重组蔗糖异构酶在短短芽孢杆菌中的表达及发酵优化

对重组菌株Brevibacillus choshinensis/pNCMO2-SI摇瓶发酵产蔗糖异构酶进行研究,进一步探讨了3 L发酵罐不同发酵条件对菌体生长及产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵后胞外酶活为50 U/mL,最优3 L发酵罐培养条件为:初始碳源为葡萄糖质量浓度10 g/L,初始氮源为多聚蛋白胨、牛肉浸膏质量浓度各15 g/L,发酵温度30℃,溶氧30%,在此条件下得到的最高酶活为275 U/mL。为了探索启动子对蔗糖异构酶表达的影响,分别选取来源于枯草芽孢杆菌的启动子Papr-E,Pnpr-E,Pamy以及来源于巨大芽孢杆菌的启动子Pxyl进行研究。结果表明,使用启动子Papr-E的表达量最高。进一步优化摇瓶发酵条件,重组菌株BCpNapr-SI摇瓶发酵的胞外上清酶活为137 U/mL,在此条件下进行3 L发酵罐发酵,最终发酵上清胞外酶活为485.5 U/mL,是未优化启动子的1.76倍。     

工业生产中耐高温α-淀粉酶发酵培养基的优化研究

通过对一株高产耐高温α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌摇瓶发酵工艺的优化,以及在摇瓶和20 L发酵罐上进行的耐高温α-淀粉酶液态发酵工艺条件的试验研究,确定发酵培养基所采用的最佳氮源为豆饼水解液,最佳碳源为玉米粉液化液.正交试验结果表明:优化摇瓶发酵培养基配方为玉米液化液12.5%,豆饼粉5%,豆饼水解液2.5%,(NH4)2SO40.5%,摇瓶产酶活可达5 000 U/mL,比优化前提高了10%,20 L发酵罐产酶活达到了12 000 U/mL.     

重组蔗糖异构酶的制备及应用条件优化

对重组菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-24a-pal I摇瓶发酵产酶进行研究,探讨了3 L发酵罐中不同乳糖诱导浓度对菌体高密度发酵产酶的影响。结果表明,摇瓶发酵得到胞外上清酶活253.1 U/m L,3 L发酵罐高密度发酵时,在0.4 g/(L·h)乳糖诱导浓度下,发酵上清酶活可达到最大值654 U/m L。对重组蔗糖异构酶转化蔗糖生成异麦芽酮糖的酶转化条件进行了优化,结果表明,当底物浓度为400 g/L,反应初始p H 6.5,温度30℃,加酶量20 U/g蔗糖,转化时间8 h,异麦芽酮糖可以达到最大转化率87.9%。     

高分子量腈水合酶工程菌生产烟酰胺的工艺建立

为提高表达玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous J1)来源的高分子量腈水合酶大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-24a(+)-nhh Brbs Arbs G(BAG)的菌体酶活,建立了合适的烟腈全细胞催化工艺以及重组工程菌的高密度发酵工艺。采用正交试验L_9(3~4)对摇瓶培养基中各组分进行优化,比较烟腈底物流加和底物分批补料工艺,对重组菌进行分批补料高密度发酵培养。培养基优化后其菌体生物量提高到4.42 gDCW/L,细胞比酶活提高到30.91 U/mgDCW;与烟腈底物流加相比,烟腈分批补料工艺更适合烟酰胺的生产,通过此工艺的反应,摇瓶发酵后的BAG能够生产390 g/L烟酰胺;对BAG进行5 L发酵罐分批补料扩大培养,菌体生物量最高达到73.97 gDCW/L(OD600=200),细胞比酶活最高为42.70 U/mgDCW,单位发酵液酶活最高为2 813 U/mL,用较高密度的发酵罐培养后重组菌进行烟腈催化反应,产物质量浓度能达到537 g/L,是已报道的大肠杆菌重组表达腈水合酶产烟酰胺所得终质量浓度的最高水平。     

以豆粕粉为氮源的枯草芽孢杆菌液态发酵生产纳豆激酶

枯草芽孢杆菌液态发酵通常采用蛋白胨作为氮源生产纳豆激酶,导致生产成本过高,发酵液中酶活性较低。采用价格低廉的豆粕粉作为氮源不仅大幅度降低了原料成本,而且显著提高了发酵液中的酶活性。在摇瓶实验中优化确定豆粕粉最佳添加量,并在此基础上优化确定了最佳接种量、发酵液初始p H、发酵时间。最终摇瓶发酵液中酶活达到5 471 IU/m L,是等量胰蛋白胨作为氮源发酵的3.6倍。上述摇瓶发酵参数进一步在7 L发酵罐和200 L中试水平发酵罐进行验证,并优化确定发酵过程中控制溶氧水平为30%,纳豆激酶活性分别达到6 717 IU/m L和4 236 IU/m L。     

