糖基化方法对于大豆7S球蛋白糖基化反应及产物的影响

针对传统的两种糖基化接枝方法和改进方法从糖基化反应程度进行系统比较,并对产物氨基酸组成进行分析,以期进一步揭示蛋白质糖基化方法对于糖基化反应过程及产物的影响机制。本文利用干热法、湿热法和加压辅助湿热三种糖基化方法,对大豆7S球蛋白和葡聚糖的糖基化产物从反应程度、氨基酸组成等方面进行研究发现,结果表明:三种制备方法的反应程度高低顺序依次为:湿热法>加压辅助湿热法>干热法,说明压力能够对Maillard反应的进行具有一定的抑制作用,可以控制反应向理想阶段进行。大豆7S球蛋白和葡聚糖的糖基化主要发生在蛋白质肽链上的赖氨酸和精氨酸侧链上的自由氨基,干热法与其它两种方法相比糖链更有易于和精氨酸侧链上的自由氨基发生共价交联,而湿热法和加压辅助湿热法相比糖链更易于和赖氨酸侧链上的自由氨基发生共价交联。     

糖基化改性对大豆蛋白抗原性及结构特性的影响研究

本文以大豆分离蛋白和葡聚糖为原料,在干热条件下进行美拉德反应,制取不同时间下的糖基化复合物。以β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白抗原抑制率为指标,采用间接竞争ELISA方法测定糖基化产物的抗原性,在反应6 d时,糖基化产物中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原性分别降低了31.94%和21.26%。糖基化产物颜色加深,且游离氨基含量降低,说明大豆蛋白与糖发生了不同程度的反应。红外光谱中糖链的引入,使蛋白质分子展开,β-转角和无规则卷曲结构含量的降低,影响了β-伴大豆球蛋白α亚基的抗原表位,从而可能使大豆蛋白的抗原性降低。糖基化反应影响抗原性的关键作用在于蛋白与糖结合部位对蛋白质结构的变化。     

糖基化改性对大豆蛋白抗原性及结构特性的影响

以大豆分离蛋白和葡聚糖为原料,在干热条件下进行美拉德反应,制取不同时间下的糖基化复合物。以β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白抗原抑制率为指标,采用间接竞争ELISA方法测定糖基化产物的抗原性,在反应6 d时,糖基化产物中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原性分别降低了36.90%和18.12%。糖基化产物颜色加深,且游离氨基含量降低,说明大豆蛋白与糖发生了不同程度的反应。红外光谱中糖链的引入,使蛋白质分子展开,β-转角和无规则卷曲结构含量降低,影响了β-伴大豆球蛋白α亚基的抗原表位,从而可能使大豆蛋白的抗原性降低。糖基化反应影响抗原性的关键作用在于蛋白与糖结合部位对蛋白质结构变化的影响。     

糖基化对大豆7S球蛋白凝胶流变性质的影响(Ⅱ)

基于Maillard反应的机理,采用干热法分别制备出β-伴大豆球蛋白和不同分子量葡聚糖(67 kDa、150 kDa、500 kDa)的三种糖基化产物,从大豆7S球蛋白的热致凝胶性质出发,通过对不同链长糖基化产物的流变学性质和微观结构的研究,研究糖基化对于大豆7S球蛋白热致凝胶的影响机理,结果显示,葡聚糖以非共价键接入蛋白质肽链和以共价键接入的糖链所起的空间位阻作用给予大豆7S球蛋白热致凝胶体系的作用机制不同,并且以共价键结合的葡聚糖能够和蛋白质分子均匀的分布在凝胶网络结构中,不会引起相分离。     

