食品中人星状病毒的定量检测方法

目的:应用一步法微滴数字PCR方法(RT-ddPCR),建立一种食品中人星状病毒(HAstV)定量检测方法。方法:筛选引物探针,建立HAstV RT-ddPCR方法;利用其它常见食源性病毒RNA,确定特异性;梯度稀释HAV RNA标准样品确定检测限、准确度和重复性。用已知效价的MS2噬菌体制备人工污染样品,研究RT-ddPCR方法在不同种类食品基质中的检测限和回收率,比较2种RNA提取方法的病毒检出量。结果:HAstV RT-ddPCR方法准确度、灵敏度和重复性良好,检测限105~100拷贝/μL,最低定量限5拷贝/μL;不同种类食品基质的检测限分别为7.2×106~3600拷贝(贝类消化腺),7.2×106~3600拷贝(硬表面食品),7.2×106~7200拷贝(生食蔬菜)、7.2×107~7200拷贝(软质水果);高浓度污染剂量时,Trizol裂解结合磁珠纯化方法病毒检出量显著低于Trizol裂解提取方法(P<0.05);不同种类食品基质中模拟病毒回收率存在显著差异(P<0.05)。结论:本研究建立的食品中HAstV定量检测方法可有效定量检测HAstV,可通过病毒回收率计算样品中HAstV的实际载量。     

含4 种食源性病毒检测靶标多联装甲RNA的制备、纯化与定值

基于Qβ噬菌体装甲RNA制备平台构建同时含有诺如病毒（norovirus,NoV）、甲肝病毒（hepatitis A virus,HAV）、轮状病毒（rotavirus,RV）、星状病毒（astrovirus,AstV）检测靶标RNA的多联装甲RNA（multiplex armored RNA,AR-MulV）,并进行纯化与初步定值。结果表明,重组质粒在大肠杆菌中成功表达,表达产物大小约为14.1 kDa;制备的AR-MulV经纯化后无杂蛋白与残留重组质粒,电镜下可见大量结构形态完整的病毒样颗粒,大小约为25 nm。初步定值结果显示,AR-MulV中GI型NoV、GII型NoV、HAV、RV和AstV检测靶标RNA的含量分别为（1.24±0.2）×107、（2.54±0.6）×107、（2.24±0.3）×107、（2.96±0.5）×107 copies/μL和（3.19±0.4）×107 copies/μL。本研究基于Qβ噬菌体装甲RNA制备平台成功制备同时包含4 种食源性病毒标准方法检测靶标的多联装甲RNA,为食源性病毒的分子检测以及多重实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应阳性质控样品的研发提供新思路。     

微滴式数字PCR检测冷冻草莓中GⅠ、GⅡ型诺如病毒

目的:建立一种检测冷冻草莓中诺如病毒(GⅠ和GⅡ)的逆转录微滴数字PCR (RT-ddPCR)方法。方法:根据ISO标准选定检测引物,优化反应体系,退火温度,进行了方法学实验,建立了一种快速检测冷冻草莓中GⅠ和GⅡ亚型诺如病毒的新方法。结果:确定了数字PCR检测GⅠ型诺如病毒退火温度为56.5℃,GⅡ型诺如病毒退火温度为58.1℃。RT-ddPCR检测GⅠ质粒标准品标准曲线的R2=0.9947,RT-ddPCR检测GⅡ质粒标准品标准曲线的R2=0.9950,说明该方法具有良好的线性关系。与RT-qPCR灵敏度对比,RT-ddPCR法的灵敏度比RT-qPCR法高一个数量级。在检测范围内,最低检测限低至个位拷贝数。RSD最小为3.8%,表明该实验重复性良好。浓度较低100 copies/μL左右时,RT-ddPCR的重复性不佳。结论:本研究建立的诺如病毒数字PCR法具有特异性强、灵敏度高、检测限低等优点,可用于冷冻草莓中诺如病毒的定量检测。     

RNA病毒检测质控物质-大肠杆菌噬菌体MS2标准样品的研制和应用

目的研制大肠杆菌噬菌体MS2标准样品,以其作为RNA病毒检测质控物质,建立RNA病毒检测全过程的质量控制体系。方法利用液体培养法制备大肠杆菌噬菌体MS2标准样品;采用双层琼脂法对标准样品进行稳定性、均匀性测定并定值;将标准样品添加于贝类样品中,应用于贝类诺如病毒实时荧光检测全过程质量控制。结果该标准样品稳定性与均匀性良好,定值为(1.57±0.0288)×10~(11) pfu/m L;保质期为12个月;在4种不同贝类样品中,病毒提取效率在3.70%~7.84%之间,符合国际标准ISO 15216:2-2013的病毒提取效率大于1%的要求。结论该研究制备的大肠杆菌噬菌体MS2标准样品可以对RNA病毒检测全过程进行良好的质量控制,具有良好的应用前景。     

