鸡蛋主要过敏原Gal d 3基因的克降、表达、纯化及免疫学鉴定

目的:克隆表达鸡蛋主要过敏原Gal d 3基因并柃验其免疫活性.方法:提取鸡蛋的总RNA,采用RT-PCR方法扩增出目的基因片段,将其克隆入T载体中进行测序和分析.设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT-PCR获得整个短的开放阅读框并将目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中进行诱导表达.通过Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用免疫印迹(Western blotting)方法检测其IgE结合活性.结果:克隆获得了鸡蛋主要过敏原Gal d 3.基因开放阅读框为2118个碱基(包括终止密码子),编码705个氨基酸.该序列编码的蛋白等电点为6.5,相对分子质量约为76000.表达产物经亲和层析纯化,用Western blotting方法检测免疫学活性,目的蛋白具有良好的免疫原性.结论:成功地克隆和表达了鸡蛋主要变应原Gal d 3基因,该蛋白具有良好的免疫原性.     

花生Ara h6基因的克隆、表达以及免疫活性鉴定

目的:克隆花生主要过敏原Ara h6基因,诱导表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性.方法:提取花生总RNA,设计特异性引物,RT-PCR克隆花生Ara h6的基因,将测序正确的片段连入原核表达载体pET-28a上,并转入BL21(DE3)宿主表达菌中,IPTG诱导袁达,通过Ni2+亲和层析柱纯化目的蛋白,Western-blotting检测该重组蛋白的免疫原性.结果:测序结果表明花生Ara h6目的片段全长为438bp,编码145个氨基酸,与GenBank中蛋白序列100%相同.该基因诱导表达的产物纯化后经SDS-PAGE鉴定为17kDa.Western-blotting结果表明该蛋白与花生过敏病人混合血清中IgE结合,具有免疫原性.结论:成功克隆花生过敏原Ara h6的基因,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性.     

创伤弧菌外膜蛋白VuuA的表达纯化及复性

对创伤弧菌重组外膜蛋白VuuA进行表达纯化及复性,以获得可溶性VuuA蛋白。构建重组工程菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET-28a-vuuA,利用IPTG诱导表达重组蛋白VuuA,利用亲和层析分离纯化蛋白并对包涵体进行复性。VuuA蛋白主要以包涵体形式存在于重组工程菌细胞内,经复性后和亲和层析纯化后,蛋白浓度达到28.2mg/L发酵液,有效提高可溶性蛋白的浓度。VuuA蛋白的纯化及复性为创伤弧菌新型疫苗的制备奠定了基础。     

腰果主要过敏原Ana o 3的重组表达与鉴定

目的克隆获得腰果主要过敏原Ana o 3基因,并利用pCold-SUMO原核表达载体重组表达Ana o 3并鉴定免疫活性。方法提取腰果总RNA,逆转录至c DNA,设计特异性引物,通过巢式PCR技术克隆腰果Ana o 3基因,将其插入pCold-SUMO vector,鉴定并测序;将测序正确的阳性质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),低温15℃诱导表达。摸索诱导表达条件,经镍柱纯化,并通过Western blot鉴定免疫活性。结果测序结果表明,克隆腰果Ana o 3基因片段全长为417 bp,与GenBank上Ana o 3基因CDS序列基本一致;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,目的蛋白分子量为27 kD左右,大小与理论值相符;Western blot结果表明,与腰果过敏阳性血清具有良好的反应性。结论从腰果中成功克隆了Ana o 3基因,并于原核系统表达了Ana o 3蛋白,证实了此蛋白与腰果过敏血清具有良好的反应性。     

小龙虾主要过敏原精氨酸激酶的表达、纯化及 免疫原性鉴定

目的对纯化后的原核表达小龙虾主要过敏原蛋白精氨酸激酶进行免疫学鉴定。方法将化学合成的精氨酸激酶基因克隆至pET-28a(+)表达质粒上,转化进入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,使用异丙基硫代半乳糖苷进行目的蛋白的诱导表达,用Ni~(2+)亲和层析柱对重组过敏原蛋白进行纯化,使用小龙虾过敏病人混合血清对纯化后的蛋白进行免疫印迹鉴定。结果纯化得到了分子量大小约为40 kDa的重组小龙虾精氨酸激酶,并且重组蛋白与过敏病人血清IgE有明显的特异性结合。结论本实验建立了小龙虾精氨酸激酶的原核表达方法,并鉴定了其免疫原性,为小龙虾过敏的基础研究、临床诊断与治疗奠定了基础。     

