枯草芽孢杆菌B26生产多隔镰孢霉抑制物工艺优化

采用正交试验设计对枯草芽孢杆菌B26 抑制多隔镰孢霉培养基配方及用量进行优化,单因素试验对B26产生活性物质的发酵条件进行选择。以多隔镰孢霉的抑制率为指标,B26 产生拮抗效果最好的发酵培养基配方用量是：蛋白胨25g/L、淀粉45g/L 、氯化钠1.5g/L、硫酸铵1.0g/L、磷酸氢二钾1.5g/L。产生活性物质的最优发酵条件为：种子菌龄24h、接种量5%、初始pH7、装液量20%、吐温-80 用量0.5%、发酵温度30℃、转速150r/min、发酵时间60h,获得B26 菌株发酵液对多镰孢霉的抑制直径为26mm,优于其他条件培养获得的拮抗效果。     

超高效液相色谱-串联质谱法快速检测麦类中典型链格孢霉毒素

建立一种超高效液相色谱-串联质谱结合分散液-液微萃取前处理方法测定麦类中7 种链格孢霉毒素（链格孢酚、交链格孢酚单甲醚、交链孢烯、细交链格孢菌酮酸、交链孢毒素I、腾毒素、细格菌素）的方法。样品经3 mL一级水、10 mL 1.5%甲酸乙腈-甲醇（4∶1,v/v）溶液提取,2 g无水MgSO4脱水和1 g NaCl盐析,振荡15 min、离心10 min后取1 mL上清液和100 μL三氯甲烷用于分散液-液微萃取。7 种链格孢霉毒素使用BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm,1.7 μm）进行分离,采用电喷雾正负离子的多反应离子监测模式。结果表明：7 种链格孢霉毒素在5 min内完成色谱分离分析,在0.5～100 μg/L质量浓度范围内均呈现良好线性关系,R2＞0.987 277,检出限为0.11～0.16 μg/kg,定量限为0.42～0.49 μg/kg;以小麦为样品基质,在3 个不同加标水平下,7 种链格孢霉毒素回收率在70.7%～101.3%之间,相对标准偏差为1.22%～4.11%。将该方法用于分析实际麦类样品（黑麦、荞麦、莜麦、青稞、燕麦、小麦）中7 种链格孢霉毒素的污染状况,结果发现腾毒素和细交链格孢菌酮酸是6 种麦类中都检出的毒素,含量分别为0.6～10.7 μg/kg和未检出～31 μg/kg;细格菌素虽检出率低于腾毒素和细交链格孢菌酮酸,但最高含量37.3 μg/kg与细交链格孢菌酮酸相当。本方法稳定、准确、灵敏、快速,能够满足麦类样品中7 种链格孢霉毒素残留分析的需求。     

“美早”甜樱桃褐腐病病原菌的分离及内生拮抗细菌的筛选鉴定

为明确山东泰安地区"美早"甜樱桃褐腐病的主要病原菌,并进行内生拮抗细菌的筛选鉴定,采集当地具有褐腐病特征的"美早"甜樱桃进行病原菌分离,利用形态学和分子生物学技术鉴定,并将分离的病原菌菌株回接甜樱桃进行致病性验证;针对褐腐病原菌,从健康甜樱桃本身筛选优质拮抗菌株,开展生防研究。结果显示,导致"美早"甜樱桃褐腐病的病原菌为美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola),回接试验表明,与腐败"美早"甜樱桃自然发病特征一致;从健康甜樱桃本身筛选获得内生拮抗细菌X-16,经形态学、生理生化特征以及16S r DNA序列鉴定为特基拉芽孢杆菌(Bacillus tequilensis),抑制率达到(72. 27±0. 55)%,对拮抗菌X-16的菌悬液、发酵液和发酵上清液进行拮抗效果验证,发酵液和发酵上清液对褐腐病菌具有较好抑制效果,抑制率分别为(71. 93±0. 18)%和(67. 14±0. 43)%。结果表明,美澳型核果褐腐病菌为山东泰安地区"美早"甜樱桃褐腐病主要病原菌;该研究筛选出的内生拮抗细菌X-16抑菌效果显著,具有优质生防菌株的潜力。     