酶联免疫法与液相色谱-串联质谱法检测猪肉中沙丁胺醇

运用酶联免疫法（ELISA）与液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对猪肉中沙丁胺醇残留进行测定,并比较了二者在灵敏度、准确性和重现性等方面的差异。结果显示,ELISA法和LC-MS/MS法在猪肉样品中的检测限可达到0.5 μg/kg和0.25 μg/kg,分别向猪肉样品中添加3个质量浓度水平（1.0 μg/kg、2.0 μg/kg、4.0 μg/kg）的沙丁胺醇时,回收率分别为83.7%～90.9%和86.6%～93.5%,变异系数（CV）分别为5.4%～10.3%和6.0%～8.3%。用酶联免疫法实际样品进行检测,筛选出2个阳性样品,经液相色谱-串联质谱法确证亦为阳性,测定结果一致。研究表明,酶联免疫法重复性较好、准确度较高,适用于进行猪肉样品中沙丁胺醇的快速筛选,液相色谱-串联质谱法适用于阳性样品的确证和精确定量。     

蓝莓中诺如病毒检测方法的优化及其在果蔬中的应用

目的:建立蓝莓等浆果类和蔬菜类食品中GII型诺如病毒(NoV GII)的有效检测方法。方法:利用已知NoV GII病毒样本对阴性的蓝莓进行人工染毒,分别比较7种洗脱液和2种浓缩方法的回收效果,优化RNA提取方法,最后采用荧光定量PCR方法进行检测。用新建立的诺如病毒浓缩检测方法,对7种市购浆果和蔬菜样品进行检测并研究其最低检出限。结果:实时荧光RT-PCR检测结果表明,人工染毒后的蓝莓等浆果样品(表皮和基质)采用TP ALK洗脱液洗脱,经酶处理后超滤法浓缩,最后采用病毒核酸提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)提取浓缩病毒的RNA,诺如病毒的回收效率达到较高的水平,其灵敏度达3.5～350 PCRU/10g。将该方法用于草莓、杨梅、葡萄、小番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜等7种水果蔬菜中诺如病毒的检测,其中杨梅和小番茄的检测灵敏度达到3.5～3 500 PCRU/10 g,草莓、生菜和胡萝卜次之,为35～35 000 PCRU/10 g,黄瓜和葡萄的灵敏度较低。结论:所建立的果蔬中诺如病毒富集方法和核酸提取方法操作简便,灵敏度较高,适合于蓝莓等浆果和蔬菜类样品中NoV GII的检测。     

磁分离结合qPCR快速检测酱卤肉中的沙门氏菌

验证噬菌体磁分离结合实时荧光定量聚合酶链式反应,快速检测方法对食品中沙门氏菌的检测效果。以一株鼠伤寒沙门氏菌的特异性噬菌体T102为分子识别元件,首先将其与羧基化磁珠偶联,制备获得噬菌体磁性颗粒（Phage T102 Magnetic Beads）复合物,利用噬菌体磁性颗粒复合物从食品中特异性分离富集沙门氏菌,然后利用实时荧光定量聚合酶链式反应检测富集后的沙门氏菌。该沙门氏菌快检方法检出限为100 CFU/mL（0.1 CFU/PCR）,线性范围为1×102~1×109 CFU/mL,变异系数2.1%,特异性强,检测时间为6 h。实验选取300批食品安全抽检样品与GB 4789.4-2016标准《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》进行比对,均未检出阳性样品,结果一致。该方法可为噬菌体偶联纳米磁珠在食源性致病菌检测领域的应用提供参考依据。     

食品中单核细胞增生李斯特菌微滴数字PCR定量检测方法建立

目的 建立食品中单核细胞增生李斯特氏菌的微滴式数字聚合酶链式反应（ddPCR）快速定量检测方法。方法 筛选单核细胞增生李斯特氏菌的特异性引物和探针,通过对目标菌纯菌液及人工污染样品的检测,比较ddPCR方法和平板计数法的定值效果,对ddPCR结果进行特异性、灵敏性和重复性分析。结果 本研究建立的单核细胞增生李斯特氏菌ddPCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。单核细胞增生李斯特氏菌纯菌液中定量限（LOQ）和检出限（LOD）均为136 CFU/mL,在鱿鱼圈和香肠样品中定量限分别为240 CFU/g和155 CFU/g。ddPCR在各梯度水平上变异系数均小于25%,ddPCR和平板计数定值对数值相对偏差均小于30%。结论 本研究建立的ddPCR方法能够快速、准确、灵敏、特异地定量检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌。     