重组大肠杆菌制备副溶血弧菌噬菌体内溶素Lys qdvp001 CHAP域及诱导条件初步优化

目的:为了利用噬菌体内溶素防控副溶血弧菌,通过克隆表达工程菌pET30a-CHAP制备目的蛋白,并将以包涵体存在的目的蛋白复性得到有活性的噬菌体内溶素蛋白。方法:首先克隆工程菌pET30a-CHAP,经 IPTG的诱导表达后,检测菌液上清中内溶素含量判断表达形式,再进行诱导条件初步优化。通过将表达的pET30a-CHAP包涵体蛋白先用洗涤剂洗涤去除杂蛋白,然后用尿素变性剂溶解,并用Ni2+ SepharoseTM 6 Fast Flow亲和层析柱进行层析纯化,用EDTA、氧化型谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽等为折叠复性促进剂,经过透析制备可溶性的 pET30a-CHAP蛋白,再检测目的蛋白的抑菌活性。结果:本实验确定了重组菌内溶素的表达形式为没有活性的包涵体;初步确定最佳诱导条件为诱导温度为16 ℃,IPTG终浓度0.5 mmol/L,诱导时间为7 h;复性后的内溶素具有抑菌活性。结论:本研究为利用内溶素防控副溶血弧菌以及其他革兰氏阴性细菌提供了制备方法。     

鲎素Tachyplesin Ⅰ在大肠杆菌中的重组表达及其抑菌活性

为了高效制备抗菌肽,本文将鲎素抗菌肽目的基因Tachyplesin-1(TP1)在大肠杆菌BL21中进行表达。首先构建表达质粒pET32a-TP1并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行目的融合蛋白表达,并利用His标签与镍柱亲和层析对融合蛋白进行纯化。纯化后的融合蛋白经羟胺裂解液切割和质谱分析后,获得单一的TP1重组蛋白,最后对其抑菌活性进行表征。结果表明,重组菌在37℃经IPTG诱导后,融合蛋白表达成功,TrxA-TP1融合蛋白的分子量在20 kDa左右。经羟胺裂解得到的重组蛋白TP1对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均具有良好抑菌活性,最小抑菌浓度分别为6和10 mg/L。本研究为鲎素抗菌肽TP1的开发应用和大量生产奠定了基础。     

植物乳杆菌DMDL 9010中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

研究了植物乳杆菌DMDL 9010亚硝酸盐还原酶基因克隆、表达及表达产物的纯化。首先以植物乳杆菌DMDL 9010的DNA为模板,利用PCR扩增亚硝酸盐还原酶基因,扩增后nir编码序列大小为1638 bp,再将其编码序列克隆到原核表达载体p ET-32a(+)上,转化到感受态细胞DH5α,成功构建重组质粒p ET-32a(+)-nir。将重组质粒转化到大肠杆菌表达菌株E.coli BL21中,在IPTG浓度为1 mmol/L和诱导温度为25℃的条件下诱导4 h后诱导表达NIR蛋白,经诱导后的工程菌能将50μg/m L的亚硝酸盐降解90%以上,利用亲和层析柱Ni sepharose 6 Fast flow进行纯化得到重组蛋白,该重组蛋白经SDS-PAGE电泳后的分子量约为60 KDa。总之,经由植物乳杆菌DMDL 9010克隆出亚硝酸还原酶基因,并成功构建了重组质粒p ET-32a(+)-nir,利用基因工程方法得到的工程菌能有效降解亚硝酸盐,并能利用亲和层析得到高纯度的NIR。     

人胰岛素原基因在大肠杆菌中的可溶性表达及分离纯化研究

根据NCBI中的人胰岛素原基因序列及大肠杆菌密码子偏爱性设计特异引物,PCR扩增得到人胰岛素原基因,构建该基因的原核表达质粒p ET32-PI,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。对重组菌进行温度和IPTG浓度优化,发现重组菌在30℃和终浓度为0.6 mmol/L的IPTG条件下表达效果最好且没有包涵体,经SDS-PAGE和Westem blot检测,表达蛋白的相对分子质量与理论相对分子质量一致且具有胰岛素的免疫原性,证明胰岛素原基因得到了正确表达。对重组菌进行流加发酵,发酵液离心收集菌体,破菌后上清液过亲和层析柱和离子交换柱分离纯化目的蛋白,透析后的样品用肠激酶和羧肽酶酶切,利用亲和柱去除融合蛋白与His标签,最终分离胰岛素样品,利用免疫酶标法,l m L样品测得活性92μIU,证明实验所得样品具有人胰岛素活性。     