产碱性蛋白酶的嗜热菌株筛选及发酵条件研究

在河南商丘盐碱地堆肥土壤样中分离到1株产碱性蛋白酶的嗜热菌株SR-15,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。摇瓶发酵研究表明,其适宜培养条件为:玉米粉40g/L,黄豆粉40g/L,MgSO40.5g/L,NaCl10g/L,K2HPO41.0g/L,起始pH10.0,培养温度45℃,摇瓶转速190r/min,250mL三角瓶的装液量100mL,48h后发酵液酶活为1180U/mL。     

嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶在大肠杆菌中的表达及发酵优化

为了在3L发酵罐水平上提高重组菌E.coli BL 21(DE3)/pET20b(+)-BapulA的普鲁兰酶的表达量和胞外分泌,将嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶(Bacillus acidopullulyticus)在大肠杆菌中进行重组表达,并在3L发酵罐水平上对重组菌进行发酵优化,考察了发酵条件对重组酶表达的影响。重组菌发酵的最佳条件为:发酵前期菌体生长温度和pH分别为30℃和7.0,当菌体浓度OD_(600)达到50时,发酵温度降低至25℃,此时调节pH为6.2,同时开始流加乳糖[0.4g/(L·h)]进行诱导;在发酵过程中,当菌体浓度OD_(600)依次达到15,45,75时,分别加入浓度为1.5g/L的甘氨酸,当菌体OD600为105时,再加入浓度为3g/L的甘氨酸。发酵结束后普鲁兰酶的胞外酶活达659.0U/mL,最高总酶活达1 910.1U/mL,与摇瓶的初始总酶活(41.1U/mL)和胞外酶活(6.5U/mL)相比,分别提高了45.4倍和100倍。     

ARTP诱变选育中温α-淀粉酶高产菌株及其发酵条件优化

利用常压室温等离子体(ARTP)技术,对产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株进行诱变处理,通过平板、深孔板初筛及摇瓶复筛共筛选出3株酶活明显提高的菌株,其中产酶活力最高的突变株BS-12,摇瓶酶活达到了801 U/m L,较出发菌株提高了32.2%。通过单因素试验,得到的最佳发酵条件为接种量6%,温度36℃,发酵时间68 h。在此条件下,摇瓶酶活力达到1 395 U/m L,经30 L发酵罐放大,酶活达到了1 553 U/m L。     

重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a（＋）-bgl诱导表达β-葡聚糖酶的条件优化

研究自行构建的产β-葡聚糖酶的工程菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl在LB培养基中的生长特性,考察种子液的菌龄、培养基起始pH、接种量及诱导起始时发酵液菌浓度等对β-葡聚糖酶产生水平的影响;通过正交试验确定诱导剂IPTG及乳糖添加量、诱导温度及诱导剂作用时间.结果表明:培养基起始pH 7.0,对数生长中期的种子液(OD600为0.35)以接种量(体积分数)10%接入摇瓶发酵培养,37 ℃,200 r/min培养约3 h,菌液OD值达到1.0左右,添加终浓度分别为0.033 6 mmol/L的IPTG及10 mmol/L乳糖,24℃诱导6 h,发酵液清液中酶活达到最高(336.33 U/mL),菌体生长量为1.12 g/L,发酵液中总酶活达到459.32 U/mL,是原始菌株在相同条件下所产酶活的6.62倍.采用优化培养条件及诱导剂作用条件,重组菌在TB培养基中酶活水平进一步提高,诱导剂作用10 h,发酵清液中酶活为1 090.31 U/mL,总酶活1 570.83 U/mL,是原始菌在该条件下酶活的19.73倍,显示出重组菌具有广阔的工业化应用前景.     

