猪脂联素球状结构域gAd蛋白在重组乳酸乳球菌中表达条件的优化

为获得含猪脂联素球状结构域gAd基因的重组乳酸乳球菌的高效表达,对其表达条件和培养基配方进行了优化。首先采用单因素分析法确定重组乳球菌最佳诱导剂浓度、诱导时间点(OD600)和诱导后培养温度,以及培养基中的乳糖浓度、氮源浓度、Na2HPO4浓度和MgSO4浓度对表达量的影响;之后通过正交试验,确定重组乳酸乳球菌的最佳表达条件。结果显示,其最佳诱导剂nisin浓度为30ng/mL、诱导的时间点是OD600≈0.4、诱导后培养温度为25℃;最佳培养基配方是:乳糖添加量为7%、大豆蛋白胨为2.7%、酵母膏为1.3%、Na2HPO4浓度为0.25%、MgSO4浓度为0.02%。优化后,脂联素的表达量为29.4%的总蛋白含量。     

乳糖诱导D-塔格糖3-差向异构酶基因在大肠杆菌中的表达

以D-塔格糖3-差向异构酶高效表达菌株BL21(DE3)/pET22b-cbdte为研究对象,考察乳糖作为诱导剂诱导D-塔格糖3-差向异构酶在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的可行性.在摇瓶发酵条件下,从诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等四个方面,研究诱导条件对目的蛋白表达的影响.结果表明,工程菌培养至对数生长中期OD值为1.0左右后,加入终浓度为5g/L的乳糖,于20℃的条件下诱导7h,可获得最大酶活.与异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)最适诱导条件相比,优化后的乳糖诱导酶活提高82.7％,可溶性目的蛋白的表达量提高99.5％,菌体生物量提高30.5％.研究结果为乳糖作为诱导剂应用于D-塔格糖3-差向异构酶的工业化生产提供有益的参考和借鉴.     

重组大肠杆菌生产TaqDNA聚合酶发酵工艺优化

Taq DNA聚合酶是PCR技术中广泛应用的耐热酶。为提高重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶的产量，以Taq DNA聚合酶产量和酶的比活力为考察指标，通过单因素实验优化产生Taq DNA聚合酶含量的单因素：发酵温度、pH值、IPTG诱导剂用量、诱导时间、接种量，结果表明：发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度，对该基因工程菌发酵产Taq DNA聚合酶的比酶活力有显著影响，而诱导培养时间、接种量对产Taq DNA聚合酶的比酶活力影响不显著。故选择发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度作为响应面的三个因素优化重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶发酵工艺，响应面分析结果显示对酶的比活力显著性顺序为：IPTG诱导剂浓度>发酵温度>pH值，最佳发酵工艺参数为：发酵温度37.2℃，pH值为7.5,IPTG诱导剂浓度为0.800 mmol/L，在此条件下发酵，Taq DNA聚合酶比活力达到（43.822±0.878）kU/mg。     

乳糖诱导大肠杆菌产褐藻胶裂解酶的条件优化

本文研究了使用乳糖替代IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导褐藻胶裂解酶在重组大肠杆菌中表达的可行性,通过摇瓶实验,分别对诱导终浓度、诱导温度、诱导时机、诱导时间等方面进行了单因素实验并利用响应面对条件进行了优化设计,并使用Ni-NTA亲和柱对粗酶液进行了纯化得到纯酶。结果表明,诱导乳糖终浓度22 mmol/L,诱导温度29℃,诱导22 h,酶活可达到8.552 U/m L。说明乳糖可以作为基因工程菌的高效诱导剂。     

乳糖诱导葡萄球菌肠毒素A基因在大肠杆菌中的表达

以乳糖作为诱导剂代替传统方法中的IPTG,分别从菌龄、诱导剂浓度、诱导时间及诱导剂的添加方式等方面,对乳糖诱导金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxins A,SEA)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达进行了研究。结果表明,重组大肠杆菌表达SEA的优化条件为:在对数生长期(OD600约为0.6),一次性添加终浓度为0.5 mmol/L的乳糖诱导6 h。目标蛋白的表达量占菌体总蛋白质的36.9%,略低于以IPTG为诱导剂时38.1%的表达量。乳糖价格仅为IPTG的1%左右,因此,在SEA的大规模制备中,使用乳糖作为诱导剂可以大大节约成本。     

