河豚毒素人工抗原的制备及其免疫原性鉴定

目的:选择血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)分别作为载体蛋白与河豚毒素(TTX)进行偶联制备人工抗原,并对合成结果进行鉴定。方法:通过甲醛法将TTX分别与大分子载体蛋白,即血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)进行偶联。利用紫外扫描法、电泳法对偶联产物进行鉴定,并对6周龄Balb/c雌性小鼠免疫注射检测其免疫原性。结果:紫外扫描显示偶联抗原较载体蛋白有轻微的红移现象出现,且经过琼脂糖凝胶及SDS-PAGE 2种方法电泳检测后发现,载体蛋白较人工抗原之间迁移率均不相同;对免疫小鼠进行间接酶联免疫吸附试验(iELISA)及间接竞争酶联免疫吸附试验(icELISA)联用检测其多抗血清效价及特异性,经过共计6次免疫后的效价能达到1:40w,且能有效抑制TTX。结论:河豚毒素人工抗原制备成功且具备良好的免疫原性。     

赭曲霉毒素A人工抗原的合成与鉴定

采用N-羟琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide NHS)法将赭曲霉毒素A(OTA)与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备了免疫抗原OTA-BSA,采用1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)法将赭曲霉毒素A(OTA)与卵清白蛋白(OVA)偶联制备了包被抗原OTA-OVA。紫外扫描和SDS-PAGE凝胶电泳结果初步表明偶联成功。用OTA-BSA分10μg/只和50μg/只两个剂量分别免疫BALB/C小鼠,获得了高效价的特异性多克隆抗血清,效价可达1∶104,抑制效价达14.7ng,证明偶联成功,并显示低剂量免疫可以提高小鼠pAb的敏感性。本研究为OTA单抗的制备及其免疫学分析方法的建立奠定了基础。     

磺胺喹恶啉人工抗原合成及鉴定

国内首次用重氮化法将磺胺喹恶啉(SQ)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原SQ-BSA和包被抗原SQ-OVA.紫外扫描法与SDS-PAGE凝胶电泳法鉴定表明偶联成功,偶联比分别为10.1∶1、9.8∶1.将SQ-BSA免疫BALB/C小鼠,获得了高效价、敏感性好的抗SQ血清,表明ELISA方法鉴定偶联成功,为进一步制备抗SQ单抗奠定了基础.     

石房蛤毒素免疫亲和柱制备及柱效测试研究

目的阐明石房蛤毒素(saxitoxin, STX)免疫亲和柱对11种麻痹性贝类毒素的亲和作用。方法通过纯化的STX单克隆抗体与琼脂糖凝胶(sepharose 4B)制备STX免疫亲和柱,采用11种麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)标液进行过柱实验,优化上柱条件,采用液相色谱-质谱串联法进行毒素检测。结果STX免疫亲和柱对新石房蛤毒素(neosaxitoxin,neo-STX)、脱氨甲酰基新石房蛤毒素(decarbamoylneosaxitoxin dihydrochloride,dcneo-STX)、膝沟藻毒素1(gonyautoxin-1,GTX1)、膝沟藻毒素4(gonyautoxin-4, GTX4)基本没有亲和力作用;而对7种PSP的亲和力强弱顺序为:STXN-磺酰氨甲酰基类毒素5(gonyautoxin-5, GTX5)脱氨甲酰基石房蛤毒素(decarbamoylsaxitoxin dihydrochloride, dcSTX)膝沟藻毒素3(gonyautoxin-3,GTX3)脱氨甲酰基膝沟藻毒素3(decarbamoylgonyautoxin-3,dcGTX3)脱氨甲酰基膝沟藻毒素2(decarbamoylgonyautoxin-2, dcGTX2)膝沟藻毒素2(gonyautoxin-2, GTX2),其中对STX、GTX5、dcSTX、GTX3的回收率为61.2%～99.0%。结论该STX免疫亲和柱对STX、GTX5、dcSTX、GTX3有较好的吸附效果,能够满足样品检测前处理的要求,为水产品中麻痹性贝类毒素的提取方法研究提供了新技术的参考依据。     