糖链长度对于大豆7S球蛋白糖基化产物构象及乳化特性的影响

本文研究了3种糖链长度的葡聚糖和大豆7S球蛋白的糖基化产物,分析糖链长度对Maillard反应程度、产物构象和产物乳化性方面的影响机制,研究显示,分子量在67~150 u范围的葡聚糖反应程度明显高于分子量为500 u葡聚糖和蛋白质的糖基化反应;以共价键形式结合入蛋白质肽链的葡聚糖,不会改变大豆7S球蛋白二级结构的主要结构（β-结构）,主要增加了蛋白质二级结构中的无规则卷曲结构,三级结构中,随着糖链的延长,较大程度地屏蔽掉近紫外区有信号的芳香族氨基酸圆二信号,尤其是苯丙氨酸特征信号逐渐减少;随着糖链的延长,糖基化产物的空间位阻效应增加,乳化性逐渐提高,分子量为500 u葡聚糖链长与另外两种相差比较大。     

碳-13核磁共振波谱法对甲醛和胶原交联反应的研究

本文以碳-13富集的甲醛为交联剂,用核磁共振波谱法对甲醛和明胶的交联反应进行了直接跟踪和详尽研究。使此反应的过程,交联反应发生的方位及其结果得到了更为客观的认识。结果表明,和蛋白质反应的主要成分是甲醛单体(水合物)而非聚合物。其次,交联反应所形成的亚甲基桥是在赖氨酸(或羟基赖氨酸＊)的侧链氨基和精氨酸的侧链胍基之间,反应属典型的曼尼克反应(Mannich Reaction)。而不是在赖氨酸的侧链氨基之间。此反应也有少量精氨酸胍基的羟亚甲基衍生物生成。(＊以下只用赖氨酸来代替二者)     

糖基化方法对于大豆7S球蛋白糖基化产物构象及功能特性的影响

针对传统的两种糖基化接枝方法和一种改进方法从糖基化产物构象和产物功能特性方面对三种糖基化方法进行研究比较,以期进一步揭示不同糖基化方法对于蛋白质糖基化反应及产物的影响机制,结果表明:水相体系比固相体系对于蛋白质空间结构影响更大,二级结构中,湿热法和水热法的制备产物α-螺旋含量均减少,三种糖基化产物二级结构的主要结构与大豆7S球蛋白一样仍以β-结构为主,接入糖链导致蛋白质的二级结构无规则卷曲含量都增加;三级结构中,干热法对于三级结构的变化影响不明显,然而湿热法和水热法对于蛋白质分子的三级结构有显著的影响;三种糖基化产物的主要功能特性溶解性、乳化性和热稳定性均有提高,干热法产物在溶解性和乳化性方面均优于其它两种方法,热稳定性三种方法差异性不大。     

大豆球蛋白与葡聚糖的干热反应特性

研究了大豆球蛋白（glycinin）-葡聚糖共价复合物的乳化活性变化。得出在60℃、79％RH条件下，7S球蛋白与葡聚糖干热反应4d所得产物的乳化活性改善最明显；11S球蛋白与葡聚糖千热反应1d产物乳化活性最好。另外，7S-葡聚糖共价复合物在酸性和强碱性以及高温条件下乳化活性相当稳定；而11S与葡聚糖千热1d所得共价复合物在酸性及高温条件下乳化活性明显降低，碱性条件下乳化活性稳定。大豆球蛋白（giycinin）与葡聚糖的共价复合物在高盐条件下均能保持良好的乳化活性．     

牛血清白蛋白-葡聚糖接枝改性及机理研究（Ⅰ）

分别采用干热和湿热两种方法制备牛血清白蛋白和葡聚糖Maillard 反应产物,并对其性质进行研究。产物褐变程度及SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分别表明：干热法反应中Maillard 高级阶段反应程度较弱,反应产物分子量分布较广;湿热法有利于反应向Maillard 高级阶段进行,反应产物分子量分布较为集中。PAS 染色结果证明,两种Maillard反应方法均生成不同接枝程度的糖基化产物,并采用分子排阻色谱分析两种反应体系中Maillard反应产物结构特征。     

干法糖基化改性提高大豆分离蛋白的乳化性

在干热条件下,大豆分离蛋白与葡聚糖两种大分子通过Maillard反应进行共价键合,以共价物的乳化活性为指标,确定影响糖基化蛋白乳化活性的因素依次为:反应温度＞反应时间＞pH＞底物配比,最佳工艺条件为:反应温度70℃,反应时间24 h,糖-蛋白(2:1),pH 8.0.以共价物的乳化稳定性为指标,确定了影响糖基化蛋白乳化稳定性的因素依次为:底物配比＞反应时间＞反应温度＞pH.最佳工艺条件为:糖-蛋白(3:1),反应时间24 h,反应温度70℃,pH8.0.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证了大豆分离蛋白与葡聚糖发生了接枝反应.     

