乳腺特异性人α-乳白蛋白真核表达载体的构建

从正常人血液中提取人基因组DNA.以其为模板,扩增人α-乳白蛋白(α-LA)2.36kb的总DNA序列,经测序鉴定后,将其连接到PSV载体SV40启动子后.构建真核表达载体LA-DNA-psv.扩增牛XS1-酪蛋白5'调控序列约1.2kb的片段.测序鉴定.切去LA-DNA-psv栽体原来的SV40启动子,连接牛αS1-酪蛋白5'调控序列约1.2kb的片段为启动子,构建真核表达载体αS1-LA-DNA-psv.为在动物乳腺中特异高效表达人α-乳白蛋白做准备研究.     

杂合抗菌肽Py-Sα真核表达载体的构建

本文根据抗菌肽Polyphemusin I和Spinigerinα的氨基酸序列,结合Pichia pastoris;偏爱密码子,人工设计合成杂合抗菌肽Py-Sα基因。按照正确的阅读框架将其定向克隆至真核表达载体p PICZαA上。经PCR及双酶切鉴定,所转化的宿主细胞中含有插入Py-Sα的重组质粒p PICZαA-Py-Sα,结果成功构建了杂合抗菌肽Py-Sα的真核表达载体。     

抗菌肽Taponicin Ⅱ基因真核表达载体的构建

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽Japonicin Ⅱ基因.按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上,经PCR鉴定及序列分析,所转化的毕赤酵母GS115中含有插入Japonicin Ⅱ基因的重组质粒pPICZαA-Jap,结果表明成功构建了抗菌肽JaponicinⅡ基因真核表达载体pPICZαA-Jap.     

抗菌肽Japonicin Ⅱ基因真核表达载体的构建

采用SOE法人工设计和合成抗菌肽Japonicin Ⅱ基因。按正确的阅读框架定向克隆至真核表达载体pPICZαA上，经PCR鉴定及序列分析，所转化的毕赤酵母GS115中含有插入Japonicin Ⅱ基因的重组质粒pPICZαA-Jap，结果表明成功构建了抗菌肽JaponicinⅡ基因真核表达载体pPICZαA-Jap。     

中国水牛乳中α-乳白蛋白活性分离方法比较

以水牛乳为原料,离心分离脂肪,再采用等电点缓慢酸沉去除酪蛋白,结合铁盐沉淀法和钙盐沉淀法两种方法分别对乳清蛋白中α-乳白蛋白进行活性分离,在保证α-乳白蛋白分离纯度的同时,对其活性和得率分析检测.结果显示,铁盐沉淀法分离α-乳白蛋白时,在pH4.5～4.7的酸性条件下采用质量分数0.04％的铁盐分离α-乳白蛋白保证α-乳白蛋白纯度达到电泳纯的同时,其活性比例和得率分别达到44.68％和21.06％;而在pH7.0的中性条件下采用质量分数0.005％的铁盐分离α-乳白蛋白也可保证α-乳白蛋白的纯度达到电泳纯,此时,其活性比例和得率分别达到64.00％和13.23％.钙盐沉淀法可很好地保持α-乳白蛋白的活性,但分离纯度过低.     

体积排阻色谱法测定牛奶、乳粉、乳清粉中α-乳白蛋白的含量

建立了体积排阻色谱法检测牛奶、乳粉、乳清粉中α-乳白蛋白含量的分析方法。使样品中的α-乳白蛋白经过盐酸胍变性以及2-巯基乙醇还原后,形成展开的α-乳白蛋白的单体结构,调节p H至6.5～7.5,串联使用两根体积排阻色谱柱MAb Pac SEC-1 300A(7.8mm×300 mm),盐酸胍为流动相,等梯度洗脱,用光电二极管阵列检测器在280 nm进行检测。本方法可以同时适用于牛奶、乳粉以及乳清粉中α-乳白蛋白的分离分析。α-乳白蛋白的线性范围为10～500 mg/L,线性相关系数均大于0.99。α-乳白蛋白的检出浓度为3.00μg/m L (S/N=3),定量浓度为10.0 g/m L(S/N=10)。牛奶、乳粉-乳白蛋白含量的分析方法。样1品中的α-乳白蛋白经过盐酸胍变性以及2-巯基乙醇还原后,形成展开的α-乳白蛋白的单体结构,调节p H至6.5～7.5,串联使用两根体积排阻色谱柱MAb Pac SEC-1 300A(7.8 mm×300 mm),盐酸胍为流动相,等梯度洗脱,用光电二极管阵列检测器在280 nm进行检测。本方法可以同时适用于牛奶、乳粉以及乳清粉中α-乳白蛋白的分离分...     