微滴式数字聚合酶链式反应定量检测食品中金黄色葡萄球菌方法的研究

目的 建立微滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)快速定量检测食品中金黄色葡萄球菌的方法。方法 以金黄色葡萄球菌nuc基因为靶序列,筛选出同时适用于实时荧光定量PCR(qPCR)和微滴数字PCR(ddPCR)的引物探针,建立食品中金黄色葡萄球菌ddPCR快速定量检测方法,并对该方法进行特异性、灵敏度、准确性和重复性实验。结果 梯度稀释金黄色葡萄球菌纯培养液,确定ddPCR方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)均为110 CFU/mL;通过人工添加实验,同时进行ddPCR与平板计数检测,LOQ可达1 000 CFU/g,且4个添加水平的检测结果偏差最大为4.77%,5个平行重复的检测变异系数均小于20%,展现出良好的准确性和重复性。结论 本研究建立的金黄色葡萄球菌ddPCR定量检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确,为快速定量检测金黄色葡萄球菌提供了参考。     

副溶血性弧菌实时荧光定量PCR标准模板的构建和检测方法的建立

目的:构建肉制品副溶血性弧菌实时荧光定量PCR的标准阳性模板和检测方法.方法:以副溶血性弧菌toxR基因上特异性片段为目标,设计并合成引物及Taqman探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性.结果:构建出副溶血性弧菌荧光定量PCR检测方法的标准模板并建立了相应的检测方法,获得的标准曲线方程为:Y=-3.151 lgX+42.86,灵敏度40copies/反应体系,对副溶血性弧菌具有特异性,同时,该方法具有良好的重复性,变异系数小于5％.结论:使用基于Taqman探针技术的荧光定量PCR检测方法能够对食品中致病性副溶血性弧菌进行快速、简便、准确、高效的定量检测.     

非洲猪瘟病毒核酸荧光定量PCR检测方法研究

目的 建立非洲猪瘟病毒核酸的荧光定量PCR检测方法, 并与微滴式数字PCR检测方法的优缺点进行比较。方法 根据非洲猪瘟病毒保守基因VP72和K205设计合成引物和探针, 探究荧光定量PCR检测方法的反应条件和方法的特异性、线性、灵敏性和重复性, 及其与微滴式数字PCR检测方法灵敏度差异。结果 本研究建立的非洲猪瘟病毒核酸荧光定量PCR检测方法检出限达到0.1 fg/反应, 在0.1~500.0 fg/反应范围内呈现良好的线性关系, 检测重复性变异系数均低于1%, 不与猪瘟病毒、猪蓝耳病毒发生交叉反应。结论 本研究建立的荧光定量PCR法灵敏度高、特异性强, 适用于猪肉及其制品中非洲猪瘟病毒的检测。     

Evaluation of a norovirus detection methodology for ready-to-eat foods

Despite recent norovirus (NoV) foodborne outbreaks related to consumption of ready-to-eat (RTE) foods, a standardized assay to detect NoV in these foods is not available yet. Therefore, the robustness of a methodology for NoV detection in RTE foods was evaluated. The NoV detection methodology consisted of direct RNA extraction with an eventual concentration step, followed by RNA purification and a multiplex RT-qPCR assay for the detection of GI and GII NoV and the murine norovirus-1 (MNV-1), the latter used as process control. The direct RNA extraction method made use of the guanidine-isothiocyanate containing reagent (Tri-reagent?, Ambion) to extract viral RNA from the food sample (basic protocol called TriShort), followed by an eventual concentration step using organic solvents (extended protocol called TriConc). To evaluate the robustness of the NoV detection method, the influence of (1) the NoV inoculum level and (2) different food types on the recovery of NoV from RTE foods was investigated. Simultaneously, the effect of two RNA purification methods (manual RNeasy minikit (Qiagen) and automated NucliSens EasyMAG (BioMérieux)) on the recovery of NoV from these foods was examined. Finally, MNV-1 was evaluated as process control. First of all, high level GI and GII NoV inocula (~10? NoV genomic copies/10 g) could be recovered from penne salad samples (10 g) in at least 4 out of 6 PCRs, while low level GI and GII NoV inocula (~10? NoV genomic copies/10 g) could be recovered from this food product in maximally 3 out 6 PCRs, showing a significant influence of the NoV inoculum level on its recovery. Secondly, low level GI and GII NoV inocula (10? NoV genomic copies/10 g) were spiked onto 22 ready-to-eat food samples (10 g) classified in three categories (soups, deli sandwiches and composite meals). The GI and GII NoV inocula could be recovered from 20 of the 22 samples. The TriConc protocol provided better recoveries of GI and GII NoV for soups while the TriShort protocol yielded better results for the recovery of GII NoV from composite meals. NoV recovery from deli sandwiches was problematic using either protocol. Thirdly, the simultaneous comparison of two RNA purification protocols demonstrated that automated RNA purification performed equally or better compared to manual RNA extraction. Finally, MNV-1 was successfully evaluated as process control when detecting NoV in RTE foods using this detection methodology. In conclusion, the evaluated NoV detection method was capable of detecting NoV in RTE foods, although recoveries were influenced by the inoculum level and by the food type.     

