黄酒中尿素的酶法降解应用研究

在黄酒生产中使用脲酶降解尿素有望成为控制氨基甲酸乙酯(EC)的含量的有效手段。本研究选取日本清酒生产用商品化脲酶NAGAPSIN,在考察了其基于温度和pH的酶学性质及各因素对酶降解尿素影响的基础上探索了该酶在降解成品黄酒中尿素中的应用。结果显示该酶的作用最适温度为30℃,最适作用pH为4.4;在低温及酸性条件下具有较好的稳定性。在成品黄酒中的效果验证表明,30 U/L的脲酶既可于2 d内降解约80%的尿素,且残余酶活易清除。基于以上结果,进一步提出了两种脲酶在实际生产中的应用方案。本研究为黄酒中尿素和EC的酶法控制提供了实验数据支持及实际应用指导。     

氨基甲酸乙酯水解酶可溶性表达及其酶学性质研究

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)是一种主要存在于发酵食品和酒精饮料中对人体有潜在致癌性的有害物质,EC水解酶能够有效地消减EC,但其存在异源表达量较低、乙醇耐受性较差等问题。该研究结合计算机辅助改造与基于机器学习的融合标签设计等手段对赖氨酸芽孢杆菌来源的EC水解酶进行改造及优化。首先利用PROSS计算程序改造EC水解酶提高其乙醇耐受性,其次基于支持向量机回归的机器学习模型设计促溶标签提高其可溶性表达。基于PROSS筛选获得了组合突变体S21E/H197Y/Q328C/P348I(EC4),其酶活力相较于野生型提高了1.55倍,20%(体积分数)乙醇条件下的相对酶活力较野生型提高了约2.56倍。进一步筛选了合适的短促溶标签获得可溶性表达提高最多的是SVM1-EC4,其酶活力约为野生型的1.82倍,15%(体积分数)乙醇下的相对酶活力是野生型的3.99倍,且在模拟酒样中水解EC效果是野生型的2.07倍。总之,计算与融合标签相结合对EC水解酶进行改造能够有效地提高其可溶性表达及乙醇耐受性,为其工业应用提供了一定的理论依据和技术基础。     

近10年我国传统饮料酒白酒和黄酒品质安全研究现状与展望

总体上说,我国白酒和黄酒的安全性指标研究起步较晚,特别是白酒和黄酒中氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)的研究,大部分研究更多关注检测方法的开发,针对可能超过限量的指标的消减技术研究较少,而从源头和过程控制角度进行消减的技术研究显得更为稀少。建议尽快制订相关标准和/或控制指南,加大基础性研究和控制技术研究力度,为我国白酒和黄酒品质安全研究提出建设性建议。本文重点回顾了近10年来我国传统饮料酒白酒、黄酒中氨基甲酸乙酯、氰化物、生物胺、真菌毒素和塑化剂等安全风险因子的研究现状,包括检测方法、产品现状、过程变化、产生机制或形成途径,以及消减技术,对现有饮料酒白酒和黄酒品质安全研究的问题与挑战进行了分析。     

一种氨基甲酸乙酯与尿素降解酶产生菌的鉴定及酶学特性

从小鼠消化系统中筛选到一株能产生氨基甲酸乙酯(EC,Urethane)降解酶的菌株,16S rDNA序列分析和生理生化鉴定确定为Providencia sp.。酶底物特异性研究表明,该酶对尿素和氨基甲酸乙酯都有相对强的降解作用,而对一些酯类和氨基酸没有降解作用,该酶对两种底物的最适作用pH值均为4.5左右,最适温度均为35℃。单因素实验优化了培养基配方,在最佳培养条件下,酸性EC降解酶酶活从0.32U/mL提高到0.63U/mL,酸性脲酶酶活从0.87U/mL提高到1.95U/mL。初步应用研究表明,该酶在黄酒的复杂体系中仍然能有效的降解尿素和EC,且对黄酒中的风味物质几乎无影响。     

