、复筛鉴定等方法筛选产DNJ 的菌株。利用含葡萄糖淀粉酶的琼脂平板,从263个菌株中筛选出7株反应后有不同程度变蓝的菌株。利用反相高效液相色谱法从7株菌株中鉴定出1株产DNJ菌株,菌株命名为SL-429,该菌株在发酵培养基为KCl 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、NaNO3 0.2%、NaCl0.5%、CaCO3 0.35%、可溶性淀粉 4%、大豆粉 1%、胰蛋白1%,pH7.2、27℃下发酵,DNJ 产量为0.017mg/ml。根据其形态特征、生理生化特征鉴定,初步确定为浅紫灰链霉菌。     

丹江镇辣椒红酸汤细菌菌群多样性分析及抗食源性致病菌乳酸菌筛选

以贵州丹江镇传统辣椒红酸汤为研究对象,采用Illumina MiSeq高通量测序技术进行细菌菌群多样性分析,结合微生物纯培养技术和双层平板法从中分离优势乳酸菌,通过分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并筛选抗食源性致病菌乳酸菌。结果表明,辣椒红酸汤样品中的优势细菌门为厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）;优势细菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）。从辣椒红酸汤样品中共分离得到17株乳酸菌,经鉴定,11株为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、3株为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、1株为副干酪乳杆菌亚种（Lactobacillus paracasei subsp.）、1株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、1株为乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）,其中4株乳酸菌具有较好的产酸和抑菌性能,且干酪乳杆菌ST7-14的抑菌能力最好,对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）ST2-1和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）ST2-6的抑菌圈直径分别为37.0 mm和31.5 mm。     

刺梨白粉病拮抗菌的筛选及其抑菌机制初探

为筛选出对刺梨白粉病具有良好抑制作用的拮抗菌,从健康刺梨及其根系土壤进行微生物分离,以刺梨白粉病病原菌(Sphaerotheca pannosa)为靶标菌株,采用叶盘法对拮抗菌进行筛选,通过形态学、生理生化特征以及16S rRNA对筛选的拮抗菌进行鉴定,测定其OD值绘制生长曲线,并探究拮抗菌对病原菌孢子萌发和菌丝的影响及其产酶情况。结果表明:共分离得到48株细菌,其中JK-6和JK-32具有显著抑制作用,经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和空气芽孢杆菌(Bacillus aerius),对刺梨白粉病的防治效果达到了60%和57%;拮抗菌作用下致使病原菌的孢子在萌发过程中发生异常膨大现象,菌丝表面变得粗糙、膨大、缠绕和融断;产酶情况表明两株拮抗菌均可产生蛋白酶、纤维素酶以及果胶酶。为刺梨白粉病的生物防治提供了理论基础,具有进一步研究价值。