高产维生素K2菌株的选育及发酵条件优化

为了提升纳豆芽孢杆菌发酵过程中维生素K₂(VK₂)的产量,以纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)SD-3为出发菌株,采用化学和物理的诱变方式,构建高产VK₂的营养缺陷型菌株。首先对纳豆芽孢杆菌SD-3进行硫酸二乙酯(DES)诱变和紫外诱变,以SD-3的致死率为诱变标准做单因素试验得到诱变条件。然后多次连续筛选并检测菌体发酵液中VK₂的含量,最后通过响应面分析法对发酵条件进行优化。实验结果获得1株具有分枝酸-Trp/Phe/Tyr代谢途径,Phe-和Trp-合成缺陷的双重营养缺陷型VK₂高产菌株PT-6;其VK₂的平均产量达到40.23 mg/L,得到诱变条件为:紫外照射距离为25 cm,照射时间为50 s,2% DES,反应60 min;最佳发酵条件为:装液量64 mL,接种量3%,温度38℃,VK₂含量最终达到51.23 mg/L。VK₂的最终产量相较于初始菌株SD-3提高了134.35%。     

同位素内标稀释液质法测定婴幼儿配方乳粉中维生素K1

建立一种测定婴幼儿配方食品中维生素K1的同位素内标稀释超高效液相色谱-质谱准确定性定量方法。样品经脂肪酶酶解,碱液皂化,正己烷提取,浓缩后用甲醇复溶,以甲醇和甲酸水作为流动相进行梯度洗脱,在BEH C18色谱柱上进行分离,电喷雾电离（ESI）-三重四级杆质谱正离子MRM方式检测,以维生素K₁-D₇同位素内标稀释法准确定量。在5～500μg/L质量浓度范围内维生素K₁线性关系好,线性相关系数为0.9998,该方法检出限为1 ng/g,定量限为2 ng/g,不同加标水平平均回收率在88.0%～102.5%之间,变异系数为1.75%～5.26%（n=6）。该方法快速、准确、灵敏,适用于婴幼儿配方食品的测定。     

高效液相色谱法测定多组分配方含维生素K2制剂中七烯甲萘醌的含量

目的建立高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)测定多组分配方含维生素K_2制剂中七烯甲萘醌含量的方法。方法试样在酸化、酶解后,经异丙醇提取,采用反相色谱柱分离,紫外检测,外标法定量测定七烯甲萘醌含量。结果在优化的实验条件下,七烯甲萘醌在0.20～7.90μg/mL范围内线性关系良好(r~20.9995),方法的定量限为1.6μg/g,回收率94.55%～101.05%,相对标准偏差为2.33%(n=3)。结论该方法灵敏快速准确,适用于多组分配方制剂中七烯甲萘醌的含量检测。     

快速测定婴幼儿配方乳粉中的维生素B1及B2

建立高效液相色谱-荧光法快速测定婴幼儿配方乳粉中维生素B₁及维生素B₂。方法优化了前处理条件,采用高压酸提法提取目标化合物,样品沉淀蛋白后直接测定维生素B₂,取部分清液用碱性铁氰化钾衍生后测定维生素B₁。目标物在对应的浓度范围内呈现良好的线性关系（R²≥0.9998）,样品加标回收率在92.4%～102%之间。该方法快速,准确,适用于婴幼儿配方乳粉中维生素B₁、B₂的测定。     

反相高效液相色谱法测定维生素K2中 七烯甲萘醌的含量

目的建立维生素K2产品中七烯甲萘醌(MK-7)的反相高效液相色谱定量检测的方法。方法采用Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,流动相为50%甲醇/水(含0.1%乙酸)(95:5=V:V),50%异丙烷。流速为等速1.0 m L/min,检测波长270 nm,柱温40℃。结果 MK-7在浓度0.355~2.132 mg/m L的范围内具有良好的线性关系,相关系数在0.9999以上。重复性实验中相对标准偏差为0.41%,加标回收率为98.15%。结论此方法准确性高、重现性好、操作简单,可用于维生素K2中MK-7含量测定。     