李斯特菌噬菌体裂解酶CBD蛋白的克隆与表达

单核细胞增生李斯特菌噬菌体的裂解酶中细胞壁结合结构域(CBD)能够特异识别李斯特菌细胞。本研究将CBDP40基因扩增后插入p ET32a(+)载体,导入大肠杆菌表达系统,获得重组菌株,并对其进行IPTG诱导表达,分析重组蛋白的活性。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明,经0.1 mmol/L IPTG诱导的重组大肠杆菌BL21(DE3)在38 ku处有明显诱导条带,与预期蛋白分子量相符。经过超声细胞破碎,重组蛋白CBDP40分布在上清液中,通过镍离子螯合亲和层析纯化重组蛋白,洗脱后的蛋白浓度为0.908 mg/m L。经菌体结合和间接ELISA验证,重组蛋白CBDP40具有生物学活性,即对李斯特菌具有识别功能。CBD蛋白的重组表达、纯化及其活性验证,为深入研究裂解酶的理化性质和作用机制奠定了基础。     

表达藤黄微球菌过氧化氢酶基因的工程大肠杆菌发酵条件优化

目的优化表达重组藤黄微球菌(M.luteus)过氧化氢酶基因工程菌的发酵条件。方法以生物量和目标蛋白表达量为判断标准,利用单因子试验和正交试验在摇瓶水平优化初始pH、IPTG浓度、诱导时机、诱导时间等影响工程菌发酵制备藤黄微球菌过氧化氢酶的发酵条件。结果最佳发酵工艺参数:培养基初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,装液量75 mL,接种量6%,培养温度37℃,诱导表达时间5 h。蛋白表达量比优化前提高近30%,重组蛋白经Ni-NTA纯化和透析后,酶活性为166.0 U/(mg.protein),以实验条件相同野生菌酶活100.0 U/(mg.protein)为对照,重组酶的酶活性提高66%。结论工艺优化后,酶表达量及酶活性均显著提高。     

麻疹病毒N蛋白原核表达纯化条件的优化

通过构建重组表达质粒,诱导表达纯化麻疹病毒N蛋白．将麻疹病毒N蛋白基因片段与载体pET-32a（＋）相连接,通过PCR方法扩增获得重组质粒pET-32a（＋）／N,然后将重组质粒转入大肠杆菌E．coliBL21（DE3）内,并优化诱导表达时间、温度、诱导剂浓度等条件．SDS—PAGE和Western blot蛋白印迹检测表明,麻疹病毒N蛋白分子质量约为60kD,表达产物用Ni—NTA亲和层析和DEAE纯化后,纯度达90％．     

抗菌肽cecropin P1在大肠杆菌中的融合表达及活性测定

目的 在大肠杆菌中融合表达抗菌肽cecropin P1.方法 根据抗菌肽ceeropin P1的氨基酸序列,依照大肠杆菌密码子的偏爱性,采SOE技术合成cecropin P1的编码基因;将其克隆至表达载体pET-32a(+)上,经IPTG诱导表达,超声上清液用Ni·NTA亲和层析初步纯化,经肠激酶切割后,用薄层平皿琼脂...     

Expression and purification of a fusion-typed pediocin PA-1 in Escherichia coli and recovery of biologically active pediocin PA-1

Pediocin PA-1 is a representative class IIa bacteriocin which is small and heat-stable and has a consensus motif, -YGNGV-. The plasmid pQE40PED, encoding pediocin PA-1 fused with His-tagged mouse dihydrofolate reductase (DHFR), was constructed and introduced into Escherichia coli M15 strain. The fusion protein was overexpressed in the strain after induction of isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) and purified by nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) metal affinity chromatography. For the recovery of biologically active pediocin PA-1, the purified fusion protein was cleaved by Factor Xa protease and the liberated pediocin PA-1 was finally purified by ultrafiltration with a 75% yield. The molecular mass of the purified recombinant pediocin PA-1 was the same as that of native pediocin PA-1 on an electrophoresis gel.     