氨基甲酸乙酯降解菌株的分离鉴定及其在白酒中的应用

氨基甲酸乙酯(EC)是发酵食品和酒精饮料在生产和贮藏过程中形成的有害代谢产物,具有遗传毒性和较强的致癌性。发酵食品中EC含量的控制是食品安全研究领域的重点议题。本研究以醋醅、酒糟为研究对象,以EC为唯一碳源,从醋醅、酒糟中分离具有EC降解能力的菌株,共获得48株EC降解菌株,经鉴定为14个种属,包括乙醇假丝酵母、大仁红酵母、戴尔福特菌、耐久肠球菌、芽胞杆菌、屎肠球菌等。将分离获得的纺缍形赖氨酸芽孢杆菌和乙醇假丝酵母包埋固定后,分别应用于白酒中EC的去除,结果表明,两个处理组白酒中EC浓度在12 h由230.37 μg/L降至78.12 μg/L(纺缍形赖氨酸芽孢杆菌)和86.97 μg/L(乙醇假丝酵母),EC降解率分别为66.09%和62.25%。本研究结果可为挖掘耐酸、耐乙醇的氨基甲酸乙酯降解菌株提供参考。     

脲酶基因挖掘及其在枯草芽孢杆菌中的重组表达

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，简称EC）是一种存在于黄酒中的潜在致癌物，酶法降解EC及其前体物质尿素因此备受关注。该研究通过基因挖掘获得了解淀粉芽孢杆菌IT-45的脲酶（Ba-urease）基因并在食品级系统枯草芽孢杆菌中实现了表达与应用。通过密码子优化、核糖体结合位点优化重构脲酶基因簇后，酶活力从6.85 U/mL提升至9.01 U/mL；通过调整基因ureC的位置，脲酶活力进一步提升至10.15 U/mL。研究发现，重组脲酶的最适反应温度为37 ℃；最适反应pH范围为6.5~7.0，为中性脲酶。摇瓶发酵的最佳培养条件为：TB培养基、接种体积分数5%、诱导温度28 ℃、Ni²⁺添加量4 mmol/L。在最佳发酵条件下，酶活力达到12.5 U/mL，在酶法降解黄酒中的尿素具有应用前景。     

氨基甲酸乙酯水解酶异源表达及酶学性质分析

将合成的来源于长孢洛德酵母菌（Lodderomyces elongisporus）属的氨基甲酸乙酯水解酶基因在大肠杆菌中实现异源表达,并进行纯化及其酶学性质研究。摇床培养后酶的比活力为4.52 U/mg,经过镍离子亲和层析柱纯化至显示单一条带后酶的比活力为9.86U/mg。酶学性质研究表明,氨基甲酸乙酯水解酶的最适反应温度为30℃;最适pH值为7.0;金属离子Mg2+对该水解酶的酶活有微弱的促进作用,而Cu2+以及Fe3+对酶的活性有强烈的抑制作用;对低含量的乙醇溶液与NaCl溶液有一定的耐受性;并且该水解酶可以对不同底物的酰胺类化合物进行有效降解,以氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate,EC）为底物进行反应时测得水解酶的动力学参数Km值为6.64 mmol/L,最大反应速率Vmax值为8.24 μmol/min。     

白酒固态发酵过程中不同品种高粱原料对氨基甲酸乙酯形成的影响

氨基甲酸乙酯(EC)是一种致癌物质,广泛存在于乙醇饮料中。为明确高粱原料对白酒固态发酵过程中EC形成的影响,从而为降低白酒中EC含量提供理论指导,通过模拟白酒固态发酵,分析了不同品种高粱原料发酵过程中EC及其前体物质的变化规律。结果表明,固态发酵过程中糯高粱S3对应的最终EC产量(4.27 mg/kg)高于粳高粱S1(4.06 mg/kg)和S2(4.21 mg/kg),且其EC平均形成速率是粳高粱S1(0.22 mg/kg/d)和S2(0.24 mg/kg/d)的1.6倍。对EC前体物质研究发现,瓜氨酸和尿素是高粱固态发酵过程中EC形成的主要前体物质,其中瓜氨酸可能对S1和S2发酵产EC的贡献较大,而尿素则对S3发酵产EC的贡献较大。此外,在整个固态发酵过程中,氰化物并未参与EC的形成。研究表明,不同品种高粱原料对固态发酵过程中产EC的影响差异显著,选择合适的高粱品种,控制高粱原料所带入的EC前体物质的含量,可有效控制白酒固态发酵过程中的EC含量。     