维生素K2单独及与钙剂联合使用对斑马鱼骨骼健康的改善作用及机制研究

目的：研究维生素K₂单独使用及与钙剂联合使用对斑马鱼骨骼健康改善作用及机制。方法：采用转基因Tg系健康斑马鱼作为实验动物,利用泼尼松龙诱导骨质疏松斑马鱼模型,显微镜下观察并拍照,以斑马鱼成骨细胞荧光面积和荧光密度为指标,评价药物处理后斑马鱼骨骼发育情况,并采用Real-time qPCR检测相关基因表达变化。结果：在5～20μg/mL的实验安全剂量范围内,维生素K₂及与D₃和钙剂联合使用,均能显著改善由泼尼松龙诱导的斑马鱼成骨细胞荧光面积和荧光密度的降低(P<0.05);维生素K₂通过促进成骨细胞生成相关的alp、bmp2a和bmp4基因的表达,抑制破骨细胞生成相关的opg、rank1、trap、ctsk基因的表达以及抑制细胞外基质中骨钙化相关基因vdrb、sparc、colla2表达从而发挥功效。结论：维生素K₂通过促进成骨细胞生成相关基因的表达,抑制破骨细胞和细胞外基质中骨钙化相关基因的表达,发挥改善斑马鱼骨骼健康的作用,其与钙剂联合给药,可提升其改善骨骼健康能力。     

在线固相萃取-高效液相色谱法快速测定奶粉中的维生素K1与维生素K2

目的：建立一种在线固相萃取-高效液相色谱分析方法快速测定奶粉中维生素K1与K2。方法：加入脂肪酶水溶液酶解奶粉样品;酶解液加入异丙醇与KOH水溶液进行定容后,在线固相萃取装置上进行上样、转移、分析测定和清洗平衡后,进入液相色谱仪上进行洗脱将维生素K1、K2分开,荧光检测器检测,外标法定量。结果：VK1、MK-4和MK-7在0.002-0.1ug/mL范围内良好线性;检出限分别0.12ug/100g、0.14ug/100g、0.19ug/100g。结论：这种快速测定法溶剂消耗少,大幅缩短了检测时间,节省了人力,实现了自动在线净化检测,提高了灵敏度,保证了测试结果的准确性和稳定性。     

高效液相色谱-荧光检测法测定保健食品中维生素K2的含量

目的建立高效液相色谱-荧光检测法快速检测保健食品中维生素K_2(四烯甲萘醌)的分析方法。方法样品使用GIST C_(18)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分离,柱后经锌粉还原柱(4.6 mm×50 mm,50～70μm)衍生,以甲醇(含有四氢呋喃10%、冰醋酸0.03%、氯化锌1.5 g/L、无水乙酸钠0.5 g/L)为流动相,流速为1.0 mL/min,进入荧光检测器进行检测。结果四烯甲萘醌保留时间约为10 min,在浓度0.1099～2.197μg/mL范围内线性关系良好,相关系数r~2=0.9999。重复性实验RSD为0.794%,3个浓度级别的加标回收率在97.1%～101.9%之间。当取样量为1.5 g,总定容体积为500mL时,四烯甲萘醌的检出限为71μg/100 g,定量限为236μg/100 g。结论该方法准确性高、重现性好、操作简单,可用于保健食品中维生素K_2的含量测定。     

高效液相色谱荧光法测定营养素补充制剂中维生素K2(MK-7)的含量

建立高效液相色谱荧光法（HPLC-FLD）测定营养素补充制剂中维生素K2（MK-7）的含量。样品用异丙醇超声提取30 min，提取液离心过滤后取样液10 μL注入液相色谱系统中。样液经安捷伦C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)或其他等效色谱柱分离，柱后采用锌粉还原柱（4.6 mm×50 mm）衍生，使样品中维生素K2（MK-7）具有荧光特性。以甲醇（含5%四氢呋喃，冰乙酸0.03%，乙酸锌1.0 g/L）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长 激发波长243 nm发射波长430 nm。当称取样品1.0 g，定容体积为10 mL时，MK-7的检出限为0.03 μg/g，定量限为0.1 μg/g；MK-7在浓度0~2.176 μg/mL的范围内线性关系良好，线性相关系数为R2=0.9999；重复性实验中RSD%为0.97%；样品加标回收率为93.40%。此方法操作简单，高效，准确，重现性好，可用于营养素补充制剂中维生素K2（MK-7）的含量测定。     