土霉素完全抗原的制备与鉴定

为了建立土霉素完全抗原的制备方法,实验以土霉素为半抗原,牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白,利用N,N,-二环己基碳化二亚胺(DCC)、邻联甲苯胺(o-tolidine)为偶联剂,将牛血清白蛋白与土霉素偶联制备土霉素人工完全抗原。通过偶联率的计算确定邻联甲苯胺为最佳偶联剂。随后利用红外光谱分析和免疫原性测定实验鉴定了土霉素、牛血清白蛋白和邻联甲苯胺的偶联情况。结果表明,制得的土霉素完全抗原在免疫健康的Balb/c小鼠体内能刺激小鼠机体产生最高效价为25600(ELISA)的抗血清。     

特布他林人工抗原的制备

特布他林(Terbutaline,TBL)又名特布特罗,属于小分子化合物,其分子量为225.29,本身不具有免疫原性,需要和载体蛋白偶联后方可进行抗体的制备。本试验以1,4-丁二醇二缩水甘油醚将半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联,并运用碳二亚胺法将半抗原与卵清白蛋白(OVA)进行偶联,分别制备出免疫抗原TBL-cBSA与包被抗原TBL-cOVA。紫外分光光度法及SDS-PAGE进行鉴定。经紫外扫描,证明其偶联比分别为7.60∶1、7.65∶1,此特布他林完全抗原可以免疫动物,本研究成果为特布他林抗体的制备奠定了坚实基础。     

2,4-二氯苯氧乙酸人工抗原合成及鼠源多克隆抗血清的制备

采用碳化二亚胺法(EDC法)将2,4-D与牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联,合成免疫原2,4-D-BSA和包被原2,4-D-OVA,采用紫外扫描(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法进行鉴定;用2,4-D人工免疫抗原(2,4-D-BSA)免疫BALB/c纯系小鼠,采用间接ELISA测定多抗血清效价、阻断ELISA鉴定其抑制。结果表明:BSA与2,4-D偶联后,波峰出现右移,表明偶联成功;SDS-PAGE电泳中BSA的泳动速度大于2,4-D-BSA,表明2,4-D已与BSA成功偶联;6只小鼠血清效价均达到了1:1.28×104,且1号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制IC50为72.48ng/mL,表明成功获得了高效价、特异性好、亲和力较高的鼠源抗2,4-D多克隆抗体血清,为2,4-D残留免疫学检测方法的建立奠定了良好的基础。     

重金属铅多克隆抗体的制备及鉴定

目的：合成铅离子完全抗原,并对其进行鉴定;用合成的完全抗原免疫Balb/c 小鼠制备多克隆抗体,鉴定效价和特异性。方法：用双功能螯合剂p-SCN-Bn-DTPA 将Pb2+ 与载体蛋白BSA 和OVA 偶联在一起,合成免疫抗原(Pb-DTPA-BSA)和检测抗原(Pb-DTPA-OVA),并通过SDS-PAGE、紫外扫描、电感耦合等离子体(ICP) 检测抗原中Pb2+ 含量,以及通过免疫Balb/c 小鼠,采集血清进行间接ELISA 和竞争ELISA 检测。结果：两种合成的抗原相对于各自的载体蛋白均出现了蛋白条带滞后,紫外吸收峰偏移等现象;免疫的4 号和5 号Balb/c 小鼠的抗血清效价达1:400000;与OVA 无交叉反应,ELISA 检测IC50 值为1.5ng/mL,与Fe3+ 有近5% 的交叉反应,与其他重金属离子的交叉反应均小于1%。结论：铅离子多克隆抗体制备成功。     

新霉素酶联免疫检测方法的研究——新霉素抗体的制备

以碳化二亚胺作为偶联剂,分别将新霉素(Neomycin,NEO)和牛血清白蛋白(Bovine serum albu-min,BSA)、血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)进行偶联,得到偶联产物BSA-NEO和KLH-NEO。对BSA、KLH、NEO及其偶联产物BSA-NEO、KLH-NEO进行红外光谱分析,结果显示偶联产物的红外光谱中同时存在载体蛋白和NEO的特征吸收峰,初步证明偶联成功;将偶联产物BSA-NEO和KLH-NEO作为新霉素免疫抗原,分别免疫新西兰大白兔,成功获取新霉素抗血清,间接ELISA法测得抗血清效价可达1.28×105以上。     

甲基苯丙胺与蛋白偶联物的合成

研究合成甲基苯丙胺抗原.在甲基苯丙胺分子上引入偶联官能团,以牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白,用戊二醛法偶联合成了甲基苯丙胺抗原,并用红外光谱、紫外扫描、蛋白电泳以及胶体金免疫层析等方法进行检测.结果表明,每分子BSA连接甲基苯丙胺分子数为25;胶体金免疫层析检测结果显示合成抗原与抗体有特异性反应,具有活性.可在免疫检测中用作抗原的甲基苯丙胺与蛋白偶联物.     