复合酶制备牛乳低致敏性蛋白基料的研究

利用胰蛋白酶、风味蛋白酶单独或分步水解牛乳,研究了α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、αs-酪蛋白的抗原性的变化.结果显示,胰蛋白酶水解60min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为83％、91％、13％,风味蛋白酶水解60min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为93％、93％、55％,胰蛋白酶水解40min,风味蛋白酶水解20min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为96％、96％、71％.因此,胰蛋白酶和风味蛋白酶分步水解牛乳蛋白抗原降低最显著,苦味最低,双酶分步水解后,产生大量分子量在5000u以下的肽.胰蛋白酶和风味蛋白酶分步水解牛乳技术,将为婴儿配方乳蛋白脱敏提供理论基础.     

牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量的变化特性

为研究牧场牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白随季节变化规律,利用毛细管电泳法分别检测1～12月份牛乳样品中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量.结果表明,α-乳白蛋白含量1月份最高(1.34 mg/mL),7月份含量最低(0.68 mg/mL);β-乳球蛋白含量2月份最高(3.46 mg/mL),8月份最低位(2.15 mg/mL).说明牛乳中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量与季节气候温度负相关.     

复合酶降低牛乳蛋白致敏性的研究

利用胰蛋白酶、风味蛋白酶单独或分布水解牛乳,均使α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、αs-酪蛋白的抗原性降低,结果表明,胰蛋白酶水解60 min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为83％,91％,13％;风味蛋白酶水解60 min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为93％,93％,55％;胰蛋白酶水解40 min,风味蛋白酶水解20min后,αs-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的抗原降低率分别为96％,96％,71％.因此,胰蛋白酶和风味蛋白酶分步水解牛乳蛋白抗原降低最显著,苦味最低,双酶分步水解后,产生大量分子量在5 000 u以下的肽.胰蛋白酶和风味蛋白酶分步水解牛乳技术将为婴儿配方乳蛋白脱敏提供理论基础.     

牛乳中α-乳白蛋白提取工艺

研究了热附聚法结合凝乳酶处理从鲜牛乳中提取α-乳白蛋白的工艺,对工艺参数进行了优化,得到富含α-乳白蛋白的乳清,其中α-乳白蛋白与β-乳球蛋白的浓度比达到3.03,达到了商业化产品的水平.     

Functional expression of streptococcal galactosyltransferase in baculovirus/insect cell expression system

The cpsIaJ gene of Streptococcus agalactiae type Ia codes for beta-1,4-galactosyltransferase. In this study, the functional expression of His-tagged CpsIaJ in a baculovirus expression system was performed, because the efficient functional expression of this enzyme in Escherichia coli had been unsuccessful. Using a partially purified enzyme preparation, we found that the enzyme had a restricted substrate specificity and that the entire structure of the substrate GlcNAc beta1-3Gal beta1-4Glc was required for the activity. Furthermore, mutations in a conserved DXD motif caused the loss of the enzyme's activity.     

