关键酶基因的过表达与环境因素对大肠杆菌血红素合成的调控

为了阐明大肠杆菌卟啉合成途径关键酶基因和环境因素对卟啉代谢的调控作用,分别同源过表达了gltX、hemA、hemB、hemD、hemH及hemAD基因,分析了环境因素对卟啉前体5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic,ALA)和终产物血红素合成的影响。结果表明,hemA过表达显著促进了卟啉和血红素合成,温度和溶氧条件对hemA重组菌Eco/pEA产ALA与血红素的影响不一致。在最佳环境条件下,Eco/pEA的血红素含量是原始菌株的11. 7倍。因此,不同关键酶基因的过表达与环境因素对卟啉代谢的影响存在显著差异。     

Fur过表达对大肠杆菌血红素合成的影响

为了阐明铁摄取调节子基因fur对大肠杆菌血红素合成的影响,对fur基因进行了同源过表达,考察了菌体生长、铁离子浓度及血红素合成变化,并分析了血红素合成途径关键基因的表达水平。结果表明,原始菌株在限铁条件下的血红素量比在非限铁条件下的血红素量下降2.54倍;fur过表达对菌体的生长有抑制作用,胞内的铁离子减少;非限铁条件下,过表达菌株Eco/pEF的血红素量比原始菌株下降了3.55倍;而过表达菌株Eco/pEF在限铁条件下的血红素量比在非限铁条件下的血红素量增加3.10倍。fur过表达引起hemA下调,而gltX、hemB、hemC分别上调4.93倍、4.61倍和9.39倍;菌株Eco/pEF在限铁条件下hemB与hemG分别上调了5.59倍和4.49倍。虽然fur过表达使血红素合成途径基因表达水平上调,但并未导致血红素大量合成。该结果为通过铁离子摄取调控胞内血红素的水平提供了新的理论支持。     

基于模块化优化策略强化大肠杆菌合成血红素

血红素是一种参与生物体内的氧分子传递的含铁辅基,也是一种良好的补血剂。目前有关血红素合成途径的研究较少,其调控机理尚不清楚。采用模块化组装策略,将ALA合成关键基因hemA、hemL分为第一模块,用高拷贝质粒pUC19过量表达;将血红素合成途径的7个基因分成第二、第三模块,其中,基因hemB、hemC、hemD和hemE为第二模块;基因hemF、hemG和hemH为第三模块,利用拷贝数不同的质粒pRSFDuet-2、pCDFDuet-2和pACYCDuet-2调控第二、第三模块中各基因的表达水平,对这2个模块进行组合表达。其中重组菌株Escherichia coli-D6在摇瓶发酵48 h时血红素产量最高,达到0.56μmol/(L·OD);在3 L发酵罐中进行分批培养,发酵48 h时血红素产量达到0.954μmol/(L·OD)。     

解淀粉芽孢杆菌与大肠杆菌合成血红素的共培养体系构建及优化

通过将前体5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, 5-ALA)合成模块和5-ALA合成血红素模块分别设计在解淀粉芽孢杆菌与大肠杆菌中，构建了血红素合成共培养体系，实现了血红素的积累。首先，重构解淀粉芽孢杆菌的高谷氨酸合成代谢流方向，改善谷氨酸流向血红素前体5-ALA的效率，并在大肠杆菌中表达5-ALA合成血红素的7个途径基因。通过对上述2株工程菌共培养发酵实现了血红素积累。此外，通过适配性优化关键途径基因、阻遏竞争途径代谢流、载体工程以及发酵过程优化等策略来进一步改善共培养体系合成血红素的能力，获得了65.38 mg/L的血红素积累。该研究首次采用共培养体系从葡萄糖生产血红素，为其他天然产物的生物合成提供了崭新的思路。     