中国白酒氨基甲酸乙酯形成的代谢机制及控制技术研究进展

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate,EC）作为一种存在于蒸馏酒中的2A类致癌物质,成为影响饮酒人群健康安全的潜在因素之一。我国白酒固态发酵方式及独特的生产工艺,在一定程度上限制了现有EC控制措施的可使用性。本文从我国白酒发酵、蒸馏及贮存过程等方面概述EC的现有代谢机制、控制措施及其风险评估,这有利于我国白酒中EC限量标准的建立,为消费者和白酒生产企业提供参考,使我国白酒企业得以良性发展及保障白酒产品的质量安全。     

降解浓香型白酒中氨基甲酸乙酯菌株的筛选及产酶特性研究

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是一种可致癌物质,普遍存在于发酵食品中,研究如何降低发酵食品中EC的含量对提高发酵食品的安全性具有重要意义。该研究采用高通量筛选技术,从浓香型白酒酒醅中分离得到1株能够同时降低EC及其前体尿素的解淀粉芽孢杆菌JP21。将该菌株用于模拟白酒窖内发酵,发酵结束时酒醅中的尿素和EC分别减少了12%和17%,并且对酒醅中挥发性物质无显著影响。通过对该菌株所产EC和尿素降解酶进行初步纯化及酶学性质研究,发现该酶对尿素和EC均有降解作用。酶的最适反应p H值为5.5,最适反应温度为35℃,可耐受低浓度乙醇。研究采用发酵食品体系内源微生物干预的方法,实现了对混菌发酵体系中氨(胺)类危害物的有效减控。     

不同香型白酒中氨基甲酸乙酯的研究与风险评估

主要对不同香型白酒中的氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)含量进行分析,包括浓香、酱香、清香、兼香、芝麻香、药香、凤香、老白干香、豉香和特香型原酒和成品酒(n=342)。检测结果显示,白酒中EC检出率为100%。原酒中EC平均含量最高的为凤香型原酒(822.23μg/L);其次是特香型原酒(339.34μg/L);第三是浓香型原酒(298.21μg/L),药香型原酒中EC平均含量最低(80.32μg/L)。成品酒中EC平均含量最高的是芝麻香型白酒(214.13μg/L);其次是浓香型白酒(191.89μg/L);第三是凤香型白酒(168.24μg/L),清香型白酒中EC平均含量最低(46.23μg/L)。EC含量分布统计显示,所检测的成品酒中48.7%的样品中EC含量超过了加拿大、巴西、日本等国家谷物蒸馏酒的EC限量标准(150μg/L)。采用暴露边界比(Margin of Exposure,MOE)对成品白酒中EC进行风险评估,MOE值为6289,具有致癌风险。此研究期望为我国食品安全部门制定饮料酒中EC的限量标准提供有效的参考。     

白酒酿造过程酒醅中尿素的控制与减少

尿素是白酒酿造过程酒醅中含有的氨基甲酸乙酯的主要前体之一,对浓香型白酒中氨基甲酸乙酯含量影响较大,通过降低酒醅中尿素含量可以控制或减少白酒中氨基甲酸乙酯的含量。采用产脲酶菌株或其粗酶与酒醅混合,可在发酵过程中降低尿素含量。从大曲中筛选到3株产脲酶的腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus,S.saprophyticus)在酒醅固态发酵中去除尿素效果不显著,产酸性脲酶的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri,L.reuteri)全细胞及其粗酶对酒醅中尿素均有很好的去除效果。通过与商品脲酶比较,罗伊氏乳杆菌所产脲酶粗酶对酒醅中尿素去除效果更佳,尿素去除率可达100%。当罗伊氏乳杆菌添加量高于10~7CFU/g酒醅时,尿素去除率在97.3%以上,粗酶加入量高于25 U/kg酒醅时,尿素去除率在77.4%以上。罗伊氏乳杆菌能较好地去除白酒酒醅中尿素。     

