食品中动物源性成分的多重PCR快速检测

目的利用多重PCR技术对市售的多种食品进行检测,确定动物源性成分的种类,进行掺假及真伪鉴别。方法对鸡、猪、牛、兔、绵羊、山羊、马、鹿8种动物源性产品进行DNA提取,根据不同动物线粒体DNA设计特异性引物,根据脊椎动物细胞色素b基因mt DNA序列设计通用引物作为内源参照,对8种动物源性产品的DNA进行多重PCR扩增,同时对多种成分进行鉴定。结果琼脂糖凝胶电泳表明,此方法能同时扩增出8种动物的特异性条带,检测灵敏度达到0.01%。结论所建立的鉴定多种动物源性成分的新方法,操作简便、快速准确,可为各检验机构对食品进行检测提供方法指导。     

食品中马源性成分的实时荧光PCR检测

针对马线粒体DNA细胞色素b基因设计特异性引物和探针,建立食品中马源性成分实时荧光PCR检测方法,并经特异性和灵敏度试验验证其可行性。结果表明:该体系可扩增马DNA片段,长度为127 bp,其他常见畜、禽肉成分均无法正常扩增。该体系的检测灵敏度为1.25 pg马DNA和质量分数0.001%马肉粉。经市售食品的检测验证,表明所建立的马引物探针体系具有特异性好、灵敏度高、快速、高效等优点,可用于对食品中马源性成分的掺假鉴别检测。     

应用多重PCR检测食品中SARS病毒靶基因的初步研究

以分子生物学方法——聚合酶链式反应(PCR)技术为基础,初步探讨了食品中SARS病毒靶基因片段的多重PCR检测技术。根据GenBank公开发表的SARS病毒基因组cDNA序列,人工合成克隆特异性靶基因DNA片段,以此片段作为阳性对照,并将其添加到罐装蘑菇、牛肉干、大豆、鱼干等食品的cDNA中作为阳性样品,再根据世界卫生组织推荐的引物序列合成引物,进行单PCR与多重PCR检测分析。结果表明:以单PCR法获得了121bp、182bp及302bp3条靶基因片段;以二重PCR法获得了121bp+182bp、121bp+302bp与182bp+302bp的靶基因片段组合;以三重PCR法获得了121bp+182bp+302bp的靶基因片段组合。检测灵敏度的实验表明:182bp片段的模板DNA量在0.003ng以上时,单PCR都能扩出清晰的条带,而121bp的靶基因片段只有模板DNA量在0.03ng以上时,单PCR才能扩出清晰的条带。它们的二重PCR分析的灵敏度与相应的单PCR分析灵敏度相同。     

PCR法检测肉制品中鹅源性成分

目的 建立一种PCR法检测肉制品中鹅源性成分的方法。方法 根据鹅的线粒体DNA(mtDNA)序列设计引物, 以9种动物的DNA为模板, 利用新设计的鹅的特异性引物进行PCR反应, 并用琼脂糖凝胶电泳检测引物的特异性和敏感性。结果 通过PCR反应, 仅鹅的DNA扩增得到了194 bp的目的片段, 其余物种DNA和空白对照均无目的片段。扩增产物的核苷酸序列与GENBANK中检索到的相应序列基本相符合。 结论 该方法特异性强、灵敏度高, 适合检测肉制品中的鹅源性成分。     

食品中鲍鱼过敏源基因成分的检测

目的本文建立食品中鲍鱼过敏源基因成分实时荧光PCR检测方法。方法采用蛋白酶K消化法提取鲍鱼肌肉组织中基因组DNA,针对鲍鱼管家基因16S r RNA基因设计特异性引物和探针,确定实时荧光PCR反应体系和反应条件,建立了鲍鱼过敏源基因成分实时荧光PCR快速检测方法。选用鱿鱼、海参等海产品进行特异性试验;采用添加方法制备灵敏度试验样品,分别制备了鲍鱼过敏源基因成分含量分别为100%、10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%的样品。结果对非鲍鱼类食品进行检测,结果显示出良好的特异性;灵敏度试验表明,本文建立方法的最低检测下限为0.01%。结论本文建立了特异性好,灵敏度高的鲍鱼过敏源基因成分检测方法。     