共表达谷氨酰-tRNA还原酶增强染料脱色过氧化物酶在大肠杆菌中的表达活性

染料脱色过氧化物酶(dye-decoloorizing peroxidase,DyP)属于以血红素为辅基的新型过氧化物酶类,常因缺乏辅因子而导致催化活性低。将来源于褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的染料脱色过氧化物酶基因(TfuDyP)与大肠杆菌谷氨酰-tRNA还原酶基因(hemA),构建重组质粒phemA-DyP,转化至E.coli BL21中进行共表达。分别以2,2-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和顽固性染料活性蓝19(RB19)、溴酚蓝、溴甲酚绿为底物检测TfuDyP的催化活力以及染料脱色效率。结果表明,诱导后的共表达菌株pAD胞内血红素含量为9. 8μmol/L,而单独过表达基因TfuDyP的菌株pD仅为3. 4μmol/L。TfuDyP纯酶的全波长扫描分析表明,在菌株pAD中DyP酶与血红素的结合度相比pD有较大幅度的提升。pAD菌株表达的DyP酶活力较pD菌株提高了110%,酶活力的提高使其在染料脱色应用方面也得到增强。在pAD菌株培养基中分别添加谷氨酸(Glu)、FeCl2使得胞内血红素含量、DyP酶活力和染料脱色效率比未添加时进一步提高。以上结果为TfuDyP的功能开发奠定了基础,同时也为其他血红素依赖性过氧化物酶的研发提供借鉴。     

苯丙氨酸生物合成的整体代谢网络调控基因的敲除

csrA基因产物是大肠杆茵芳香族氨基酸生物合成途径中碳中心代谢有关的一种全局性调控蛋白质.采用Red敲除系统介导的同源重组的方法定位缺失大肠杆茵染色体csrA基因,经PCR、DNA测序等多种方法证实了基因剔除的可靠性.csrA基因剔除后,大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成中受csrA表达产物负调控的关键酶的酶活力有所提高,而正调控的关键酶基因活性降低,突变菌株发酵生产苯丙氨酸的能力提高近13％.     

大肠杆菌四氢嘧啶合成途径的构建与优化

为了构建重组工程菌株发酵合成四氢嘧啶,解决野生型菌株对高盐环境的依赖,作者克隆了来自伸长盐单胞菌(Halomonas elongata ATCC 33173)的四氢嘧啶合成相关基因簇ectABC并在大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)中重构了四氢嘧啶的合成途径。通过宿主比较发现,与E. coli W3110、E. coli DH5α和高产天冬氨酸的大肠杆菌(命名为E. coli(asp))相比,E. coli BL21(DE3)更适用于四氢嘧啶的合成(185.23 mg/L)。进一步分析了不同拷贝数的表达系统对四氢嘧啶合成的影响,发现高拷贝的pRSFDuet-1为载体时产四氢嘧啶量最高,达267.3mg/L。在此基础上,采用核糖体结合位点(RBS)优化策略,对四氢嘧啶合成途径3个酶EctA、EctB与EctC进行了组合优化表达,四氢嘧啶产量提高至521.24 mg/L。为强化前体天冬氨酸和天冬氨酸β-半醛的供给,对天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、天冬氨酸转氨酶和天冬氨酸裂解酶进行了过量表达。研究表明,单独强化天冬氨酸激酶的表达更有利于四氢嘧啶的合成(551.24 mg/L),为构建高产四氢嘧啶的工程菌种提供了新的策略。     

粘红酵母酪氨酸解氨酶在大肠杆菌中的异源表达

酪氨酸解氨酶是苯丙氨酸代谢途径的关键酶之一。酪氨酸经其催化生成对香豆酸,可进一步生成白藜芦醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素类天然产物。作者选取来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶,对其基因进行大肠杆菌(Escherichia coli)密码子偏好性优化,合成基因后于E.coli BL21(DE3)中成功表达。经过硫酸铵分级沉淀、QFF阴离子交换层析、分子筛纯化后得到了纯化的酪氨酸解氨酶,比酶活达到1.78 U/mg。在相同的培养条件下,以不同的质粒作为表达载体,获得了不同的对香豆酸产量。其中以酪氨酸为底物发酵24 h,当以p ET-32a(+)作为表达载体时,获得最高的对香豆酸产量196.3 mg/L。经密码子优化后的酪氨酸解氨酶基因可更好地应用于苯丙素类物质的合成途径构建,不同载体的应用也为生物法生产对香豆酸提供了更多的选择依据。     