乳糖诱导基因工程菌产β-葡聚糖酶及其酶学特性的研究

考察了乳糖替代IPTG诱导重组大肠杆菌产β-葡聚糖酶的可行性,分别对乳糖作为诱导剂时的终浓度、诱导时机、诱导时间和温度等方面进行了研究。结果表明,工程菌培养6h（OD600达到0.7左右）后,加入终浓度为10mmol/L的α-乳糖,升温至41℃,诱导6h,酶活可达到830.7U/mL。与IPTG相比,酶活提高2倍左右,发酵周期缩短70%。该酶pH稳定范围较宽,热稳定性良好,在生理温度（70℃左右）下活性高,说明乳糖可以作为基因工程菌的高效诱导剂。     

重组大肠杆菌BL21（DE3）-pET28a（＋）-bgl诱导表达β-葡聚糖酶的条件优化

研究自行构建的产β-葡聚糖酶的工程菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl在LB培养基中的生长特性,考察种子液的菌龄、培养基起始pH、接种量及诱导起始时发酵液菌浓度等对β-葡聚糖酶产生水平的影响;通过正交试验确定诱导剂IPTG及乳糖添加量、诱导温度及诱导剂作用时间.结果表明:培养基起始pH 7.0,对数生长中期的种子液(OD600为0.35)以接种量(体积分数)10%接入摇瓶发酵培养,37 ℃,200 r/min培养约3 h,菌液OD值达到1.0左右,添加终浓度分别为0.033 6 mmol/L的IPTG及10 mmol/L乳糖,24℃诱导6 h,发酵液清液中酶活达到最高(336.33 U/mL),菌体生长量为1.12 g/L,发酵液中总酶活达到459.32 U/mL,是原始菌株在相同条件下所产酶活的6.62倍.采用优化培养条件及诱导剂作用条件,重组菌在TB培养基中酶活水平进一步提高,诱导剂作用10 h,发酵清液中酶活为1 090.31 U/mL,总酶活1 570.83 U/mL,是原始菌在该条件下酶活的19.73倍,显示出重组菌具有广阔的工业化应用前景.     

乳糖诱导极耐高温木聚糖酶基因B在大肠杆菌中的表达

以融合极耐高温木聚糖酶基因B(XynB)的大肠杆菌(E coli)BL2 1(DE3)为研究对象,研究了以IPTG和乳糖作为诱导剂时重组目的产物的诱导表达规律。在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间、诱导培养温度及初始pH对目标蛋白表达的影响。实验结果表明,IPTG诱导时酶活力达到16 18U/ 10 0mL。乳糖诱导的最优发酵条件为:初始培养基pH 7 0 ,当OD60 0 为2 5时加入0 5 %的乳糖,在37℃条件下诱导培养10h ,收获时OD60 0 达3 5 5 ,酶活力为2 5 91U/ 10 0mL。     

IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达

研究异丙基硫代-β-D-呋喃半乳糖苷（isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达的效果。在利用IPTG和乳糖分别作为诱导剂对右旋糖酐蔗糖酶工程菌Escherichia coliBL21（DE3）/pET28-dexYG进行诱导表达的基础上,尝试将此两种诱导剂联合使用,在降低成本的同时获得较好的表达效果。在获得最佳培养基的基础上,考察菌体IPTG与乳糖的联合加入量、菌体浓度、诱导时间对右旋糖酐蔗糖酶表达的影响。在菌浓（OD600 nm）达到3.0时,加入0.1 mmol/L IPTG 95 μL＋2.5 g/L乳糖,25 ℃混合诱导培养4 h,酶活力最高,达到40.44 U/mL。IPTG与乳糖联合诱导重组大肠杆菌右旋糖酐蔗糖酶表达可行。     

Bohai sea-9145重组脂肪酶基因工程菌的发酵表达条件优化

为提高大肠杆菌(E.coli)基因工程菌产Bohai sea-9145重组脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)的能力,有效制备Bohai sea-9145脂肪酶。采用单因素实验、Plackett-Burman实验和Box-Behnken响应面设计实验,对该重组酶基因工程菌的发酵表达条件进行了优化。最终确定的最佳条件是:接种量为1.5%,培养基的初始p H为8.0,诱导剂IPTG的添加时间为3.5 h,终浓度为0.5 mmol/L,诱导时间为15 h,诱导温度为16℃,摇床转速为200 r/min,经优化后该菌的产酶量是优化前的9.72倍。     