湘产浓香型白酒酿造过程中氨基甲酸乙酯含量变化规律

目的:提高湘产浓香型白酒的安全性。方法:采用气相色谱—质谱联用仪分析浓香型白酒原粮、窖泥、酒糟、酒醅、基酒中的氨基甲酸乙酯(EC)含量。结果:各工艺阶段中,基酒中的氨基甲酸乙酯平均含量最高,酒头和酒尾EC含量显著性检验 P=0.041＜0.05,差异显著,且酒头的EC含量高于酒尾;中间段基酒EC含量与酒头、酒尾间显著性检验P值分别为0.516,0.071,不同层酒醅、基酒EC含量显著性检验 P值分别为0.770,0.980,不显著。基酒中的EC含量随贮藏时间的延长有不同程度的升高,绝对增长幅度为酒头＞中间段基酒＞酒尾。结论:湘产浓香型白酒酿造过程中,酒头的EC含量明显高于酒尾和中间段基酒,“掐头”有助于控制成品白酒中的EC含量。     

复合固定化酸性脲酶酶膜的制备及应用

用复合固定化方法将酸性脲酶固定在壳聚糖-明胶膜上,探讨了固定化的条件和性质、稳定剂对固定化酶膜的作用、固定化酶膜反应器在黄酒中的应用。结果表明:采用质量浓度为1.0%的壳聚糖和0.75%的明胶混合制备含0.579U/cm2酸性脲酶的酶膜,储存半衰期可达81d;在固定化酶膜中加入10%的甘油,在不影响成膜状态和强度的前提下,固定化酶活回收率由66.4%提高到82.25%,储存半衰期可达100d;将16cm2的酶膜采用间歇振荡法分批处理30mL黄酒12h,在尿素去除率仍达50%以上的前提下,可连续处理8批黄酒,较未加稳定剂的提高2个使用批次,酶膜的使用半衰期有明显提高;将约为500cm2的酶膜以卷式膜形式做成酶膜反应器,以0.5mL/min的流速连续处理2L黄酒时,70h后,尿素去除率仍可达50%,且基本未改变黄酒的风味,并最终达到降低氨基甲酸乙酯(EC)的目的。     

发酵食品中氨基甲酸乙酯的形成途径及消减策略研究进展

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate, EC)主要存在于发酵食品中，是一种具有遗传毒性和致癌性的化合物，长期摄入会显著增加各种癌症的发病率。研究表明，氨基甲酸乙酯形成途径主要是由相关前体物质在食品发酵或贮藏过程中反应生成；其前体物质主要有尿素、瓜氨酸、氨甲酰磷酸、焦碳酸二乙酯、氰化物等，这些主要的氨基甲酸乙酯前体物通常是由酿酒酵母或乳酸菌的精氨酸代谢伴随着发酵过程而产生的。由于氨基甲酸乙酯对人类身体健康的潜在威胁，减少发酵食品中的氨基甲酸乙酯显得尤为必要。本文针对发酵食品中氨基甲酸乙酯的形成途径，从物理法、化学法、酶法以及代谢过程法系统综述了发酵食品中氨基甲酸乙酯的消减策略，可为提高我国发酵食品的安全生产提供理论依据。     

浓香型白酒发酵过程中氨基甲酸乙酯形成的关联因子探究

浓香型白酒中氨基甲酸乙酯（EC）影响其安全性。该实验考察了浓香型白酒发酵过程中酒醅EC含量分别与环境因子及微生物的相关性。结果表明，EC含量随着发酵时间的延长呈上升趋势，主要发生在发酵的中后期；pH与EC含量呈负相关，系数为0.9，而水分则与EC含量呈正相关，相关系数为0.83，温度和乙醇含量对EC的形成有一定的促进作用，相关系数分别为0.48和0.71。此外，发酵体系中乳杆菌属（Lactobacillus）和和酿酒酵母属（Saccharomyces）与EC含量的相关系数为0.97和0.96，两者的丰度越高，EC越容易积累；芽孢杆菌属（Bacillus）则对EC的合成起到反作用，与EC含量的相关系数为0.78。因此可在浓香型白酒的发酵期间人为调控pH值、水分含量及上调芽孢杆菌属在发酵微生物中的比例，达到降低EC含量的目的。     