烟草拟茎点霉快速检测方法的建立

为实现烟草拟茎点霉的快速准确检测,利用真菌rDNA-ITS通用引物对拟茎点霉和其他10种烟草病原菌基因组DNA进行了PCR扩增、片段回收及DNA测序,在序列比对基础上设计了两对特异性检测引物,并鉴定了引物的检测灵敏度和特异性,同时优化建立了PCR反应体系。结果表明,在退火温度为60 ℃时,两对特异性引物P2F/P3R和P3F/P3R从烟草拟茎点霉DNA样本中分别扩增出来420 bp和381 bp的特异性条带,而在其他10种烟草病原菌DNA以及阴性对照中均不能扩增到任何条带。两对特异性引物的检测灵敏度均达到10 pg/μL。建立的基于两对特异性引物P2F/P3R和P3F/P3R的分子检测方法可实现对病原菌烟草拟茎点霉的快速准确检测。      

实时荧光PCR在虹鳟源性成分鉴别中的应用

为鉴别食品中虹鳟源性成分,以线粒体ATP6 基因为靶点,设计虹鳟特异性聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）的引物、探针,利用实时荧光聚合酶链式反应（real-time fluorescent PCR,RT-PCR）技术,建立针对虹鳟源性成分的实时荧光PCR 快速检测方法;选取17 种市场上常见鱼类进行试验,结果均无扩增反应,同时通过DNA灵敏度试验,表明该研究建立的鉴别方法DNA 浓度灵敏度能达到0.1 ng/μL,且特异性良好。同时,利用该方法对市售的22 种商品三文鱼及其制品进行检测,结果显示10 种商品中含有虹鳟（Oncorhynchus mykiss）成分。该研究所建立的检测方法可用于对市售产品中虹鳟源性成分的鉴别,同时也表明虹鳟是市售三文鱼的主要鱼种之一。     

微滴数字PCR方法检测畜肉食品中鸭源性成分

目的利用微滴数字PCR技术,建立鸭源性成分的快速、特异、灵敏检测方法。方法根据鸭线粒体基因全序列设计的引物及探针,利用微滴数字PCR进行扩增,建立鸭源性成分检测方法;以市场中常见畜禽肉为参考物种作微滴数字PCR特异性检测;以羊肉为干扰物观察微滴数字PCR的抗干扰性;将鸭肉DNA进行梯度稀释,对方法灵敏度进行检测。结果该方法能够有效对鸭源性成分进行检测,特异性强,灵敏度高,并且其他物种成分的存在对方法灵敏度检测没有影响。结论该方法特异性强,灵敏度高,可以实现畜肉食品中的鸭源性成分检测。     

多重位点特异性PCR快速检测牛肉中常见掺假动物源性成分

目的:基于动物线粒体cytb基因的多态性位点,建立一种特异性多重PCR体系检测牛肉、猪肉和鸡肉的方法。方法:提取肉类的基因组DNA,利用不同物种mtDNA cytb基因序列的SNP位点的差异,设计特异性引物。进行多重PCR扩增,利用扩增产物片段大小不同,检测牛肉中常见的掺假动物源性成分。通过灵敏性试验,确定最低检测量。结果:实验设计的引物特异性良好,在同一反应体系中,在同一退火温度52℃条件下,牛肉DNA扩增后产生149 bp的特异性条带,猪肉DNA扩增片段为261 bp,鸡肉DNA扩增片段为554 bp,未发生非特异性扩增。且检测的最低浓度达到100 pg/μL,具有高度的灵敏性和适用性。结论:根据动物线粒体cytb基因的差异性位点,开发的多重PCR体系,可一次性地同时检测牛肉、猪肉和鸡肉,可快速、灵敏、高通量地分析食品中掺假动物成分的来源。     

四重PCR结合全自动电泳系统检测食品转基因成分

根据转基因食品中最常见的四种外源元件(CaMV35S启动子、NOS终止子、cry1Ab/cry1Ac基因、bar基因)的核苷酸序列,设计特异性检测引物,扩增产物大小分别为101、180、301、430bp,通过引物浓度、退火温度的优化,特异性、灵敏度测试,并结合微流体芯片全自动电泳技术,建立了同时检测这4个参数的四重PCR方法。结果表明,该方法可特异性地从复杂样品中检测出预期转基因成分,检测灵敏度达到0.1%。本方法特异性好,灵敏度高,适用于食品中转基因成分的快速筛查。     