安全酵母Candida glycerinogenesis食品级甘油合成关键基因的研究

为了研究酵母甘油合成关键酶基因在食品级甘油合成中的重要作用,以产甘油假丝酵母基因组为模板,设计引物,克隆获得甘油合成关键酶基因3-磷酸-甘油脱氢酶基因(CgGPD),并在大肠杆菌中通过tac启动子串联表达来自酿酒酵母的3-磷酸甘油酯酶基因(ScGPP2)。经IPTG诱导培养后,3-磷酸-甘油脱氢酶(CgGPD)的比酶活达到了60mU/mg。在30%的葡萄糖浓度下,经过48h的摇瓶发酵,可合成甘油2.52g/L。表明3-磷酸甘油酯酶在甘油合成过程中起了关键作用,过表达CgGPD基因有助于食品级甘油大量合成,从而降低下游分离纯化的难度,可从分子水平进一步提高甘油的产量。     

第一类整合酶表达载体的构建及鉴定

Inti1基因是编码整合酶的基因,采用PCR方法对Inti1基因片断进行扩增,扩增子采用Ned1和BamH1双酶切,并克隆到pET19b载体上.把构建好的载体转化至E.coli BL21(DE3)中,在IPTG下进行诱导表达.经SDS-PAGE电泳鉴定以及使用特异性抗His-整合酶单克隆抗体的Western-Bloting证明该重组E.coli BL21(DE3)-Inti1在IPTG诱导下可表达整合酶,此为整合酶表达调控研究奠定了基础.     

乳酸菌代谢途径的基因工程调控

随着乳酸菌基因工程技术的发展，对乳酸菌的代谢途径进行基因工程调控，可以使其产生除乳酸之外的其它具有重要工业用途的成分。通过对乳酸菌丙酮酸代谢途径中某些关键酶基因进行敲除或过量表达，可以使乳酸菌大量地产生双乙酰或L-丙氨酸；在乳球菌中过量地表达叶酸或核黄素生物合成的关键酶，可以促进这两种B族维生素的生物合成：对乳酸菌胞外多糖生物合成途径中的限制性步骤进行调控。可以有效地提高胞外多糖的产量。利用这种基因工程改造的乳酸菌可以开发新型功能性发酵食品。     

枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的分泌表达及其在粉丝制作中的应用

作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外.重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积...     

转录和蛋白质组学分析热空气处理对桃果实采后冷藏期间糖酸和酚类物质代谢的影响

桃果实采后低温贮藏易发生冷害，为研究热空气（hot air，HA）处理对桃果实冷藏过程中调控代谢途径的作用，本实验采用HA处理（40 ℃、4 h）桃果实，于（1±1）℃下贮藏35 d，每隔7 d取样并对可溶性糖、柠檬酸、苹果酸、总酚、总黄酮含量和花色苷含量等指标进行测定，同时选取样品进行转录组学和蛋白质组学分析。结果表明：HA处理可以有效抑制桃果实冷藏期间蔗糖、柠檬酸、苹果酸、总酚和总黄酮含量的下降，并抑制果糖和葡萄糖含量的上升，同时HA显著提高了桃果实花色苷的含量（P＜0.05）。转录组和蛋白质组学分析结果表明，HA处理调控的差异表达基因和蛋白主要集中于碳水化合物代谢和次级代谢物代谢途径；桃果实糖酸代谢变化主要与转化酶、蔗糖合酶、蔗糖磷酸合酶、苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶基因和蛋白的表达有关；HA通过上调苯丙氨酸解氨酶、香豆酸CoA连接酶、查耳酮合酶、二氢黄酮醇还原酶、花青素合成酶和类黄酮葡萄糖基转移酶的表达量，促进酚类、黄酮类和花青素的合成。综上所述，HA处理可以有效延缓桃果实采后糖酸和酚类物质含量的下降，并提高果实花色苷的含量。     

干酪乳杆菌胞外多糖基因簇的调控基因在大肠杆菌中异源表达

为研究干酪乳杆菌胞外多糖的生物合成和转录调控,对其生物合成基因簇中假定的转录调控因子LC2W_2170进行克隆,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达。首先,利用PCR技术从干酪乳杆菌LC2W中扩增出目的基因LC2W_2170,将其插入到大肠杆菌表达载体p ET24a和p ET30a中,构建出LC2W_2170 N端或C端和N端均含有His蛋白标签的重组质粒。含上述质粒的E.coli经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析并未发现LC2W_2170蛋白可溶性表达。对LC2W_2170氨基酸序列利用Phobius服务器分析,发现该蛋白N端存在跨膜区(前27个氨基酸为跨膜序列)。切除此跨膜区域重新构建重组表达质粒后,在E.coli中成功实现LC2W_2170蛋白可溶性表达。研究为进一步纯化该转录调控因子,并研究其功能和对胞外多糖生物合成基因簇的转录调控机制奠定了基础。     