蓝莓贮藏期病原菌的分离鉴定及植物粗提物抑菌效果研究

以湖南省长沙县的兔眼蓝莓(粉蓝)为试材,分离并鉴定出自然贮藏过程中引发蓝莓果实腐烂变质的3株主要病原真菌(LM-1、LM-2和LM-3),同时采用牛津杯法开展21种植物乙醇粗提物对其中2株低温贮藏中重要致病真菌的抑菌活性筛选,并确定其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。经形态学观察和18S r DNA序列分析将3株病原真菌分别鉴定为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、互隔交链孢霉(Alternaria alternata)和类阿达青霉(Penicillium adametzioides)。抑菌实验结果表明,丁香对灰葡萄孢菌和互隔交链孢霉的抑制能力最强,0.5 g/m L丁香提取液对灰葡萄孢菌和互隔交链孢霉的平均抑菌圈直径分别达47.55、40.66 mm,MIC分别为15.63、31.25 mg/m L,MBC分别为31.25、62.5 mg/m L。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定食用植物油中典型链格孢霉毒素

建立超高效液相色谱-串联质谱法测定食用植物油中典型链格孢霉毒素残留。正交试验确定最优提取条件为4 mL甲醇-乙腈溶液（1∶1,V/V）涡旋萃取10 s。选取Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm,1.7 μm）色谱柱,乙腈和1 mmol/L碳酸铵溶液为流动相,梯度洗脱,采用电喷雾离子源负离子多反应监测模式测定。细交链格孢菌酮酸在0.02～0.2 mg/L质量浓度范围内线性关系良好,链格孢酚、交链孢烯、腾毒素、交链格孢酚单甲醚4 种毒素在0.002～0.2 mg/L质量浓度范围内线性关系良好,R2≥0.998。验证了5 种毒素在葵花籽油和大豆油基质下方法准确性和精密度,在0.002～0.2 mg/kg添加量下,5 种毒素的平均回收率为98%～118%,相对标准偏差为2.9%～17.4%,定量限为0.002～0.02 mg/kg。该方法能够满足食用植物油中典型链格孢霉毒素分析要求。     

苯乳酸抑制链格孢霉作用靶位的分析

以从自然腐败的樱桃上分离的链格孢霉（Alternaria sp.）LD3.0086为指示菌，研究苯乳酸对链格孢霉的主要抑制作用靶位。应用分光光度法测定苯乳酸对链格孢霉的最小抑菌浓度，通过卡尔科弗卢尔荧光增白剂染液（calcofluor white，CFW）染色观察苯乳酸对菌丝顶端生长的破坏作用，利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察链格孢霉的超微结构变化，通过测定苯乳酸作用前后链格孢霉上清液中N-乙酰葡萄糖胺质量浓度变化研究苯乳酸对菌丝细胞壁的破坏作用，应用荧光双染色法观察苯乳酸对链格孢霉菌丝细胞膜的损伤作用。结果表明，12.5 mmol/L的苯乳酸能有效抑制链格孢霉的生长；与对照组（无菌水处理）相比，苯乳酸处理后链格孢霉顶端生长细胞无明显形变，经12.5 mmol/L苯乳酸处理的链格孢霉上清液中N-乙酰葡萄糖胺质量浓度基本不变；苯乳酸处理24 h，链格孢霉菌丝细胞壁表面无明显损伤，细胞内结构发生明显变化；苯乳酸短时间（4 h）处理链格孢霉，菌丝细胞膜仍较为完整，加入苯乳酸较长时间（8 h）后细胞膜发生破裂。综合分析可知，苯乳酸对链格孢霉的主要作用靶位应不是菌丝体的细胞壁和细胞膜，而是在菌丝体内部，通过破坏菌丝内部细胞器结构或引起细胞内的生化反应，从而抑制链格孢霉的生长和繁殖，发挥抑菌活性。     