重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件的优化

目的：优化重组蛋白LuxS诱导表达及纯化条件,提高具有生物活性的重组蛋白LuxS的表达量,为体外合成自诱导物2（autoinducer-2,AI-2）奠定基础。方法：采用单因素试验,优化诱导培养基、诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）的浓度;采用Ni-NTAPurification System对重组蛋白进行纯化,比较Native Elution Buffer的咪唑浓度和pH值对重组蛋白纯化的影响,确定最佳的Native Elution Buffer;对比蛋白与树脂结合时不同缓冲液的纯化效果,选择最优的结合缓冲液。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为：以LB培养基为诱导培养基,菌液OD600 nm为0.6～0.8,IPTG浓度为0.1 mmol/L,诱导温度为37 ℃,诱导时间为12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸盐缓冲液作为蛋白与树脂结合的缓冲液,含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作为蛋白洗脱液。使用分离获得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性约为阳性对照的6 倍。结论：本研究成功优化了重组蛋白LuxS的诱导表达及纯化条件,获得了具有生物活性的重组蛋白,并成功合成了AI-2。     

重组环糊精葡萄糖基转移酶温控型工程菌的构建及其培养条件的优化

采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）法从蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）中扩增了β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-cyclodextrin glucanotransferase,β-CGTase）基因,将该基因克隆到pBV220质粒中,转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选和酶切验证后,得到能表达β-CGTase的重组大肠杆菌E.coliDH5α/pBVcgt。通过对工程菌产酶条件的优化,得到最佳产酶条件为：OD600 nm值达到1.0、初始培养温度30 ℃、发酵培养基初始pH 8.0、温度梯度诱导39 ℃培养0.5 h,40 ℃培养0.5 h,41 ℃培养1 h,42 ℃培养2 h。酶活力由优化前的445 U/mL提高到956 U/mL,酶活力提高了1.15 倍。温度梯度诱导比直接诱导酶活力提高20%。该酶的克隆表达以及发酵条件的研究表明,该酶能在大肠杆菌原核表达体系中高效表达。     

鲢鱼重组Cystatin的原核表达、鉴定及对铜绿假单胞菌的抑制作用

本实验主要对鲢鱼半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并研究重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果。首先用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导转入pET-30-Cystatin的E.coli BL21（DE3）表达重组Cystatin蛋白,经Ni2+-NTA镍离子亲和层析对其进行纯化,该重组蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示单一条带,分子质量约20.6 kD,在TSK-GEL G2000SW凝胶过滤高效液相色谱上呈单一活性峰,纯度为94.27%,经标准曲线计算其分子质量为20.9 kD;其次,利用抑制剂滴定曲线法,以偶氮酪蛋白为底物,确定重组Cystatin对木瓜蛋白酶（45.375 μmol）的一个抑制活性单位为0.718 μg;最后通过滤纸片扩散法鉴定鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果,结果表明Cystatin的添加量为20、60、120、200 U/片时,抑菌圈直径分别为8、9、13、26 mm。鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果呈剂量依赖关系。     

重组枯草芽孢杆菌PaE菌株的构建及碳代谢阻遏效应研究

通过基因重组的方法,将枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶基因amyE（除掉启动子）整合在Paxo1质粒上,然后将重组表达质粒Paxo1-amyE导入枯草芽孢杆菌168菌株基因组中的半乳糖苷酶基因lacZ位点。通过转化筛选和重组基因分析,获得含有重组α-淀粉酶基因的工程菌株PaE。经过添加4 种不同的碳源发酵实验检测,在外加2 g/100 mL木糖诱导的情况下,重组菌株的α-淀粉酶产量均有增加。而且重组菌株在一定程度上能够克服葡萄糖等还原性糖引起的碳代谢阻遏现象,提高了α-淀粉酶产量。     

