植物乳杆菌降胆固醇Lp10菌株的rhaD基因敲除株的构建

以转录组数据为依据推测植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中rhaD基因参与胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)合成代谢中的鼠李糖代谢过程,从而通过调节胞外多糖合成并利用其吸附作用达到降胆固醇效果。为了进一步验证rhaD基因的功能,本论文研究利用同源重组技术,构建rhaD基因敲除载体,采用电击转化方法将构建的敲除载体导入植物乳杆菌Lp10菌株感受态细胞,并在抗性平板上筛选转化子,以转化子的基因组DNA为模板进行PCR及测序鉴定,再利用邻苯二甲醛法测定突变株与初始菌株的降胆固醇能力。结果表明,敲除载体pNZ5319-rhaD被成功构建,测序结果显示rhaD基因被成功敲除;敲除菌株的降胆固醇能力略有上升。本论文研究结果不仅为植物乳杆菌基因敲除载体的构建提供了实验技术支持,同时为植物乳杆菌降胆固醇相关功能基因的验证分析奠定了理论依据。     

德式乳杆菌保加利亚亚种分解代谢控制蛋白CcpA基因敲除突变株的构建

在革兰氏阳性菌中,分解代谢控制蛋白(Ccp A)是一种参与碳代谢和氮代谢的多效调控蛋白。利用同源重组技术,以德式乳杆菌保加利亚亚种为研究对象,构建Ccp A基因敲除突变株。首先以德式乳杆菌保加利亚亚种ATCC11842基因组DNA和质粒p BR322为模板,扩增Ccp A基因和四环素抗性基因(Tet),然后分别将Ccp A基因和Tet基因连接到载体p Back Zero-T Vector上,再对中间载体p Back Zero-Ccp A和p Back Zero-Tet进行双酶切,回收纯化双酶切后的目的片段并连接获得Ccp A基因敲除的重组载体p CT。通过同源重组筛选Ccp A基因敲除突变株,菌落PCR和测序鉴定结果均显示Ccp A基因敲除突变株构建成功,这为阐明该调控蛋白在德式乳杆菌保加利亚亚种代谢过程中的作用奠定了基础。     

三孢布拉霉遗传转化体系的构建及应用

为解决三孢布拉霉转化过程中原生质体转化率低、孢子细胞壁厚难以导入外源载体等问题,本研究中构建了根癌农杆菌侵染原生质体的转化体系,同时克隆了与非同源末端连接修复途径相关的ku80基因,并将该转化体系应用于ku80的敲除中。将ku80基因敲除框插入双元载体pDHt-sk上构建了重组敲除载体pDH-85H3,通过化学转化法将敲除载体pDH-85H3导入根癌农杆菌LBA4404,并基于农杆菌介导法转化三孢布拉霉原生质体。结果表明,经潮霉素筛选和PCR鉴定,得到的20株转化子中,有18株的基因组插入了敲除框,转化率达90%。经鉴定有2株转化子发生了同源重组,敲除率为10%。该结论表明了根癌农杆菌介导三孢布拉霉原生质体转化技术的可行性。     

枯草芽孢杆菌基因的安全改良研究

为了构建能稳定表达外源基因且无抗性标记基因的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌。采用聚合酶链式反应(PCR)技术,分两段扩增定位于B.subtilis BJ3-2染色体上的谷氨酰胺酶基因(glsA)上下游基因片段作为同源臂。将同源臂及卡那霉素基因(Kan)克隆入温敏型载体pKSV7,构建了双交换载体pKUKD。并利用pKUKD质粒将kan基因定点整合入BJ3-2染色体上,通过Kan抗性筛选获得glsA敲除菌株BJ-kan。经检测BJ3-2菌株谷氨酰胺酶活力比重组菌株高3.2倍。结果显示:BJ3-2染色体上的基因可通过同源重组方式进行敲除与置换,为今后BJ3-2菌株以及野生型B.subtilis基因敲除与置换提供了更加便捷的方法。     

一种谷氨酸棒杆菌基因无痕敲除载体的构建及应用

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）23604编码赖氨酸胞内转运蛋白基因lysP为敲除对象,利用重叠PCR技术将 lysP基因的上下游同源臂融合,并构建了由木糖启动子Pxyl和毒素蛋白基因mazF组成的筛选盒,同时无缝克隆连接至带有卡那霉素抗性基因的pTOPO载体中,经电转化及两次同源单交换筛选,实现lysP基因的无痕敲除。 结果表明,经过卡那霉素抗性筛选、木糖二次筛选及基因组PCR鉴定后,成功获得lysP基因缺失菌株C.glutamicum23604ΔlysP;发酵后C.glutamicum23604ΔlysP赖氨酸产量较对照菌株产量提高了10.8%。该实验以大肠杆菌毒素蛋白基因mazF作为反向筛选标记的敲除载体,实现谷氨酸棒杆菌lysP的高效敲除; lysP基因的敲除使得赖氨酸不能进入胞内而在胞外积累,从而达到增产赖氨酸的目的。     