非特异性过氧合酶发酵优化及在H2O2检测中的应用

非特异性过氧合酶（unspecific peroxygenase，UPO）能够利用过氧化氢（H2O2）催化多种氧化反应，在工业中具有很大的应用潜力。针对AaeUPO 在毕赤酵母中表达量低以及发酵工艺不清的问题，通过摇瓶发酵优化以及正交试验确定发酵培养基条件，并进一步通过5 L 发酵罐进行放大。结果表明，毕赤酵母摇瓶水平高效表达AaeUPO 的基本发酵条件：甲醇浓度1.00%、培养基初始pH5.5、蛋白胨浓度1.5%、酵母粉浓度1.5%，最优发酵条件下粗酶液酶活达到18.2 U/mL。在摇瓶水平发酵试验的基础上进行5 L 发酵罐放大试验，优化后以接种量10%、诱导温度30 ℃、流加甲醇作为最终工艺条件。最终得到的细胞湿重244 g/L，最高酶活为25.1 U/mL，相较于初期未优化酶活提升了91.6%。将AaeUPO 用于H2O2 检测，AaeUPO 对于H2O2 具有较好的检测性能，检测限达到5 μmol/L，抗干扰性能强。     

红曲色素发酵分批补料工艺研究

为了提高红曲菌（Monascus purpureus）FM-4000的红色素色价,采用优化种龄和接种量的方法,探索了分批补料发酵基质对红色素色价的影响。结果表明,最佳种龄为6 h二级种子液,接种量10%（V/V）,在发酵48 h时补加20 g/L黄豆粉,在发酵84 h时补加0.5 mol/L氨水,在发酵96 h时补加60 g/L米粉。在此工艺条件下,摇瓶发酵红曲菌FM-4000的红色素色价达到135.61 U/mL,相对初始摇瓶红曲菌FM-4000的红色素色价提高了37.25%;在5 L发酵罐中对红曲菌FM-4000进行分批补料发酵培养,红色素色价可达145 U/mL。     

红曲色素高产菌株的优选及其发酵条件优化

对实验室保藏的红曲霉菌株进行了优选,获得了产量较高的红曲色素生产菌株Monascus purpureus M5,其液态发酵的红色素产量达到了154.5U/mL.对M5发酵产色素的碳源、氮源、初始pH值等进行了优化,以70g/L大米粉、30g/L可溶性淀粉、10g/L黄豆粉、1g/L NaNO₃为发酵培养基,初始pH值4.0,35℃条件下培养6d,M5摇瓶发酵红色素的产量达到195.8U/mL.在5L发酵罐中对M5进行葡萄糖补料分批发酵培养,其色素产量在108h时达到最大值253.2U/mL,相比摇瓶分批发酵提高了29.3％,成效显著.     

枯草芽孢杆菌JSIM-X-13-4突变株腺苷发酵研究

对1株黄嘌呤、硫胺素、组氨酸三重缺陷型及8-氮杂鸟嘌呤抗性的腺苷突变株JSIM-X-13-4进行了摇瓶、自控罐3、000 L中型发酵罐试验。试验发现,该菌株培养基成分除酵母膏外,其余与其亲株肌苷产生菌JSIM-1019基本相同。酵母膏浓度为1.6%-1.8%,摇瓶CaCO3量为3%;发酵罐上适宜pH为6.2,风量在18h提高至1∶0.55,溶氧40%。摇瓶、自控罐、中型发酵罐产苷分别为15.51 g/L、18.11 g/L和17.25 g/L。     

Spinigerin α抗菌肽中试化发酵条件的研究

在已获得Spinigerin α抗菌肽摇瓶发酵条件的基础上,对其在50 L发酵罐中的初始甘油质量浓度、补料方式、甲醇与山梨醇混合比例、诱导温度、诱导pH值和诱导时间进行优化,并对诱导阶段甲醇与山梨醇混合体积比、诱导温度和诱导pH值进行正交试验。结果表明：甘油初始质量浓度10 g/L、补料方式为变速补料、甲醇与山梨醇混合体积比1∶1、诱导时间96 h、诱导温度24 ℃、诱导pH 5.0。在此最佳发酵条件下,50 L发酵罐的Spinigerin α抗菌肽产量较摇瓶条件提高20%。     

酸奶菌株分批发酵放大研究-从2.5L 到15L 发酵罐

2.5L发酵罐实验数据基础上,利用经验放大法将德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS 1.9201和唾液链球菌嗜热亚种KLDS 3.021 分批发酵结果从小试放大中试。结果表明,如果确定若干优化发酵参数,包括搅拌转速50～100r/min和溶氧浓度不高于5% 等,可将酸奶菌株发酵结果较成功地从2.5L 罐放大到15L 罐规模。KLDS 1.9201 在15L 罐中对数生长期间的初糖转化率达到了80.3%,乳酸浓度为49g/L,确定其发酵终点为12h,此时活菌数为2.2 × 109CFU/ml;KLDS 3.0201 在15L 罐中的初糖转化率达到了80.2%,乳酸浓度为39g/L,确定其最佳收获期为发酵8h,活菌数达到4.9 × 109CFU/ml。     

