建立同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法测定烘焙食品中来源于鸡蛋的3种主要致敏蛋白

目的建立用于测定烘培食品中来源于鸡蛋的3种主要致敏蛋白溶菌酶、卵转铁蛋白、卵白蛋白的超高效液相色谱-串联质谱法。方法筛选溶菌酶、卵转铁蛋白、卵白蛋白的特异水解肽段,合成特异肽段及其同位素标记肽段,样品用200 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)匀浆提取2~3次,提取液与胰蛋白酶混匀(胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1∶50),37℃振摇酶解12 h,采用电喷雾正离子模式下多反应监测(MRM),同位素内标法定量。结果 9条特异水解肽段标准溶液在1~100 nmol/L范围内线性良好,相关系数(r2)均0.995,烘培食品中3种致敏蛋白的定量限为0.4~10.0μg/g,回收率在65.0%~108.5%之间,相对标准偏差(RSD)15.0%。结论方法灵敏度和特异性高,适用于烘培食品中来源于鸡蛋的3种致敏蛋白的检测。     

花生致敏蛋白Ara h1双抗体夹心ELISA法的建立

为建立用于花生致敏蛋白Ara h 1快速、灵敏、特异检测的双抗体夹心ELISA法,以Ara h 1鼠源单抗(mAb)为捕获抗体,以Ara h 1兔源多抗(pAb)为检测抗体,通过棋盘法优化抗体工作浓度建立方法,并对方法的灵敏度、特异性、准确度、稳定性等检测特性进行鉴定。结果表明,双抗体夹心ELISA法的mAb和pAb最佳工作浓度分别为1∶10 000稀释和1∶8 000稀释;ELISA标准曲线线性范围为4～256ng/mL,检测限为4.16ng/mL;样品添加回收试验的平均回收率为85.9%～94.5%,且该方法与其他常见致敏蛋白无交叉反应;并能在4℃条件下避光密封保存90d内保持检测结果稳定。说明所建立的双抗体夹心ELISA法灵敏特异、准确稳定,能够用于花生致敏蛋白Ara h 1的快速筛查。     

花生过敏患者血清中抗Ara h1的IgG与IgE分离纯化研究

Ara h1是花生的一种主要致敏原蛋白,能够使花生过敏患者产生特异的IgG与IgE,从而导致花生过敏症状。Ara h1与其特异IgG和IgE的结合是导致花生致敏的一个重要原因。本研究利用Protein A亲和层析柱与Ara h1作为配体的亲和层析柱纯化抗Ara h1的IgG与IgE。高纯度的抗Ara h1特异IgG与IgE对探讨研究其与Ara h1之间相互作用具有重要意义。     

花生过敏原及其检测方法研究进展

花生过敏可导致某些人群严重的食品安全问题。过敏患者只能通过避免食用含有花生过敏原成分的食物来避免过敏。但是,食品在生产加工、储存、运输、销售过程中有可能被过敏原污染。因此,确定各类加工食品中是否含有花生过敏原成分,对于预防食用者发生花生过敏反应具有重要意义。花生中已确定的过敏原蛋白有13种(Ara h 1~Ara h 13)。本文综述了花生中过敏原蛋白的结构信息,当前流行的提取方法,以及各种定性定量的检测方法,总结了各种方法的优缺点。同时对建立一种具有特异性强、灵敏度高、定量准确的花生致敏蛋白检测方法的发展趋势进行了展望。     

花生致敏蛋白Ara h2提取纯化及免疫分析

对花生致敏蛋白Ara h2的提取纯化方法进行探究以及对纯化后的花生致敏蛋白Ara h2的免疫特性进行鉴定,以建立得率较高、操作简单的蛋白纯化方法。     

中国花生致敏蛋白的识别

我国对花生过敏方面的研究很少。本实验利用中国常用花生品种识别鉴定了中国主要的致敏蛋白,比较了国内外花生品种致敏蛋白相对含量的差异,期望找到中国花生过敏发病率较低的原因,为临床食物过敏患者的治疗和低过敏花生品种的培育提供理论依据。研究结果表明:Ara h1和三条Ara h3多肽是中国主要的致敏蛋白,并发现了Ara h1的亚基,分子量为58kD的多肽。Ara h1和Ara h3的相对含量各品种之间差异显著,并且低于国外花生品种。因此中国花生主要致敏蛋白相对含量低可能是导致中国花生过敏发病率较低的主要原因。     