药食两用植物提取液对李果实采后常见致腐真菌抑制作用

采用滤纸片法比较七种植物提取液对李果实采后常见致腐真菌的抑菌效果,研究甘草和肉桂复合提取液对褐腐病菌（Monilinia fructicola）的抑制效果及抑菌机理。结果表明,1.0g/mL甘草提取液对褐腐病菌抑制作用最强,抑菌圈直径为12.03mm;1.0 g/mL肉桂提取液对酵母菌（Saccharomyces）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）抑制作用最强,抑菌圈直径分 别为21.25 mm、17.49 mm和13.28 mm。 甘草、肉桂提取液对褐腐病菌的最小抑菌浓度（MIC）值分别为7.81 mg/mL、15.63 mg/mL,两者 联合使用时对褐腐病菌的分级抑菌浓度（FIC）值为0.75,抑菌效果增强。 甘草、肉桂提取液处理后的褐腐病菌培养液相对电导率分别 达到96.64%、48.47%;可溶性蛋白质含量分别达到50.6 μg/mL、25.1 μg/mL。 推测其破坏了褐腐病菌细胞膜结构,改变了细胞膜渗透性,导致细胞质外泄,从而发挥抑菌作用。     

丁香酚对蓝莓链格孢霉的抑制作用

以从自然腐败的蓝莓上分离得到的链格孢霉(Alternaria sp.)为对象,研究丁香酚对链格孢霉的抑菌作用及机理。测定了不同质量浓度丁香酚对链格孢霉菌丝生长和孢子萌发的影响;通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察链格孢霉的形态和结构,碘化丙啶染色观察丁香酚对链格孢霉菌丝细胞膜的影响并测定链格孢霉菌丝细胞壁相关酶活力的变化。结果表明:丁香酚质量浓度为0.3 mg/mL时能够完全抑制链格孢霉菌丝的生长及孢子萌发;与对照组相比,经0.3 mg/mL丁香酚处理的链格孢霉的孢子和菌丝严重变形、表面出现大量褶皱,胞内物质流失,无完整细胞器;菌丝经碘化丙啶染色后出现红色荧光,胞外可溶性蛋白质量浓度和电导率分别是对照组的1.18倍和8.02倍,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活力分别提高2.37倍和50%。综合分析可知,丁香酚可以破坏链格孢霉细胞壁,改变细胞膜通透性,进而抑制链格孢霉的生长代谢及其繁殖,从而发挥抑菌活性。     

棘孢木霉T-6对烟草促生及对黑胫病和根黑腐病的抗病作用

利用生防菌防治土传病害是植物病害防治中的重要措施,在温室盆栽条件下研究了棘孢木霉T-6对烟草促生和抗病效果。结果表明,棘孢木霉T-6对烟草黑胫病菌、烟草根黑腐病菌的菌丝生长抑制率分别达49.62%、59.23%;温室盆栽条件下,棘孢木霉T-6对黑胫病和根黑腐病的防治效果分别达到74.45%和75.14%。棘孢木霉T-6处理后提高了烟草叶片叶绿素含量、类胡萝卜素含量和超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶的活性,棘孢木霉T-6处理的烟株生长状况明显好于对照。棘孢木霉T-6能够促进烟株生长和提高烟草对黑胫病和根黑腐病的抗性,具有良好的应用潜力。     

链格孢霉毒素细交链格孢菌酮酸的研究进展

链格孢霉（Alternaria）是污染食品和饲料最普遍的真菌之一。细交链格孢菌酮酸（tenuazonic acid,TeA）是链格孢霉毒素中最为重要的一种,可广泛污染蔬菜、水果及谷物。本文综述TeA毒素的来源及污染情况、理化性质及其毒性、检测方法等,并就未来研究方向进行展望。     

海洋假单胞菌GY-1菌株的抗菌作用及其胞外抗菌蛋白的分离纯化

采用对峙培养法和牛津杯法测定海洋假单胞杆菌(Pseudomonas) GY-1菌株和发酵液的抑菌作用。结果表明：GY-1菌株和发酵液对小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、禾谷镰刀病菌(Fusarium graminearum)、菠菜早疫病菌(Alternaria solania)、斑点落叶病菌(Alternaria alternata)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和小麦叶枯病菌(Alternaria tenuis Nees)等植物病原真菌有较强的抑制作用。发酵液采用硫酸铵分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow柱层析、Sephadex G-75凝胶层析,以小麦根腐病菌为指示菌进行活性追踪和SDS-PAGE电泳纯度跟踪检测,纯化出一种对小麦根腐病菌具有明显抗菌作用的抗菌蛋白,其分子质量约为70.9kD。     