植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠免疫调节作用初步研究

目的:探讨植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠免疫调节功能的影响。方法:将健康的BALB/c小鼠随机分为4组,即正常对照组、乳酸菌低剂量组、乳酸菌中剂量组、乳酸菌高剂量组。灌胃不同剂量植物乳杆菌KLDS 1.0318菌悬液后,分别测定各组脾脏指数和胸腺指数,脾淋巴细胞增殖、NK细胞活性、巨噬细胞能量代谢水平,巨噬细胞吞噬能力。结果:与正常对照组相比,植物乳杆菌KLDS 1.0318中、高剂量组能够显著提高小鼠的脾脏和胸腺指数,同时能够促进脾淋巴细胞增殖,增强小鼠NK细胞活性,提高小鼠巨噬细胞吞噬中性红能力及其能量代谢水平。结论:植物乳杆菌KLDS 1.0318可以通过促进机体的特异性免疫和非特异性免疫功能来增强机体的免疫作用。     

植物乳杆菌KLDS 1.0318产酸、耐酸、耐胆盐能力及其免疫特性研究

目的:通过体外实验,研究植物乳杆菌KLDS 1.0318的生长曲线、产酸能力、耐酸耐胆盐性能,在此基础上对其可能的免疫调节活性进行研究。方法:采用平板计数法和紫外-可见分光光度法测定菌株生长曲线,pH计测定其产酸能力,平板计数法测定该菌株在酸性及高胆盐环境作用后的活菌数及存活率。采用CCK-8法观察不同剂量的植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠脾淋巴细胞增殖能力以及对小鼠腹腔巨噬细胞能量代谢水平的影响,采用巨噬细胞吞噬中性红法评估不同剂量的植物乳杆菌KLDS 1.0318对巨噬细胞吞噬作用的影响。结果:植物乳杆菌KLDS 1.0318在4 h后进入对数期,12 h后达到稳定期。其产酸能力较强,pH在12 h后降至4.16。菌株在pH为2.5、3.5条件下培养至3 h时,其存活率分别为91.20%、97.50%,在胆盐质量浓度分别为0.3、0.5 g/100 mL的培养基中作用4 h后,其存活率分别为95.40%、87.76%。一定剂量的植物乳杆菌KLDS 1.0318能够促进脾淋巴细胞和巨噬细胞活性,并呈现剂量依赖关系。结论:植物乳杆菌KLDS 1.0318生长较快,具有较强的产酸、耐酸、耐胆盐能力,并具有潜在免疫调节功能。     

与特定乳酸菌共培养对植物乳杆菌KLDS1.0391细菌素合成的诱导作用

植物乳杆菌KLDS1.0391与76株乳酸菌分别共培养后,测定培养物的抑菌活性和活菌数,判断与乳酸菌共培养对植物乳杆菌细菌素合成的影响及细菌素合成与菌体密度的关系。结果表明：植物乳杆菌KLDS1.0706、KLDS4.0315、KLDS4.0351、罗伊氏乳杆菌KLDS1.0736这4株菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养后,抑菌活性显著增加(P＜0.01)。与罗伊氏乳杆菌共培养过程中细菌素的抑菌活性与植物乳杆菌KLDS1.0391的细胞密度呈现明显的正相关性,并且发现只有活的诱导菌与植物乳杆菌KLDS1.0391共培养才能够诱导细菌素的合成。     