α-硫辛酸和乙酰左旋肉碱改善炎症细胞因子介导胰岛细胞功能障碍的作用

目的:探讨α-硫辛酸(α-lipoic acid,LA)和乙酰左旋肉碱(acetyl-L-carnitine,ALC)改善炎症细胞因子介导胰岛细胞功能障碍的效果并探讨机制。方法:大鼠胰岛素瘤RIN-m5f细胞用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)联合作用(TII)48 h造成损伤模型。LA和ALC干预48 h后噻唑蓝法检测胰岛细胞的活力情况,荧光细胞技术法检测细胞的形态学,流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)表达水平,放射免疫法检测胰岛素分泌情况,Western blotting检测细胞凋亡相关和胰岛素分泌相关蛋白表达情况。结果:TII作用48 h可使RIN-m5f细胞活力明显下降,凋亡增加;并降低基础状态下和高糖刺激状态下胰岛素分泌水平;增加ROS水平,增加一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性,增加一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)水平,促进NF-κB向细胞核转位;TII还可增加RIN-m5f细胞内促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达,抑制抗凋亡蛋白I-κB、Bcl-2表达,增加线粒体细胞色素c释放。而LA、ALC可改善TII诱导的RIN-m5f细胞凋亡,提高基础状态和高糖刺激状态下胰岛素分泌水平;抑制NF-κB向细胞核转位、降低细胞NO水平;降低Bax、Caspase-3表达,增加抗凋亡蛋白I-κB、Bcl-2表达,抑制线粒体细胞色素c释放;LA与ALC联合作用效果强于单独作用。结论:炎症细胞因子作用48 h可通过ROS-cytochrome c-NF-κB-NOS-NO通路最终引起胰岛β细胞的凋亡,进而影响胰岛素分泌;LA和ALC联用可抑制炎症细胞因子诱导的胰岛细胞凋亡,促进胰岛素分泌。     

抗孔雀石绿单链抗体-碱性磷酸酶融合表达和活性鉴定

采用重叠延伸的方法成功将抗孔雀石绿（malachite green,MG）单克隆细胞的轻链VL和重链VH用连接肽(Gly4Ser)3连接,形成单链抗体（single chain variable fragment,scFv）基因,并将其酶切连接进入含有碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,PhoA）基因的载体plip6/GN中,成功构建重组质粒plip6/GN-MG-scFv。随后重组质粒转入大肠杆菌BL21,经诱导表达后,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting鉴定结果表明所获得的融合蛋白scFv-PhoA大小约72 kD。利用scFv与MG特异性结合的活性和PhoA催化对硝基苯磷酸二钠的显色机制,经过直接竞争酶联免疫吸附法测定融合蛋白scFv-PhoA的IC50为9.81 ng/mL。本方法操作简单、灵敏度高且检测时间短,这为进一步进行MG免疫法快速检测提供了参考。     

β-淀粉酶的表达与酶学性质

本研究在构建重组表达质粒p PIC-BBA的基础上,构建并筛选获得了高分泌表达大麦β-淀粉酶的重组巴斯德毕赤酵母GS-BBA。重组酵母在摇瓶发酵条件下,能够分泌表达180 U/m L的β-淀粉酶酶活力。进一步对该重组酶的酶学性质进行了分析,重组β-淀粉酶的最适作用温度为55℃,最适作用p H值为5.0,在不高于55℃和在p H 3.0~10.0之间有良好的热稳定性和p H值稳定性。重组酶水解淀粉的主要产物为麦芽糖,在普鲁兰酶的协助下,其水解淀粉形成麦芽糖的最大转化率为78.28%。     

花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全cDNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与pMD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21（DE3）宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145 个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 kD,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。     

假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶基因的克隆及表达

利用聚合酶链式反应从假肠膜明串珠菌中扩增出甘露醇脱氢酶（mannitol dehydrogenase,MDA）基因的结构基因,克隆入表达载体pETDuet-1,构建了甘露醇脱氢酶表达质粒pETDuet-1-mdh,将其转化进入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达。假肠膜明串珠菌甘露醇脱氢酶结构基因长度为1 017 bp,重组甘露醇脱氢酶基因在大肠杆菌内成功表达,其蛋白质分子质量为36.0 kD;重组甘露醇脱氢酶活力为0.15 U/mg pro,高于假肠膜明串珠菌中甘露醇脱氢酶活力0.03 U/mg pro。