基于Cyt-B基因鉴定肉制品中鸭源性成分的研究

基于Cyt-B基因设计特异性引物,建立高效快速检测肉制品中鸭源性成分的方法。选取Cyt-B基因作为检测靶标,应用生物信息学技术设计各物种特异性引物,建立聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)体系检测肉制品中鸭源性成分,并将鸭特异性基因片段进行克隆和测序分析。该检测体系可以对鸭肉含量为1pg的肉制品实现稳定检测,灵敏度髙,特异性好。测序分析结果显示克隆的特异性基因序列与Genbank中相同物种(序列ID:EU755253.1)的核苷酸同源性达100%。该文建立的基于Cyt-B基因的PCR检测方法,可实现对肉制品中鸭源性成分高效快速的检测,既为肉类产品DNA鉴定试剂盒的研发提供试验基础,也有望对肉制品的市场监管和相关执法提供有力的技术保障。     

实时荧光PCR在鉴别鸡精中鸡源性成分的应用研究

文章利用实时荧光PCR方法,以鸡的cytb基因为目的基因,设计了一套特异性的引物和探针,对鸡精中的鸡源性成分进行定性、定量分析研究.结果表明,该套引物和探针能特异性的检测鸡精中鸡源性成分;荧光PCR检测的灵敏度为0.002％ (W/W),检测时间为3h.此方法具有准确、快速、高效的特点,为食品中鸡源性成分的检测提供了新方法.     

双重PCR检测食品中的动物源性成分

建立了一种检测肉制品中动物源性成分的双重PCR技术,针对五种不同动物线粒体DNA中所含有的特异性基因分别设计引物,同时对脊椎动物所共有的保守基因进行引物设计,并将其作为体系中的内参照.用此技术可同时检测出肉制品中5种动物源性成分,检测灵敏度达到1%,能够适应市场化检测的需要.     

饲料中六种动物源性成分多重PCR快速检测方法

采用试剂盒对含有牛、羊、猪等6种动物源性成分饲料中的DNA进行提取,根据动物线粒体DNA序列设计引物.以18 s rRNA作为内源基因对照,对DNA提取产物进行6种动物源性成分多重PCR扩增,同时对6种动物源性成分进行特异性鉴定.结果分别扩增出6种动物的特异性条带,证明该多重PER方法具有较高的特异性和灵敏度.     

基于TaqMan实时荧光PCR检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分

根据出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.4—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴 成分检测 实时荧光PCR法》合成引物和探针,利用TaqMan实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分。首先对13 种不同动物鲜肉组织的DNA进行驴源性成分特异 性检测,然后对驴源性DNA模板原液进行梯度稀释,检测方法灵敏度,最后在加工肉制品中检测方法的适用性。 结果表明：本研究建立的方法特异性强,除驴肉外,牛、羊、猪、马、骆驼、鹿、狗、兔、鸡、鸭、鸽子、鹌鹑 12 种动物鲜肉组织均无特异性扩增;方法的灵敏度较高,驴组分DNA的检出限可达100 fg/μL,灵敏度可达0.01%; 方法的适用性较广,可以用于加工肉制品中驴源性成分的检测。     

基于荧光定量PCR的兔毛定性检测方法

建立一种特异、灵敏的兔毛定性检测方法,并对方法进行评价,为准确有效检测兔毛方法的建立提供依据。文章针对兔线粒体COXⅠ基因序列进行引物探针设计,经Blast软件对相似序列搜索后,筛选出一套最优与常见禽畜无交叉反应的引物;采用常见动物纤维鸭绒、鹅绒、绵羊毛、山羊绒、牦牛绒、羊驼毛DNA进行特异性实验;对提取的兔毛DNA梯度稀释后分别进行荧光PCR扩增,确定检测方法的灵敏度;对引物进行3次重复性试验,验证其重复性。结果表明:设计的针对兔线粒体COXⅠ基因的引物及探针仅对兔毛有扩增,而对其他对照及阴性对照均无扩增。该荧光PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可以快速准确地定性检测纤维制品中的兔毛成分。     