乳杆菌对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响

目的：体外评估7 种乳杆菌的免疫作用,探讨小鼠离体脾脏淋巴细胞在筛选免疫活性乳酸菌中应用的可行性。方法：用MTT 法观察不同种属、不同剂量的活性和热致死乳杆菌对小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响。结果：活性和热致死乳杆菌单独作用都能促进体外淋巴细胞增殖且均表现出剂量依赖关系,当活性和热致死乳杆菌剂量为107CFU/mL 时(即细菌与细胞的比例为10:1)的效果最为明显(P＜ 0.05),且活菌制剂的免疫调节作用优于热致死菌体 (P ＜ 0.05),其中活性罗伊氏乳杆菌、约氏乳杆菌和发酵乳杆菌刺激淋巴细胞的增殖指数(PI 值)明显较ConA诱导组高(P ＜ 0.05)。结论：正常离体小鼠脾脏淋巴细胞可用于体外初步筛选具有潜在免疫活性的乳杆菌,从而缩小用于动物实验的目标菌株的范围。     

三株植物乳杆菌降胆固醇机理的研究

测定了已筛选出的具有较高胆固醇去除能力和胆盐水解酶活性的3株植物乳杆菌(KLDS6.0330,KLDS6.0333,KLDS6.0335)的胆固醇同化作用,胆汁盐的去结合作用和胆固醇共沉淀作用。这3株植物乳杆菌能够同化较多的胆固醇(﹥43μg/mL);所有的菌株都表现出了对甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的去结合作用,与牛磺胆酸钠相比,甘氨胆酸钠的去结合能够释放较多的胆酸;所有菌株都表现出了胆固醇与甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠去结合释放胆酸的共沉淀,与牛磺胆酸钠相比,甘氨胆酸钠去结合产生的胆酸表现出了与较多的胆固醇共沉淀;随着pH值的下降,解聚态的胆汁酸与胆固醇的共沉淀量增加,结合态胆盐与胆固醇的共沉淀量较少。结果表明这3株植物乳杆菌在体外可以通过3种机制去除胆固醇。     

一株植物乳杆菌体内降胆固醇的作用机制

目的:通过构建高胆固醇血症模型小鼠评价该菌株对小鼠体内胆固醇代谢及相关基因表达的影响。方法:以健康C57BL/6雄性小鼠为对象,设置空白组、模型组、低剂量组、高剂量组、普伐他汀对照组,分别以生理盐水、KLDS1.0386悬浊液和普伐他汀连续灌胃4周,检测小鼠血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平;采用Western blotting法检测小鼠肝脏胆固醇几个关键基因(HMGCR,LDLR,SREBP2,CYP7A1,FXR)表达水平的变化。结果:灌胃KLDS1.0386后,高剂量组小鼠血清甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白水平明显降低(P<0.05);HMGCR和FXR的表达明显受到抑制(P<0.05),CYP7A1的表达量增加(P<0.05)。结论:获得一株在体内具有高效降胆固醇能力的植物乳杆菌KLDS1.0386,该菌可用作降胆固醇的益生菌。     

母乳婴儿源乳杆菌的筛选及其免疫调节能力研究

以分离自母乳婴儿源的乳杆菌——鼠李糖乳杆菌BF-1、植物乳杆菌BF-15、唾液乳杆菌BF-29、干酪乳杆菌BF-55为对象,研究这些菌株对体外模拟人工胃、肠液及胆盐的耐受性,对Caco-2细胞的黏附能力、安全性和对小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响,探讨菌株的免疫调节活性。试验结果表明:植物乳杆菌BF-15对人工消化液和胆盐有较强的耐受性,对Caco-2细胞黏附能力[(7.10±0.30)CFU/cell]显著高于阳性对照菌株LGG[(3.90±0.30)CFU/cell](P<0.05);BF-15除对氨基糖苷类、糖肽类抗生素的固有耐药性外,对苯唑西林、头孢噻吩也有耐药性,无抗性质粒;BF-15和LGG的活性和热致死菌在一定的菌浓范围(1×10^6~10^7CFU/mL)均促进体外小鼠淋巴细胞增殖,表现出剂量依赖关系,同时活性菌株作用效果明显优于热致死菌株。在相同菌浓条件下,两株菌体外免疫调节能力没有显著性差异(P>0.05)。母乳婴儿源乳杆菌——植物乳杆菌BF-15具有较强的抗逆性,较高的黏附性和一定的免疫调节能力。     