几丁质裂解性多糖单加氧酶的表达及应用研究

以具有几丁质降解能力菌株Chitiniphilus sp. LY72的裂解多糖单加氧酶（CsLPMO）为研究对象，在克隆CsLPMO全长基因的基础上对其进行生物信息学分析，利用3种表达质粒pET-22b、pET-28a和pCold，构建CsLPMO异源表达菌株EBL-22、EBL-28和EBL-Co。重组CsLPMO蛋白经Ni-NTA亲和层析柱纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定，筛选最佳表达质粒，对其表达条件进行优化。结果表明，CsLPMO是一种裂解性多糖单加氧酶，隶属于AA10家族。3株重组菌中，纯化重组酶蛋白相对含量分别为5.9%、4.1%、5.4%，比酶活力分别为155.42 U/mg、80.26 U/mg、148.29 U/mg，因此，确定最佳质粒为pET-22b，菌株EBL-22表达条件为：OD600 nm值至0.4时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.4 mmol/L后，在25 ℃下诱导表达16 h。在优化条件下，其可溶性蛋白含量为928.32 mg/L，比酶活力为3.34 U/mL。CsLPMO的加入可使还原糖的产量提高1.67倍。     

利用his-tag纯化和复性基因工程产物肠激酶

构建了融合表达肠激酶轻链（EKLC）的基因工程大肠杆菌，将该菌于37℃在含30mg／L卡那霉素的LB培养基中培养，当细胞密度（OD600）达到0．5～0．6时加入最终浓度为0．4mmol／L的IPTG并降温至26℃进行诱导表达，4h后目的蛋白质的表达量可达菌体总蛋白质的40％以上，但所表达的重组产物大多以包涵体形式存在于菌体中。利用产物N端携带6个组氨酸标签与金属螯合层析介质中镍离子的亲和性，应用镍离子金属螯和层析对样品包涵体进行了纯化和复性研究。实验结果表明，在变性条件下纯化的样品在柱上不经洗脱，直接用复性液洗涤6h，可以使EKLC在得到提纯的同时实现复性，得到了电泳纯度为96％的具有生物活性的EKLC，最高活性为712U。     

芹菜过敏原蛋白Api g1.02的克隆、表达及单抗制备

提取芹菜总RNA,反转录PCR(RT-PCR)扩增出过敏原蛋白Apig1.02基因,经PCR、酶切和序列测定后,得到重组质粒pET-32a-Apig1.02。将重组质粒转化到BL21(DE3)pLys感受态细胞中,用1mmol/L异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)对转化菌进行诱导表达及SDS-PAGE分析后,将表达蛋白提取纯化,制备单克隆抗体并进行Western blot分析。结果表明芹菜过敏原蛋白Apig1.02在体外获得了高效表达,表达融合蛋白分子质量约35ku,诱导6h后表达量最高,占菌体总蛋白的40%左右;制备的单克隆抗体能与表达蛋白发生免疫印迹反应,说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。该研究结果为建立芹菜过敏原蛋白的免疫学检测方法奠定了基础。     

单核细胞增多性李斯特菌p60蛋白表达条件的优化

在成功构建重组表达载体pET-28a-p60 和获得重组宿主菌E.coli BL21(DE3)的基础上,对重组宿主菌E.coliBL21(DE3)进行表达p60 蛋白条件的优化研究。结果表明：将重组大肠杆菌培养至OD600nm 达0.7～0.8 左右时,加入浓度为1mmol/L 的异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),在摇床温度为25℃,转速为150r/min 条件下诱导表达6h,可得到重组表达的p60 蛋白占总蛋白的比例为42.32%,其中可溶性蛋白占总p60 蛋白的比例为85.36% 左右,为p60 蛋白诱导表达的最优条件。     

中性蛋白酶基因在大肠杆菌中诱导表达条件的研究

采用PCR方法从枯草芽孢杆菌中扩增得到中性蛋白酶基因npr,与表达载体pET-22b(+)连接构建成重组质粒pET22b-npr,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌株。经IPTG诱导,其所含有的中性蛋白酶基因可高效表达。研究不同的表达条件对中性蛋白酶表达水平的影响,发现当培养液的OD_(600)值达到0.6～0.8时,添加诱导剂IPTG至终浓度为0.8 mmol/L,28℃诱导7h,重组工程菌中性蛋白酶的表达量最高,SDS-PAGE电泳结果显示出明显的分子质量约43 ku的特异性蛋白条带。     

表面活性肽在大肠杆菌中的异源表达

为构建新型表面活性肽的表达载体,并探讨其在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化,将编码新型活性肽A6 K的重复DNA片段(A6 K)15分别插入到4中不同的原核表达载体中,经酶切和测序验证后,转化到3种不同的表达宿主进行表达,通过改变异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,...