人参根腐病拮抗菌的筛选、鉴定及其抑菌活性

目的：从人参根际土壤中筛选出拮抗人参根腐病的菌株,初步研究其抑菌作用。方法：采用平板稀释法从人参根际土壤中分离获得菌株,以人参根腐病菌为靶标菌采用平板对峙法筛选出拮抗菌;通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列分析对筛选出的拮抗菌进行鉴定;检测拮抗菌无菌发酵液对根腐病菌菌丝生长、孢子萌发的影响,同时测定拮抗菌的抑菌谱。结果：分离获得一株对人参根腐病原菌拮抗作用较强的菌株HB-3,经鉴定菌株HB-3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株无菌发酵液对人参根腐病菌菌丝生长和孢子萌发均有显著抑制作用;菌株HB-3的抑菌谱较广,对根腐病菌、疫霉病菌、锈腐病菌、菌核病菌、灰霉病菌均有一定的抑菌活性。结论：筛选得到一株解淀粉芽孢杆菌HB-3,能显著抑制人参根腐病菌的生长,对人参根腐病有较强的生物防治效果。     

一株防治花生采后黄曲霉污染的拮抗菌的筛选及其防控效果

为预防花生储藏过程中的黄曲霉污染,从农田土中分离出2株拮抗芽孢杆菌,通过平板对峙法优选出1株作为研究对象,研究其对黄曲霉的抑制效果及对花生采后黄曲霉污染的防控效果。采用平板对峙法检测拮抗菌的抑菌广谱性并绘制生长曲线,并通过生理生化实验、形态特征观察及16S rDNA序列分析对该菌株进行鉴定。结果表明：优选出拮抗菌B419作为研究对象,其可有效抑制黄曲霉的生长,在拮抗菌浓度为1.0×10⁶ CFU/mL,黄曲霉孢子浓度为1.0×10³ CFU/mL时,黄曲霉孢子萌发抑制率达到98%;相比拮抗菌无菌发酵滤液和拮抗菌细胞悬浮液,拮抗菌发酵液防治花生黄曲霉污染效果最好;该菌株对互隔交链孢霉、枝孢霉、青霉、拟盘多毛孢等多种霉菌都有抑制作用,对大肠杆菌、酵母菌也有抑制作用;该菌株在培养4 h后进入对数期,14 h达到最大,26 h后进入衰亡期;该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。综上,分离的拮抗菌B419对多种微生物都有抑制作用,不仅可以用来预防花生储藏过程中的真菌污染,在防治植物微生物病害方面也具有良好的应用潜力。     

一株海洋梅久兰链霉菌的分离鉴定及其抗真菌作用研究

采用梯度稀释分离法从连云港海域海水、海泥、近海土壤、海洋动物以及海洋植物样品中,分离出海洋放线菌22株,采用平板对峙培养法测定不同放线菌菌株的抑菌作用,有9个放线菌菌株有抑菌作用。其中ZW-1菌株的抑制活性最强,该菌株及其发酵液对供试的小麦雪腐镰刀菌(Fusarium nivale)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、斑点落叶病菌(Alternaria alternata)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、菠菜早疫病菌(Alternaria solani)、玉米圆斑病菌(Helminthosporium carbonum)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)等8种植物病原真菌都有较强的抑制作用,可导致病原真菌菌丝细胞壁膨大,原生质体收缩,同时可抑制菠菜早疫病菌(A. solani)分生孢子的萌发和芽管的伸长。通过培养特性、细胞形态观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析,将海洋放线菌ZW-1菌株鉴定为梅久兰链霉菌(Streptomyces mediolani)。     

一株生防菌LX-07的鉴定及其拮抗物的理化特性

LX-07菌株是从玉米根系土壤中分离筛选获得的一株具有抗真菌活性的细菌,通过菌落、菌体形态及16SrDNA序列分析,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。抑菌谱测定结果表明,该菌产生的拮抗物对常见植物病原真菌具有不同程度的拮抗作用,表现广谱抗真菌活性。以链格孢霉作为指示菌,对拮抗物的理化特性进行了研究,结果表明:拮抗物在pH8.0下,在40～100℃范围内,抑菌活性不发生变化,121℃处理30min后抑菌活性略有下降,但仍为对照的90%以上;在室温下,pH2.0～12.0范围内拮抗物保持稳定,抑菌活性不受影响;拮抗物对胰蛋白酶不敏感,对胃蛋白酶、蛋白酶K敏感。     