荧光免疫定量法即时检测谷物中黄曲霉毒素B1

目的 基于时间分辨荧光免疫层析技术,研制快速定量检测试纸条,用于粮谷物中黄曲霉毒素B1的检测。方法 以荧光微球为标记物,采用DNP独立质控体系和竞争法检测原理,构建了粮谷物中黄曲霉毒素B1荧光免疫定量即时检测（point-of-care testing ,POCT）方法。评价其准确度、重复性、特异性、与仪器确证方法符合度。结果 该方法最适条件为：pH7.8硼酸盐（BB）活化,pH7.5磷酸盐（PB）偶联,微球抗体质量比为5:4,抗原抗体质量比为50:1。检测限在0.299 ng/g -0.997 ng/g之间,定量限在0.544 ng/g -2.663 ng/g。代表性样本准确度为92.2%-111%,重复性为3.2%-7.5%。除与黄曲霉毒素B2有交叉反应（6.1%）,与其他类似物无（<0.1%）。该法检测结果与仪器确证法一致性好,在-12.5%—15.9%之间。结论 提供了一种准确、快速、定量、灵敏、便捷、适合现场检测粮谷物中黄曲霉毒素B1的时间分辨荧光免疫检测试纸条。     

副溶血性弧菌微滴数字PCR定量方法的建立

目的:采用微滴式数字PCR技术(Droplet digital PCR,ddPCR),建立副溶血性弧菌快速定量检测。方法:以副溶血性弧菌TLH基因为靶基因,验证确定ddPCR方法的特异性及定量检测的线性范围,以常检出副溶血性弧菌的海产品鳕鱼为样品进行阳性添加,确定方法的可行性。结果:本试验中采用ddPCR检测得到副溶血性弧菌特异性好,有效基因组DNA浓度范围为2~19440拷贝/20μL,分析得菌悬液浓度为50~4.86×105 CFU/mL,与3M测试片所得菌悬液浓度无显著性差异(p>0.05),与荧光PCR相比,可以进行更低浓度检测且能准确定量。结论:副溶血性弧菌ddPCR定量检测技术特异性良好、灵敏度高、结果准确,具有实际应用价值。     

可视化微阵列蛋白芯片法同时检测蜂蜜中3种农药残留

目的建立可视化微阵列蛋白芯片法同时检测蜂蜜中多菌灵、啶虫脒、蝇毒磷3种农药残留含量的分析方法。方法依次向制备好的微孔板芯片里加入50μL标准品工作液和50μL相应的抗体,在25℃、600 r/min下反应30 min;再向每孔中加入50μL纳米银标记的羊抗鼠IgG, 37℃、600 r/min下反应30 min;最后显色并用芯片专用软件(MiELISA)进行自动化分析。结果该方法对多菌灵、啶虫脒、蝇毒磷的定量检测范围分别为0.4~6.4、0.3~4.8、0.75~12 ng/mL,相关系数r>0.99,检测限分别为3.21、2.47、2.52 ng/mL,准确度为83.6%~126.4%,变异系数均<10%,且三者之间具有极低的交叉反应;向不同种类的空白蜂蜜中添加2种不同浓度的标准品时,检测结果具有较高的准确度和重复性。结论本研究建立的可视化微阵列蛋白芯片检测法操作简便,检测限低,准确度、重复性、特异性均很好,且具有高通量、多指标同时检测等优点,适用于蜂蜜中多菌灵、啶虫脒、蝇毒磷3种农药残留同时检测。