纯芝麻酱中花生致敏蛋白Ara h2、Ara h3及芝麻蛋白2S albumim的分析鉴定比较

针对花生致敏蛋白Ara h2、Ara h3及芝麻蛋白2S albumim,使用实时荧光定量PCR法（Real-time PCR）及酶联免疫吸附法（ELISA）对纯芝麻酱中上述蛋白进行检测。两种方法的特异性、重复性方法学验证显示均良好。验证后使用实时荧光定量PCR法对纯芝麻酱DNA进行芝麻蛋白2S albumim基因、花生蛋白Ara h2基因的检测,使用酶联免疫吸附法对花生致敏蛋白Ara h3检测。实时荧光定量PCR法检测90批样品均含有芝麻成分,CT值为22.00~33.80,其中45批次还检出花生成分,CT值为25.60~38.60;酶联免疫吸附法除检出此45批次外还另检出38批次含有花生成分。通过结果比对分析及灵敏度检测研究发现,酶联免疫吸附法检出限更低。二者检测结果虽有差异,但不矛盾,均可用于纯芝麻酱中花生源检测。高含量样品检测时可选择实时荧光定量PCR法,低含量或无法预估的样品可选择酶联免疫吸附法。目前无芝麻酱中过敏原检测相关标准,该研究可作为基础研究的可靠数据并建议监管部门尽快建立相关方法,更好的规范市场行为,保障人民的饮食安全。     

低致敏蛋白Ara h 1复合益生菌发酵花生乳制备工艺优化

目的:研制低致敏复合乳酸菌发酵花生乳。方法:利用试剂盒测定不同品种花生中的粗蛋白含量及Ara h 1含量，选取Ara h 1含量最低的花生品种制作发酵乳；以接菌量、接菌种类、发酵时间及糖添加量为考察因素，Ara h 1含量为测定结果，采用响应面法优化致敏蛋白Ara h 1含量下降最多的发酵花生乳制备工艺；制作复合益生菌发酵花生乳，并对产品的口感、组织状态和风味进行感官评价。结果:当接菌量为4%、接种嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌、发酵4 h、糖添加量为6%时，发酵花生乳中的主要过敏原Ara h 1减少70%,含量为48μg/g,且感官评分达到80分。结论:经工艺优化获得了致敏蛋白Ara h 1含量低，凝乳效果好，口味怡人的复合益生菌发酵花生制品。     

酪蛋白糖巨肽对花生过敏原免疫反应性的影响

目的 探究酪蛋白糖巨肽与花生过敏原相互作用并降低其免疫反应性的潜力。方法 通过蛋白-蛋白分子对接技术探讨酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptides, CGMP)与Ara h1、Ara h2是否有相互作用的潜力。进一步通过混合水浴加热制备CGMP与花生蛋白的混合溶液(mixed solution of casein glycomacropeptides and peanut proteins, MCGP),建立MCGP致敏、花生蛋白激发的BALB/c小鼠模型,研究MCGP对花生过敏反应的影响。最后使用圆二色谱法研究酪蛋白糖巨肽与Ara h1、Ara h2的相互作用力及对其结构的影响。结果 CGMP与Ara h1、Ara h2间存在次级键(盐桥、氢键、范德华力),部分作用于过敏原表位;MCGP致敏组血清中的花生蛋白特异性免疫球蛋白E(Specific immunoglobulin E, sIgE)、sIgG₁、sIgG_2a含量显著下降,白介素-4(interleukin-4, IL-4)、IL-5、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)、组胺水平显著下降,肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)水平显著升高, MCGP中Ara h2的α-螺旋与β-折叠的比例改变。结论 CGMP能够改变Ara h2的结构,遮蔽花生过敏原表位,抑制sIgE、sIgG结合Ara h1、Ara h2,降低部分花生过敏原的免疫反应性。     