卵转铁蛋白体外免疫活性研究

研究卵转铁蛋白(OVT)的体外免疫活性。分别采用中性红吞噬法测定卵转铁蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响;MTT法测定卵转铁蛋白对小鼠腹腔巨噬和脾淋巴细胞增殖作用的影响;双抗体夹心ELISA法测定卵转铁蛋白对脾淋巴细胞IL-2分泌水平的影响。结果表明,OVT能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞对中性红吞噬能力(P<0.01),协同LPS促进腹腔巨噬细胞的增殖(P<0.05),并显著改善由CsA引起的对小鼠腹腔巨噬细胞增殖活性的抑制作用(P<0.05);OVT能显著促进脾淋巴细胞的增殖(P<0.01),协同LPS和ConA促进小鼠脾淋巴细胞的增值(P<0.05),并能显著促进小鼠正常脾淋巴细胞IL-2的分泌(P<0.01)。在体外培养的条件下,卵转铁蛋白对正常小鼠免疫细胞的免疫能力有促进作用。     

鹰嘴豆肽抑制肿瘤作用和对免疫功能的影响

目的：探讨鹰嘴豆肽抑制肝癌H22细胞移植瘤的效果及对免疫功能的影响。方法：将小鼠随机分为正常对照组、阳性对照组、肿瘤对照组和鹰嘴豆肽低、中、高剂量组(50、100、200mg/(kg·d)),除正常组外,其余各组小鼠均在皮下接种肝癌H22细胞,建立肝癌小鼠模型。建模后第2天开始灌胃给药,连续给药10d。末次给药24h后拉托颈椎处死小鼠,测体质量、肿瘤大小、抑瘤率、胸腺指数、脾指数、巨噬细胞吞噬能力、脾细胞吞噬能力等。 结果：鹰嘴豆肽低、中、高3个剂量均可抑制H22肿瘤的生长,且没有阻碍小鼠体质量和免疫器官的增长。与肿瘤对照组相比,鹰嘴豆高剂量组可以显著提高小鼠迟发型超敏反应(DTH)的能力、淋巴细胞和巨噬细胞吞噬能力(P＜0.05),鹰嘴豆低、中剂量组对其也有一定的改善作用,但是没有表现出剂量依赖效应。 讨论：鹰嘴豆肽可能是通过增强H22肝癌小鼠的免疫功能来抑制肿瘤的生长,具体的作用机制还需要更深入的研究。     

一株产细菌素植物乳杆菌高密度发酵培养基的筛选及其在酸奶中的应用

目的:优化用于高密度发酵产细菌素的植物乳杆菌KLDS 1.0391的经济有效培养基,旨在生产具有益生作用的辅助发酵剂。方法:以发酵液中活菌数量和抑菌效果为指标,比较不同水解度的脱脂乳粉、乳清粉、麦麸,以及玉米浆粉的发酵效果,制备冻干形式的植物乳杆菌直投式发酵剂,将其添加至酸奶中,评价其对酸奶发酵时间、pH、滴定酸度、粘度和感官评价的影响,进而确定其在酸奶中应用的可行性。结果:确定脱脂乳粉、乳清粉和麦麸培养基的最佳水解度分别为15%、15%和20%;植物乳杆菌KLDS 1.0391在玉米浆粉培养基中获得的发酵效果最佳,活菌数量达到9.53 lg CFU/mL,抑菌圈直径达到12.69 mm。植物乳杆菌直投式菌种的添加对酸奶发酵时间和感官评价无显著影响(P>0.05),酸奶粘度下降,但可以缓解酸奶的后酸化程度。通过优化得到植物乳杆菌KLDS 1.0391高密度发酵的廉价培养基为:4%玉米浆粉,同时补充2%葡萄糖和0.1% Tween-80。结论:制得的植物乳杆菌直投式发酵剂可应用于酸奶生产中。