环丙氨嗪完全抗原的合成及免疫原性鉴定

目的合成并鉴定环丙氨嗪(cyromazine,CA)人工抗原。方法采用碳二亚胺法(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)将环丙氨嗪与牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)和鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)分别偶联;采用紫外分光光度法(ultraviolet spectrophotometry,UV)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和动物免疫对人工抗原进行鉴定。经过4次免疫,间接ELISA测定小鼠血清抗体效价,间接竞争ELISA测定血清灵敏性。结果 UV法和SDS-PAGE法结果初步显示半抗原环丙氨嗪和载体蛋白偶联成功;小鼠血清效价均在1:6400以上,2号小鼠多抗血清半数抑制浓度IC_(50)为27.5 ng/mL。结论本研究成功合成了环丙氨嗪的人工抗原,为环丙氨嗪单克隆抗体制备奠定基础。     

莱克多巴胺和土霉素人工抗原的合成及鉴定

研究莱克多巴胺和土霉素免疫抗原的制备。实验中用碳二亚胺法将莱克多巴胺(ractopamine,RAC)与载体蛋白牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)偶联,制备完全抗原;采用混合酸酐法将土霉素(oxytetracycline,OTC)与载体蛋白BSA偶联,制备完全抗原,并对合成产物进行表征。紫外扫描对合成产物RAC-BSA、OTC-BSA进行鉴定结果显示偶联成功,经重氮化后利用混合酸酐法制备完全抗原的偶联比为5:1;经衍生后利用碳二亚胺法制备RAC完全抗原偶联比为7:1。利用制备的免疫原免疫兔子可以获得相应的抗体。     

伏马菌素B1人工抗原的制备及其鉴定

本试验采用戊二醛一步法将小分子半抗原(伏马菌素B1,FB1)与载体蛋白OVA进行偶联,制备人工抗原FB1-OVA。分别采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)、紫外扫描法(UV)、质谱法(MS)和免疫芯片法来检测FB1与OVA的偶联效果。结果证明,成功得到了人工抗原FB1-OVA,而且通过质谱法检测得出FB1-OVA和OVA的分子量分别是51928.612和44265.718,分析其偶联比为10.6:1。     

黄曲霉毒素B1人工抗原及鼠源多克隆抗血清的制备

目的:研究合成并鉴定了黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源AFB1多克隆抗血清。方法:采用N-羟琥珀酰亚胺酯(N-hydroxy-succinimide NHS)法将AFB1分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成免疫抗原AFB1-BSA和包被抗原AFB1-OVA,采用紫外分光光度法和SDS-PAGE进行鉴定,通过动物免疫实验获得鼠源多抗血清,并使用间接ELISA和阻断ELISA的方法对多抗血清进行了鉴定。结果:结果表明半抗原AFB1分别和载体蛋白BSA及OVA偶联成功;免疫的6只小鼠效价均达1×10-4以上,3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50(50% inhibitive concentration,IC50)为8.199ng/mL。结论:实验成功合成了AFB1人工抗原,并生产了高效价、高敏感性的鼠源多克隆抗体血清,为AFB1单克隆抗体制备及其快速检测试剂的研制奠定了坚实的基础。     

黄曲霉毒素G1人工抗原的合成

以间氯过氧苯甲酸(m-chloroperbenzoie acid,MCPBA)为氧化剂,使黄曲霉毒素G1(Aflatoxin G1,AFG1)转化为其8,9.环氧化物,与牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)在两相反应体系中实现偶联,得到复合物AFG1-BSA.复合物紫外扫描结果显示其扫描图谱与BSA和黄曲霉毒素G1的图谱有明显差异,同时复合物与BSA荧光强度的差异,这表明BSA与黄曲霉毒素G1偶联.AFG1-BSA中AFGl与BSA的摩尔比为4.29:1.以合成人工抗原免疫小鼠,制备了特异性的鼠抗AFG1多克隆抗血清.用间接ELISA法测得抗体血清的最高效价可达1:16000,并测定了抗体的敏感度以及特异性.     