不同二次蒸馏方式对浓香型白酒中氨基甲酸乙酯去除率的影响

我国白酒通常采用甑桶一次蒸馏方式,不进行二次蒸馏。采用壶式蒸馏、常压蒸馏及减压蒸馏对浓香型原酒进行二次蒸馏,研究不同二次蒸馏方式对氨基甲酸乙酯(EC)去除率的影响。结果表明,采用适当的掐头去尾方法能够获得EC浓度较原酒低的二次蒸馏酒,EC大量存在于酒尾及残液中。壶式蒸馏时的EC相对去除率最高(92.76%),其次是减压蒸馏(89.55%)、常压蒸馏(81.46%)。慢火壶式蒸馏酒的EC浓度略低于快火,快、慢火壶式蒸馏对EC的去除无明显差异。二次蒸馏对不同EC浓度(233.33~1 162.94μg/L)的原酒均能达到较好的去除效果,EC相对去除率在89.91%~92.76%。壶式蒸馏过程中EC浓度随着酒精度的降低而呈现先下降后平稳再上升的趋势,二次蒸馏掐头去尾工艺能有效降低白酒中EC的含量。壶式蒸馏过程前期的EC主要来源于酒中本来存在的EC,而蒸馏过程后期的EC可能来自于氰化物等前体物质的转化。     

聚乙烯醇双酶降解工艺条件优化

作为纺织和造纸工业中的重要污染物,聚乙烯醇(PVA)的高效降解广受关注。为提高PVA的降解效率,本研究中对PVA脱氢酶(PVADH)和氧化型PVA水解酶(OPH)降解PVA的工艺条件进行了优化。通过Box-Behnken实验和响应面分析,确定PVA双酶降解的反应条件为:PVA 1 g/L,PVADH 123 U/mL,OPH 12 U/mL,pH 7.7,酶解温度41℃,Ca~(2+)浓度1 mmol/L,PQQ浓度6μmol/L。在该条件下PVADH和OPH共同催化4 h,PVA降解率达到95%以上。上述结果表明,PVADH和OPH双酶能有效降解PVA。研究结果将促进酶法降解PVA的工业化应用。     

氨基甲酸乙酯水解酶的分离纯化及酶学性质

氨基甲酸乙酯是发酵食品生产过程中的副产物,具有致癌性和遗传毒性,影响食品安全。酶法降解氨基甲酸乙酯是一种高效安全的去毒方法。从小鼠肠道筛选得到一株具有降解氨基甲酸乙酯活性的赖氨酸芽孢杆菌。通过对其细胞破碎上清液进行硫酸铵沉淀、离子交换层析、疏水层析和凝胶层析分离纯化,得到了氨基甲酸乙酯水解酶纯酶。SDS-PAGE电泳图显示,该酶亚基分子量约为50 k Da。该酶最适反应温度为35℃,最适p H值为7.0,在10~45℃时,具有良好的热稳定性。以氨基甲酸乙酯为底物反应,其Km和Kcat分别为37.2 mmol/L和1 176.4 s-1。金属离子显著抑制酶活力,而EDTA对酶活力无影响,表明此酶为非金属酶。此外,该酶对低浓度的Na Cl和乙醇有一定的耐受性,具有在酱油和黄酒中去除氨基甲酸乙酯的应用潜力。     

不同产区葡萄酒中氨基甲酸乙酯产量的比较

为研究怀来和房山产区葡萄酒中氨基甲酸乙酯(EC)产量的差异,选择ST和BO213两种酵母进行发酵试验,比较同种酵母在不同产区酿造的葡萄酒中EC产量的大小。同时,分析比较了添加酵母助剂不同用量(0、0.3、0.6 g/L)酿造的怀来产区"美乐"和"赤霞珠"葡萄酒中EC产量的差异。结果表明,房山产区用酵母ST和BO213酿造的葡萄酒中EC产量均比怀来产区高。在葡萄酒发酵过程中,添加同种酵母助剂在不同品种酿造的葡萄酒中EC产量不同,且"赤霞珠"葡萄酒中的EC产量高于"美乐"葡萄酒。葡萄酒发酵过程中EC质量浓度的测定结果范围为1.0～7.4μg/L,平均质量浓度为3.9μg/L,测定结果符合国际对葡萄酒中的EC限量标准。