食源性肠球菌荧光定量PCR检测方法的建立与评价

利用基因组序列比对分析等生物信息学方法发掘肠球菌新的属特异性靶点,根据42个候选靶点序列设计50对引物,结合普通PCR初筛和荧光定量PCR复筛,挑选特异性和灵敏度等检测性能最佳的引物,建立相应的荧光定量PCR检测方法,并对该方法应用于食品中肠球菌检测时的效果作出评价。分析结果显示,特异性最强的引物为EF1902,利用该引物建立的荧光定量体系检测肠球菌时均产生特异性扩增信号,而检测非肠球菌菌株时均无特异性扩增信号形成。经优化PCR体系后,该方法的基因组DNA检测灵敏度为13.78拷贝/PCR,纯培养物灵敏度为38.4 cfu/PCR。以肠球菌人工污染牛奶,当初始接菌量为2.63 cfu/mL时,只需增菌6 h即可用该方法检出肠球菌。对52份食品样品进行检测准确率为94.23%,证实了该方法可应用于食源性肠球菌的快速检测。综上所述,作者建立的肠球菌荧光定量PCR方法,特异性强且灵敏度高,可应用于食品中肠球菌的快速检测。     

SYBR GreenⅠ实时PCR快速检测沙门菌

为应用SYBR GreenⅠ实时PCR技术建立沙门菌的快速检测方法，根据沙门菌invA基因序列的特点设计特异性引物，进行SYBR GreenⅠ实时PCR检测。以沙门菌及非同源性参考菌株做特异性检测；沙门菌不同群菌株做重现性检测；将沙门菌菌株稀释成不同梯度，做灵敏度检测。该方法有较好的特异性、重现性，沙门菌属5个群菌株均为阳性：而其它非同源菌株均为阴性。该方法灵敏度较高，检测低限为19CFU／ml。该方法特异性强，重现性好，敏感性高，可以快速、准确检测食品中沙门菌。应用实时PCR技术，利用SYBR GreenⅠ染料能选择性结合双链DNA的特点，可检测到沙门菌中invA基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号，且通过熔解曲线可知其熔点值约为80，4℃，而对其它非沙门菌则检测不到荧光信号。SYBR GreenⅠ实时PCR能通过熔解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，是基因鉴定检测的新方法。     

食品中荧光假单胞菌聚合酶链式反应检测体系的建立和评价

建立用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测食品中荧光假单胞菌的方法。分别针对16～23S rRNA基因间隔区序列、gyrB基因以及通过生物信息学方法发掘到的4个种特异性基因设计6对检测引物,通过初步特异性实验,筛选出一对种特异性最佳的引物。最终建立以gyrB基因为检测靶点的PCR扩增体系,并对体系进行系统评价。结果表明:该方法可特异检测荧光假单胞菌的存在,纯DNA检测灵敏度为14.9fg/μL(2～3拷贝/μL),纯培养物检测灵敏度为2.8×102CFU/mL。豆奶样品经15h充分增菌可提高检测灵敏度至0.28CFU/25g。     

聚合酶链反应检测食品中的沙门氏菌

参考沙门氏菌侵袭性基因invA的序列,设计合成一对引物扩增其中一段序列,建立了特异性检测沙门氏菌的PCR方法。引物两端分别加了Bam HI和EcoR I切点,扩增片段大小为300bp。对收集的50个血清型123株沙门氏菌及7种23株非沙门氏菌进行PCR检测,结果仅沙门氏菌有300bp的扩增产物,显示了很强的特异性,为下一步克隆而设计的两个酶切位点对引物的特异性没有影响。经琼脂糖凝胶电泳,PCR的检出极限是10pg染色体DNA和10~2 cfu的细菌。将扩增产物经slot—blot与辣根过氧化物酶(HRP)直接标记的invA基因探针杂交,经增强型化学发光反应(ECL)及化学发光自显影(CPD)检测,可提高检测的敏感性一个数量级,同时增加了特异性。为推广应用,本文试验了8种模拟食品样品对PCR反应的影响,结果除奶酪外,其余都得到较好扩增。对120份污水及食品样品进行检测,该检测系统检出70份阳性结果,检出率高于常规分离。初步应用显示,PCR检测方法敏感、特异、简便、快速,适合于食品卫生检验和临床标本检验的现场应用。