HPLC法测定保健食品B族维生素片中9种维生素B的含量

目的:建立高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）法测定B族维生素片中9种维生素B成分的含量。方法:样品中的叶酸经0.3%氨溶液超声提取,样品中的生物素、维生素B₁₂和泛酸经水超声提取,样品中的维生素B₁、维生素B₂、维生素B₆、烟酸和烟酰胺经0.1%盐酸超声提取,经C₁₈柱分离,以甲醇-0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液为流动相进行梯度洗脱,泛酸和生物素在205 nm波长处进行检测,维生素B₁、维生素B₂、烟酸和烟酰胺在256 nm波长处进行检测,维生素B₆和叶酸在287 nm波长处进行检测,维生素B₁₂在361 nm波长处进行检测。结果:9种成分能实现较好地分离,在各自线性范围内线性关系良好,决定系数R2均大于0.999,平均回收率为91.8%~106.9%,RSD为0.2%~4.8%,方法的检出限在0.05~4.7 mg/kg之间。结论:该方法操作快速简便、精密度和重复性好,能快速完成保健食品B族维生素片中9种维生素B成分的测定,并降低成本。     

Stability and Photochemistry of Vitamin D2 in Model System

Oxidation of vitamin D₂ in a model system of 12% water and 88% acetone in the presence of 15 ppm riboflavin under light and dark was studied by measuring the depleted headspace oxygen. Riboflavin accelerated the oxidation of vitamin D₂ by singlet oxygen under light, but did not affect the vitamin D₂ oxidation under dark. The effect of 0 and 15 ppm riboflavin on the stability of vitamin D₂ during storage at 25 and 60°C was studied by measuring the contents of vitamin D₂ during 48h. Results indicated that photosensitized singlet oxygen oxidation of vitamin D₂ under light was temperature-independent, and triplet oxygen oxidation of vitamin D₂ both under light and in the dark was temperature-dependent.     

纳豆菌生产微量生理活性物质的研究

高桥和宫城纳豆菌接种于大豆豆渣或大豆煮汁粉培地都能增殖。固体培养时,只有宫城菌在20%豆渣培地能生产出2,6-吡啶二羧酸。液体培养时,0.5%大豆煮汁粉培地比2%大豆煮汁粉培地生产了多量的2,6-吡啶二羧酸;同样的液体培养条件,高桥菌比宫城菌能生产出更多的维生素K2(MK-7)。     

基于ARTP技术选育维生素K2优势菌株及发酵培养基优化

本研究目的在于获得维生素K₂优势突变株,并利用响应面设计优化发酵培养基进一步提高其产量。采取常压室温等离子体诱变技术结合结构类似物抗性初筛、24孔板发酵复筛,对纳豆芽孢杆菌进行诱变选育,并应用Box-Behnken设计对发酵培养基进行优化。通过ARTP诱变选育得到一株维生素K₂优势突变株,维生素K2产量较初始菌株提高了3.23倍。Box-Behnken实验优化后,最佳值为K₂HPO₄（0.69 g/L）,甘油（66.01 g/L）和酵母粉（25.12 g/L）,发酵后维生素K₂产量较优化前提高了56.7%。通过ARPT技术诱变选育出一株维生素K2优势突变株,采用响应面法优化发酵培养基。实验结果表明,突变株具有潜在的生产应用价值,建立的育种方法也可为其他工业微生物的选育提供有益的参考,对提高人们的健康水平具有十分重要的意义。     

原生质体电融合选育维生素K2高产菌株

试验采用双亲灭活原生质体电融合选育维生素K2高产菌株,探究了灭活和电融合条件。结果表明:经热灭活和紫外灭活后,在成串脉冲频率2 MHz,成串电压32 V,脉冲融合电压500 V,脉冲宽度40μs,脉冲个数6个的条件下进行电融合,筛选得到一株优良菌株BKU-6,其维生素K2的产量达到39.6 mg/L,远高于产量低的亲本菌株CICC10262。     