典型热加工对花生致敏蛋白及其免疫反应性的影响

通过免疫学方法检测了花生制品加工过程中几种典型热加工方式对花生致敏蛋白的免疫反应性的影响。结果表明:烘焙、水煮、油炸和高温高压处理均使花生可溶性蛋白含量显著降低;随之,处理后样品中蛋白提取物的免疫反应性也显著下降,其中高温高压处理最为显著;热处理对花生致敏蛋白Ara h 2的溶解性及免疫反应性的影响较小,而对Ara h1和Ara h 3的影响则比较明显。     

气相色谱-质谱法检测干辣椒中常用有机磷和 拟除虫菊酯类农药的残留

建立了气相色谱质谱法同时测定干辣椒中常用有机磷和拟除虫菊酯类农药的测定方法,样品采用乙腈-水提取,经凝胶色谱仪净化去除大分子色素及杂质,再经过石墨化炭黑-氨基SPE柱净化,以气相色谱-质谱联用仪(EI源)检测,内标法定量。在添加水平为0.05~0.5mg/kg下的平均回收率为71.6%~116.4%,相对标准偏差在2.3%~10.8%之间,样品最低检出限为0.01~0.05mg/kg。     

超高效液相色谱-串联质谱法快速测定饮料中 22种添加剂

目的建立了超高效液相色谱-串联质谱法(ultra high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UHPLC-MS/MS)同时测定饮料中22种食用添加剂的方法,包括6种防腐剂,5种甜味剂,5种抗氧化剂和6种着色剂。方法试样经乙腈/水溶液超声提取,离心,上清液用水稀释后液相色谱-串联质谱仪直接测定,外标法定量,整个过程可在0.5 h内完成。结果在5~320μg/L的线性范围内,各物质线性相关系数均大于0.995。加标回收率范围为63.3%~107.9%,方法检测限在0.05~0.4 mg/kg之间,相对标准偏差在7.0%~14.8%之间。结论将本方法用于实际样品分析,简便快速,灵敏度高,可以满足对饮料中多种食品添加剂的同时测定。     

质谱法分析烘焙对花生过敏原Ara h 1潜在致敏性的影响

为研究烘焙对花生过敏原Ara h 1潜在致敏性的影响,采用高离液序列盐溶液从鲜花生和烘焙花生中提取总蛋白,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析烘焙前后蛋白条带变化情况,并对其中的花生主要过敏蛋白Ara h 1条带进行质谱和Swiss-Model模型分析。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,烘焙花生蛋白出现了大分子聚合物条带以及较多弥散状蛋白条带,说明烘焙过程中蛋白质会发生聚集,同时也可能发生降解。对鲜花生Ara h 1条带的质谱分析结果显示,检测出70 条肽段,覆盖率达到79.2%;而烘焙后其中40 条肽段未能检出,但新增1 条肽段,且覆盖率降至43.9%。全部71 个肽段涉及到Ara h 1的18 个过敏原线性表位,酶解后鲜花生中检出16 个过敏原线性表位被破坏,烘焙花生中仅发现12 个被破坏。结论：烘焙加工会破坏蛋白质高级结构,掩盖了部分酶切位点,减少了酶解对过敏原线性表位的破坏,这可能是导致烘焙加工后Ara h 1致敏性强于未加工样品的原因。     

QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法快速测定鸡肉中氟虫腈及其代谢物

建立一种QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法,快速测定鸡肉中氟虫腈及其3种代谢产物(氟甲腈、氟虫腈砜及氟虫腈亚砜)的方法。鸡肉样品经乙腈分散,DisQuE提取管提取和DisQuE净化管净化后,采用液相色谱-串联质谱定量测定,选择性多反应监测模式检测。在0.5~20ng/mL线性范围内,氟虫腈及其代谢产物的回归方程均呈良好的线性关系,R2>0.999,在添加水平为1.0、5.0、10.0μg/kg时,平均回收率为75.2%~89.9%,相对标准偏差(RSD)为0.8%~9.2%,方法检出限为0.5μg/kg,定量限为1.0μg/kg。该方法简便快捷,灵敏度和准确度均较高,精密度较好,适用于鸡肉中氟虫腈及其代谢产物残留量的检测。     

全自动固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定油料 作物中2,4-二氯苯氧乙酸和2,4,5-三氯苯氧乙酸的残留量