哈密瓜(Cucumis melo L.)致腐真菌的鉴定

研究从哈密瓜表面分离出引起其腐败的菌株A和菌株B,并采用显微镜形态学观察、表型特征和分子生物学三种方法对其进行鉴定。结果发现菌株A可利用碳源包括杏苷、糊精、D-半乳糖、D-葡萄糖酸、麦芽糖、肝糖、L-鼠李糖、L-山梨糖、L-乳酸等72种碳源,其ITS rDNA序列与尖孢镰刀菌甜瓜转化型(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)的同源性为99%,分支长度为0.00。菌株B可利用碳源包括L-阿拉伯糖、D-果糖、丙三醇、蔗糖和木糖醇等54种碳源,其ITS rDNA序列与链格孢菌(Alternaria alternata)的同源性为100%,分支长度为0.00。因此,推断菌株A为尖孢镰刀菌甜瓜转化型,菌株B为链格孢菌。     

南瓜皮提取物的体外抑菌活性

为了揭示南瓜较长贮存期与其皮部活性物质功能之间的关系,通过使用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、水5种不同极性强度的溶剂对南瓜皮进行连续梯度提取,采用孢子萌发抑制法、琼脂孔扩散法和对倍稀释法测定了不同提取物对5种真菌:扩展青霉(Penicillium expansum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黑根霉(Rhizopus stolonifer)、互格交链孢(Alternaria alternate)和粉红单端孢(Trichothecium roseum)和5种细菌:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄葡萄球菌(Staphylicoccus aureus)、荧光假单孢杆菌(Pseudomonas fluorescence)和乳酸菌(Lactobacillus plantarum)的抑菌活性和最低抑菌浓度;并用扫描电镜观察了水提取物对菌体形态的影响。结果表明:除石油醚提取物外,四种提取物对供试菌有不同程度的抑制活性,其中水提取物的抑菌活性最强,水提取物处理使菌体外表形态发生明显的伤害性变化。初步说明南瓜皮中的预存抗菌物质是有助于南瓜较长贮存期的一个因素。     

野生牛肝菌内生真菌分离鉴定及其生物学特性

采用组织分离法从黄皮疣柄牛肝菌、小美牛肝菌、双色牛肝菌的子实体中,分离纯化获得4株内生真菌,经菌落、菌丝、孢子形态学观察及rDNA ITS分子生物学鉴定,结果显示:菌株LCTG-12为盖姆斯木霉(Trichoderma gamsii)、LCCK-6为克鲁伊假丝酵母(Candida kruisii)、BSHC-18为黄瘤孢菌(Hypomyces chrysospermus)、BBFO-10为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysprum)。对4株内生真菌生物学特性进行研究,其中盖姆斯木霉菌丝生长速度较快,在CPDA培养基上,25 ℃培养5 d菌丝长满平板;液态培养时,该菌株在25 ℃、摇床转速160 r/min、pH5.5、8 d,可获得菌丝干基生物量4.13 g/L。平板对峙实验结果:盖姆斯木霉LCTG-12对黄瘤孢菌BSHC-18和尖孢镰刀菌BBFO-10菌丝生长均有拮抗作用,并且,黄瘤孢菌BSHC-18和尖孢镰刀菌BBFO-10两者之间也具有拮抗作用,表明牛肝菌内生真菌中盖姆斯木霉对腐败菌具有拮抗作用,可为生物防腐提供优良的菌株。     

一株农用拮抗放线菌的分离与鉴定

为烟草土传病害生物防治研究提供菌株资源,采用稀释平板法分离洛阳地区烟草根际土壤样品中的优势拮抗放线菌,平板对峙培养法与抑制菌丝生长速率法测定放线菌菌株的拮抗作用,16S rDNA分析鉴定菌株种类。结果表明:从烟草根际土壤中共分离、纯化获得108个放线菌单菌落,其中22株对瓜果腐霉、烟草疫霉、尖孢镰刀菌的至少一种有拮抗作用,菌株SA74对3种病原真菌的抑菌率均大于50 %。根据形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析,该菌株被鉴定为金黄垂直链霉菌（Streptomyces aureoverticillatus）。