长双歧杆菌婴儿亚种的快速区分

为建立一种有效、快速、低成本区分长双歧杆菌婴儿亚种的方法,对13株基因组测定的长双歧杆菌构建了基于同源基因的系统进化树,确认其中7株为长亚种,5株为婴儿亚种,1株为猪亚种。通过碳水化合物利用谱比较和特异性基因扩增的手段确认可有效用于快速区分长双歧杆菌婴儿亚种的方法。结果显示,同一亚种的菌株利用同一种碳水化合物的能力存在差异,表明无法根据碳水化合物的利用来区分长双歧杆菌的不同亚种;长双歧杆菌长亚种糖激酶基因和长双歧杆菌婴儿亚种唾液酸酶基因可有效用于长双歧杆菌婴儿亚种的快速区分,并用该方法对40株长双歧杆菌进行了亚种确认,其中5株为长双歧杆菌婴儿亚种。后随机选择了其中的4株菌进行基因组草图测序,经系统进化树构建,确认为长双歧杆菌婴儿亚种,并进一步证实特异性基因扩增可实现长双歧杆菌婴儿亚种的快速区分。     

基于PCR方法敲除黄酒酵母精氨酸酶基因的工程菌构建

用一种高效快速的免克隆方法-长侧翼同源PCR(LFH-PCR),构建基因敲除组件,然后通过化学转化方法把敲除组件转入黄酒酵母细胞中,利用同源重组机制精确敲除精氨酸酶基因(CAR1),构建了黄酒酵母工程菌株。结果表明,敲除CAR1基因的工程菌与出发菌株相比,酒液中尿素的含量降低了72%,氨基甲酸乙酯含量降低了38%,并且该菌株的遗传稳定性好,发酵性能与出发菌株基本一致。     

干酪乳杆菌yhaI基因敲除菌株的构建及其耐药表型的分析

为了深入研究干酪乳杆菌Zhang在抗生素环境中适应性进化机制,构建yhaI基因敲除体系,并对突变体的耐药表型进行研究。运用PCR技术分别扩增yhaI基因的同源臂序列,构建带有内部缺失yhaI基因的敲除载体。采用Cre/lox基因重组系统,筛选双交换子L.casei Zhang-G-1200-yhaI::lox66-P32-cat-lox71,构建突变株L.casei Zhang-G-1200-Che yhaChe I,通过稀释法研究突变株的耐药表型。通过PCR和PCR产物经测序验证,yhaI基因缺陷的菌株构建成功。耐药表型结果表明,突变株在庆大霉素浓度为8和16 μg/mL时,浊度变为原始菌株的1/2;在庆大霉素浓度为16 μg/mL时,活菌数变为原始菌株的7/10。成功构建干酪乳杆菌Zhang的基因敲除体系,为研究干酪乳杆菌Zhang的基因功能提供了技术平台。     

长双歧杆菌W13 的全基因组序列分析

长双歧杆菌由于其具有的益生功能而备受关注,该文旨在基于全基因组分析,揭示长双歧杆菌W13（Bifidobacterium longum W13）的基因特性,分析其功能基因和代谢通路。结果表明,长双歧杆菌W13 隶属于长亚种,通过直系同源蛋白分组比对（evolutionary genealogy of genes：non-supervised orthologous groups,eggNOG）数据库注释,发现氨基酸代谢、碳水化合物代谢是该菌株的主要代谢功能;通过京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）数据库注释,发现菌株中含有较多的群体感应相关基因,表明该菌株可促进肠道稳态。通过碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzymes,CAZy）数据库注释,发现该菌株具有较高的糖合成能力。最后,通过比较基因组分析,发现长双歧杆菌长亚种的遗传多样性和稳定性较高,相较于其他长双歧杆菌长亚种,菌株W13 含有其特定的功能基因。综上表明菌株W13 具有一定的益生功能,有开发为益生菌的潜力。     

干酪乳杆菌yhaⅠ基因敲除菌株的构建及其耐药表型的分析

为了深入研究干酪乳杆菌Zhang在抗生素环境中适应性进化机制,构建yha I基因敲除体系,并对突变体的耐药表型进行研究。运用PCR技术分别扩增yha I基因的同源臂序列,构建带有内部缺失yha I基因的敲除载体。采用Cre/lox基因重组系统,筛选双交换子L.casei Zhang-G-1200-yha I::lox66-P32-cat-lox71,构建突变株L.casei Zhang-G-1200-Che yhaChe I,通过稀释法研究突变株的耐药表型。通过PCR和PCR产物经测序验证,yha I基因缺陷的菌株构建成功。耐药表型结果表明,突变株在庆大霉素浓度为8和16μg/m L时,浊度变为原始菌株的1/2;在庆大霉素浓度为16μg/m L时,活菌数变为原始菌株的7/10。成功构建干酪乳杆菌Zhang的基因敲除体系,为研究干酪乳杆菌Zhang的基因功能提供了技术平台。