超高效合相色谱法直接检测VC方法

建立超高效合相色谱法分离和测定VC的方法。超高效合相色谱技术集合超临界流体色谱和超高效液相色谱的技术优点,流动相以CO2为主体,甲醇（含0.05% H3PO4）为助溶剂。选用Waters CSH Fluoro-Phenyl（3.0 mm×100 mm,1.7 μm）色谱柱,流速0.6 mL/min,检测波长为245 nm,方法检出限为1.5 mg/kg,线性范围为5～200 mg/L;加标回收率范围为96.05%～101.15%;相对标准偏差为0.52%～0.76%,具有高效、检测速度快、操作简单、灵敏度高、检出限低、重复性好、实验成本低等优点。     

正交试验优化香菇粉中麦角甾醇和VD2超声波微波协同提取工艺

采用超声波-微波协同提取的方法,通过单因素和正交试验对提取时间、微波功率和超声波功率进行研究,优化香菇粉中麦角甾醇和维生素D₂(VD₂)的提取工艺。结果表明,各因素对麦角甾醇和VD₂提取效率的影响程度依次为提取时间>微波功率>超声波功率,最终优化提取条件为:无水乙醇为提取溶剂,提取时间20 min,料液比1:20(g/mL),提取温度为室温,超声波功率为400 W,微波功率为200 W。在该提取条件下,麦角甾醇含量高达(3.59±0.69)mg/g,VD₂含量高达(123.52±0.69)μg/g。麦角甾醇的平均回收率(n=6)为114.57%,RSD(n=6)为3.83%,VD₂平均回收率(n=6)为102.26%,RSD(n=6)为4.95%。该法同比已有方法提取效率高,提取和分析时间短,操作简便,且具有较好的准确性及重现性。     

响应面法优化粪肠球菌包被发酵培养基

本研究旨在优化粪肠球菌包被发酵培养基,以获得高密度包被粪肠球菌。以包被培养活菌含量为检测指标,采用Plackett-Burman(PB)试验分析培养基中对粪肠球菌发酵影响最重要的主要因素,结合响应面法(RSM)对主要因素进行了优化,并研究了最优条件下包被培养的粪肠球菌冻干粉的稳定性。结果表明,最优包被发酵培养基配方为:葡萄糖4.93%、蛋白胨 1%、牛肉膏 0.8%、酵母粉 0.6%、柠檬酸铵 0.3%、K₂HPO₄·7H₂O 0.2%、MgSO₄·7H₂O 0.06%、MnSO₄·H₂O 0.045%、NaAc·3H₂O 0.6%、吐温80 0.1%、海藻酸钠 1.87%、纳米碳酸钙 3.65%。在此条件下,粪肠球菌包被活菌数达6.83×109 CFU/mL,与预测值误差仅4.12%。贮存稳定性试验表明,制备成的冻干粉在37 ℃条件下贮存90 d后仍保留80%以上的存活率,说明包被培养粪肠球菌冻干粉具有较高的稳定性。     

高效液相色谱法同时测定枣果实中的有机酸和VC含量

目的：建立枣果实中有机酸含量的高效液相色谱测定方法。方法：采用高效液相色谱-二极管阵列检测器法,水浴超声、离心、膜过滤提取枣果实中的有机酸。色谱条件：色谱柱为Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm,5 μm）,流动相为0.04 mol/mL KH2PO4溶液,流速0.5 mL/min,柱温30 ℃,检测波长210 nm。结果：在此色谱条件下,草酸、酒石酸、奎宁酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸和VC在30 min之内得到基线分离。7 种有机酸和VC标准曲线的相关系数（R2）均在0.998 9以上;精密度检测,相对标准偏差为0.98%～4.77%（n=5）;重复性检测,相对标准偏差为0.88%～2.19%（n=5）;回收率在91.35%～105.74%之间。结论：本方法准确、高效、便捷,适于枣果实中有机酸的测定。