碱性蛋白酶抑制剂lupI-MSSS原核表达载体的构建及其蛋白表达、纯化

低温碱性金属蛋白酶MP是从菌株YS-80-122中提取纯化的,属于沙雷氏蛋白酶家族,与该家族报道的其他酶的结构类似,在MP基因下游有一抑制剂基因lup I,该抑制剂可以完全抑制蛋白酶MP的活性。在野生型抑制剂基因的基础上,通过定点突变将Lup I的N端增加Met-Ser-Ser-Ser,命名为Lup I-MSSS,通过构建p ET28alup I-MSSS原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果表明该蛋白的大小约11 kDa,与预测的蛋白分子量一致。对影响蛋白诱导表达的诱导剂添加时间、诱导温度、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、诱导时间4个因素进行优化,并经初步优化得到了其诱导表达的条件为:接种量2%,诱导剂添加时间3 h,诱导剂IPTG终浓度0.5 mmol/L,诱导温度为37℃,诱导时间为8 h。表达的蛋白依次通过超滤,Superdex 200凝胶过滤层析,Q-Sepharose离子交换层析进行纯化,结果显示目的蛋白纯化倍数为20,比活力为15 720U/mg,活性回收率达60.7%,纯化后的lup I通过高效液相色谱法进行纯度分析,其纯度可达99%以上。     

人乳铁蛋白在原核中的融合表达

设计了特异引物，通过PCR扩增人乳铁蛋白（HLF）基因，将扩增的DNA片段重组到原核表达载体pGEX-4T3中，重组体转化大肠杆菌BL21菌株，经IPTG诱导后，得到了高效融合表达。分析结果表明，获得了特异表达的乳铁蛋白。     

花生果种皮特异表达基因AhPSG13的克隆和表达研究

为了克隆在花生果种皮中特异表达的基因,本实验从花生果皮种仁抑制消减文库中筛选出一个277bp的EST序列并进行研究,通过构建花生果皮全长cDNA文库,获得此目的基因G13的全长为1369bp,开放阅读框从第28个碱基始至1122个碱基止,预测分子量为39865.59,等电点5.73。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白具有4个跨膜结构域和多个活性位点,可能与细胞内DNA转录有关;该蛋白与多种豆科作物的半胱氨酸蛋白酶具有较高同源性,推测为花生半胱氨酸蛋白酶相关基因;RT-PCR研究该基因表达,结果显示该基因在果种皮中特异表达,于30d果皮中表达量最大。本研究克隆的AhPSG13基因序列已经登陆到GenBank,登录号为FJ475061。     

专业绘画的艺术表达方式探讨

结合建筑与环境艺术设计专业绘画技法的训练与培养,探讨其艺术表达方式与创造方法.发现专业绘画是在探索一种专业文化的建构积累,是围绕着人文、人性、人生及人的生活方式和生存环境展开的丰富多彩的实践探索.对于艺术元素的挖掘,实际上是一种感知能力训练；创意会改变原有的思维模式,为创造奠定认知基础.学生在社会调查中观察到的每一个朴...     

pfs基因原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

以植物乳杆菌KLDS1.0391的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到pfs基因,与Gen Bank中的序列对比发现同源性为99%。将目的基因与表达载体p QE-30连接,并将重组质粒p QE-30-pfs转化到E.coli M15中。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经SDS-PAGE分析,在全菌体蛋白中含有一条明显的特异性蛋白条带,大小约为27.4ku。经Ni-NTA纯化系统纯化后,在SDS-PAGE凝胶电泳图上获得纯化产物的条带。结果表明,原核表达载体p QE-30-pfs构建成功,且Pfs蛋白在大肠杆菌中成功表达,采用Ni-NTA纯化系统成功纯化了重组蛋白Pfs,为体外合成AI-2(Autoinducer-2)奠定了基础。     

甜菜苗期干旱胁迫诱导差异表达cDNA的研究

为挖掘甜菜自身抗逆资源，明确甜菜抗逆分子机理，创新甜菜种质，采用模拟干旱条件方法对甜菜幼苗进行处理，同时设对照。提取甜菜叶片总RNA，经反转录成eDNA，筛选合适的锚定引物和随机引物，琼脂糖凝胶电泳、丙烯酰胺凝胶电泳分析mRNA的差异表达。结果表明：干旱条件下，甜菜部分eDNA出现差异表达情况，共有差异片段10条，其中表现为上调的4条，表现为下调的2条，新增条带4条。回收差异片段，Northern杂交验证，得到阳性差异基因片段4条。本研究结果有助于阐明甜菜抗逆调控的分子机理，为进一步培育抗旱新品种提供理论基础。