甘露聚糖酶产生菌F1-5的鉴定及发酵条件研究

本研究从实验室保藏高效分泌能降解异甘露聚糖的甘露聚糖酶的细菌F1-5 出发,采用菌株的个体和群体的形态观察、生理生化实验及16S rDNA 系统发育分析手段进行鉴定,最终确定菌株F1-5 为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。Genbank 注册号为FJ392725。通过单因素试验和正交优化试验,确定枯草芽孢杆菌F1-5 的最佳发酵产酶条件。酵母细胞壁碳源浓度为4.8%,氮源浓度为0.5%,培养基初始pH6.0,接种量为6%,装液量为60ml/250ml三角瓶,转速为180r/min,培养温度为35℃,在此发酵条件下发酵48h,枯草芽孢杆菌F1-5 产生的甘露聚糖酶活力达330U/ml,是优化前的3.4 倍。发酵罐扩大实验,甘露聚糖酶活力可达582U/ml。     

海洋源纤溶酶高产菌株的诱变育种及液体培养基优化

为获得纤溶酶高产菌株及其最优发酵条件,以海洋环境来源的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H-A-03为出发菌株,经过60Co辐射诱变获得了一株遗传稳定性好的纤溶酶高产菌株F8-C,其酶活力较出发菌株提高28.78%。采用统计学优化方法获得了组分更简单、用量更少、更利于菌株产酶的培养基：可溶性淀粉41.6 g/L、黄豆粕粉26.2 g/L、CaCl2 1.0 g/L,KH2PO4 2.0 g/L。在此基础上,3 L摇瓶放大试验结果显示,菌株F8-C的产酶量达到（3 231±21） U/mL,较出发菌株H-A-3提高44.8%。结果表明利用60Co辐射诱变育种,并采用统计学方法优化培养基,对于提高枯草芽孢杆菌纤溶酶的产酶量是一种有效策略。该研究结果也将为下一步发酵罐扩大试验奠定基础。     

琼胶酶高产海洋细菌QM42的发酵条件优化

通过单因素试验和正交试验对琼胶酶高产海洋细菌QM42发酵条件进行了优化.经过发酵培养试验,确定优化培养基组成:蛋白胨浓度5.0g/L、酵母粉浓度0.50g/L、琼胶浓度3.0g/L;在培养初始pH值为7.0、装液量50mL/150mL、培养盐度50g/L,29℃条件下发酵48h,粗酶液酶活力达到627.65U/mL.     

丛梗孢酵母产赤藓糖醇的诱变选育

利用微波-硫酸二乙酯复合诱变对产赤藓糖醇丛梗孢酵母E54进行处理,以高渗平板和摇瓶发酵为筛选方法,得到遗传稳定的诱变高产株EW29;再采用氮离子注入对EW29进行诱变处理,摇瓶发酵筛选得到诱变株EN59,其90h发酵液中赤藓糖醇产量达到55.13g/L,较EW29提高20.3%,较E54提高36.9%,遗传稳定性较好。对突变株EN59的发酵培养基进行了优化,在优化培养基葡萄糖250g/L、酵母膏5g/L、KH2PO4 0.3g/L、MnSO4 ·4H2O 0.04g/L、CuSO4 ·5H2O 0.03g/L,初始pH4的条件下,90h发酵液中赤藓糖醇平均产量达到69.00g/L以上。在优化培养基的基础上进行5L罐发酵放大实验,发酵126h赤藓糖醇产量达到71.14g/L。     

浓香乳菇深层发酵工艺的研究

报道了浓香乳菇液体发酵的试验结果。研究了 7种营养物质对菌丝生长的影响 ,应用正交试验得到了发酵培养基 ,确定了摇瓶发酵条件 ,进行了 3L发酵罐培养的初步试验。结果表明 ,其适宜发酵培养基的组成为麸皮汁 4%、土豆汁 30 %、玉米粉 5 %、KH2 PO40 3%、MgSO40 1 5 %、VB1 0 0 5 % ;适宜的发酵条件是 2 4℃、培养基起始 pH 4 0、摇瓶装量 80mL/30 0mL三角瓶、接种量 1 0 %、大号玻璃珠 1 0个 /瓶 ;产菌丝干重 1 95 g/1 0 0mL左右。