目的建立全自动固相萃取-气相色谱-质谱联用法测定花生、大豆和芝麻3种油料作物中2,4-二氯苯氧乙酸和2,4,5-三氯苯氧乙酸的分析方法。方法样品经过二氯甲烷提取,衍生化反应,全自动固相萃取仪净化,DB-5MS毛细管色谱柱分离,选择离子扫描模式检测,外标法定量。结果 2种农药在线性范围内具有良好的线性关系,相关系数r≥0.999,定量限均低于0.010 mg/kg,添加的平均回收率在73.6%~100.8%之间,相对标准偏差在3.31%~7.68%之间。结论建立的方法样品前处理简单,净化过程实现了自动化操作,大大提高了工作效率。该方法灵敏度高、回收率好,适用于油料作物中2种农药的同时检测。     

同位素稀释气相色谱-串联质谱法测定动物源食品中克霉唑残留量

建立了动物源食品（猪肉、鸡肉、猪脂肪、猪心、猪肝、猪肾）中克霉唑残留量的同位素稀释气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）测定方法。样品经加速溶剂提取后,用凝胶渗透色谱净化。采用HP-5 MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）进行分离,多反应监测（MRM）模式检测,同位素内标法定量。实验结果表明,克霉唑在1~100 μg/L浓度范围内线性良好,决定系数（R2）为0.9995,定量限（LOQ,S/N≥10）为2.0 μg/kg。在2.0、5.0、20.0 μg/kg加标水平下,回收率在82.6%~116.5%之间,相对标准偏差为5.2%~13.5%。该方法灵敏度高、准确性好,能够满足动物源食品中克霉唑残留量的确证和定量分析。     

花生过敏原Ara h 6的分离纯化及鉴定

为高效分离纯化花生过敏原Ara h 6,通过脱脂、蛋白浸提、阴离子交换层析分离得到目的蛋白,并用十二烷基磺酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、基质辅助激光解吸/ 电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)及免疫印迹技术(Western blotting)对其进行鉴定。结果表明,该蛋白为花生过敏原Ara h 6,其分子质量约为15kD,纯度大于95%,得率为22.5%。该方法简单、高效,可为花生过敏的进一步研究提供实验材料。     

A two-site monoclonal antibody immunochromatography assay for rapid detection of peanut allergen Ara h1 in Chinese imported and exported foods

Food allergen labeling has not yet been implemented in China. Therefore, a gold immunochromatography assay (GICA) was developed using two monoclonal antibodies (mAb) against the peanut allergen Ara h1. The GICA was specific for standard peanut samples with a sensitivity of 10 ng/ml. Peanut protein traces extracted from 124 food products imported and exported by China Customs were easily and rapidly detected by GICA. 68 food samples originally labeled as containing peanuts were positive for Ara h1 and 54 food samples labeled as not containing peanuts were negative for Ara h1, indicating that the labels from the manufacturers were accurate. However, 2 food samples labeled as not containing peanuts tested positive for Ara h1. The present GICA provides a fast, simple, semi-quantitative method for the determination of peanut allergens in foods. This detection system can be used to ensure the safety of food imported and exported by China Customs.     

固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定食品中的丙烯酰胺

建立高效液相色谱-串联质谱仪测定食品中丙烯酰胺含量的方法。以[D3]-丙烯酰胺为同位素内标,使用20mg/mL淀粉酶溶液对样品进行酶解,经水浴、除脂、离心,利用固相萃取柱进行净化并浓缩后,通过高效液相色谱-串联质谱仪以多选择反应监测模式进行分析测定。该方法的检出限和定量限分别为4.8μg/kg和16.5μg/kg。本方法具有操作方便、准确率高、重复性好等优点,可广泛应用于各类食品中丙烯酰胺含量的检测。     

离子交换层析法分离花生过敏原Ara h2的研究

为了制备出花生中重要过敏原Arah2,以生花生为材料,采用脱脂、离心、膜透析、离子交换层析等方法,纯化花生过敏原Arah2。结果显示,采用阴离子交换层析方法,制取的Arah2蛋白纯度达90%,得率为21.9%,该方法为过敏原Arah2的分离研究提供了可行的实验参数。