玉米赤霉烯酮多克隆抗体的制备及特性分析

合成玉米赤霉烯酮半抗原,应用液相色谱-质谱联用法进行鉴定,并采用活泼酯法将半抗原与载体蛋白OVA或BSA偶联,分别作为免疫原或包被原,并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和紫外扫描法鉴定偶联效果,免疫3只BALB/c小鼠,制备玉米赤霉烯酮多克隆抗体。结果表明:抗血清效价最高达1∶32 000,以此多抗建立的玉米赤霉烯酮间接竞争标准曲线IC50为39.8ng/mL,IC10为0.71ng/mL,多抗与玉米赤霉烯酮类似物β-zearalenol、zear-alanone、α-zearalanol、β-zearalanol交叉反应率分别为4.80%,3.07%,0.96%,0.09%。说明试验成功制备了玉米赤霉烯酮人工抗原及高特异性多克隆抗体。     

盐酸克伦特罗完全抗原的制备及其鉴定

利用重氮化法将小分子半抗原盐酸克伦特罗(CL)偶联到牛血清白蛋白(BSA)上制得盐酸克伦特罗完全抗原(CL-BSA).采用紫外分光光度法快速确定了BSA∶CL偶联比为1∶17,并通过SDS-PAGE法验证了CL与BSA偶联;间接ELISA法检测免疫Balh/c小鼠血清.结果显示1∶1000稀释后的血清在中和掉BSA的抗体后呈阳性;最后,通过细胞融合获得了一株能稳定分泌CL-McAb的细胞株4H5,经鉴定为IgG1.说明合成偶联比为1∶17的完全抗原能刺激小鼠产生针对盐酸克伦特罗的单克隆抗体.     

两种司帕沙星完全抗原的合成鉴定及免疫效果研究

目的:用两种方法合成司帕沙星人工抗原,并制备相应的鼠源多克隆抗体。方法:用混合酸酐法和DCC法将半抗原SPFX与BSA偶联制备免疫原SPFX-BSA,通过DCC法制备人工包被原SPFX-OVA,采用紫外光扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定与分析。免疫小鼠后,采用间接ELISA法测定多抗血清效价,阻断ELISA,鉴定其抑制价和特异性。结果:UV和SDS-PAGE鉴定结果初步表明SPFX人工抗原成功合成;动物试验表明,4只小鼠多抗血清效价均在3.2×104以上,其中1号小鼠IC50值为163.87 ng/mL,与其他竞争物无明显交叉反应,抗体特异性良好。结论:两种偶联方法均能成功合成人工抗原,制备出鼠源抗SPFX多克隆抗体,其中混合酸酐法能明显提高完全抗原的合成和免疫效果。     

重金属铅酶联免疫检测方法的研究

制备铅离子多克隆抗体,并建立间接竞争ELISA检测方法。利用双功能螯合剂ITCBE将Pb2+与载体蛋白KLH和BSA偶联在一起,制备免疫抗原与检测抗原;通过免疫新西兰大耳白免成功制备铅多克隆抗体,建立间接竞争ELISA检测方法,并与ICP-MS检测结果进行比较。标准曲线IC50为3.48ng/mL,IC15为0.32ng/mL,与ICP-MS法检测结果的总符合率超过97%。     

伏马菌素B2人工抗原的制备研究

为制备伏马菌素B2人工抗原,通过戊二醛法和碳二亚胺法将伏马菌素B2偶联到栽体蛋白上,人工抗原免疫BALB/c小鼠后,酶联免疫吸附法测定抗血清的效价,竞争酶联免疫吸附法测定人工抗原的免疫原性.通过氨基化和羧基化的苏丹红作为内参,紫外可见光谱扫描图谱鉴定伏马菌素B2成功偶联到载体蛋白上,免疫原性鉴定证明,碳二亚胺法制备的人工抗原可刺激BALB/c小鼠产生抗伏马菌素B2的抗体.