北京棒杆菌高丝氨酸脱氢酶基因的克隆与表达产物活性测定

以北京棒杆菌E31染色体DNA为模板,用PCR法扩增了高丝氨酸脱氢酶(HD)基因。将结构基因装载于pET-28a质粒的T7启动子下游,得到了重组表达质粒pET-HD。将其转入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了高效的表达。含表达质粒的菌体胞内粗提液经酶活分析表明,高丝氨酸脱氢酶的活性为不含重组质粒的对照菌的10倍。     

过量表达苹果酸酶对E.coli脂肪酸合成能力的影响

为了考察苹果酸酶对原核生物脂肪酸合成能力的影响,本研究从E.coli K-12中克隆了苹果酸酶基因(NADPME,EC1.1.1.40)MaeB,并插入质粒pET30a-T,构建了重组质粒pMX20,经IPTG诱导在E.coli BL2I(DE3)获得了大量表达.摇瓶发酵结果表明,过量表达苹果酸酶基因会改变大肠杆菌脂肪酸合成能力,并在添加适宜底物苹果酸(15mmol/L)时,胞内总酯含量比受体菌提高了4倍,约197.74mg/g,产率为1.89％.本研究为脂肪酸生产提供了优良菌株,具有一定的应用开发前景.     

大肠杆菌链长控制基因ddsA原位替换及多基因共表达对辅酶Q_(10)合成能力的影响

目的强化大肠杆菌合成辅酶Q10(CoQ10)的能力。方法利用途径工程的基本原理,对大肠杆菌辅酶Q生物合成途径中链长控制基因ispB进行遗传操作,并强化表达该途径中多个功能基因。结果首次成功用来自Gluconobacter suboxydans的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA原位替换大肠杆菌染色体上ispB基因,构建得到原位替换株JKL;同时强化表达CoQ生物合成途径的相关基因,发现在ubiCA和ddsA协同表达的重组菌pDCA/JKL中CoQ的合成能力比JKL提高了2.3倍,CoQ10合成量提高了2.5倍。检测该重组菌中ubiA的转录水平,发现其mRNA相对拷贝数是对照JKL的125倍。结论成功获得的重组大肠杆菌在降低内源性CoQ8合成能力的同时具备合成较长侧链CoQ10的能力,且通过强化表达相关基因使合成CoQ10的能力得到了提高。     

大肠杆菌链长控制基因ddsA原位替换及多基因共表达对辅酶Q10合成能力的影响

目的 强化大肠杆菌合成辅酶Q10(CoQ10)的能力.方法 利用途径工程的基本原理,对大肠杆菌辅酶Q生物合成途径中链长控制基因ispB进行遗传操作,并强化表达该途径中多个功能基因.结果 首次成功用来自Gluconobacter suboxydans的十聚异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA原位替换大肠杆菌染色体上ispB基因,构建得到原位替换株JKL;同时强化表达CoQ生物合成途径的相关基因,发现在ubiCA和ddsA协同表达的重组菌pDCA/JKL中CoQ的合成能力比JKL提高了2.3倍,CoQ10合成量提高了2.5倍.检测该重组菌中ubiA的转录水平,发现其mRNA相对拷贝数是对照JKL的125倍.结论 成功获得的重组大肠杆菌在降低内源性CoQ8合成能力的同时具备合成较长侧链CoQ10的能力,且通过强化表达相关基因使合成CoQ10的能力得到了提高.     

核糖核酸还原酶基因对虫草素的转录调控作用

检测和分析核糖核酸还原酶大亚基（RNR-LC）基因、小亚基（RNR-M2）基因在不同蛹虫草菌株中mRNA的相对表达量与虫草素含量的变化关系，探究核糖核酸还原酶在虫草素合成途径中的转录调控作用。检测不同蛹虫草菌株虫草素含量，采用荧光PCR技术对蛹虫草RNR-LC基因、RNR-M2基因表达的mRNA进行定量分析，并应用双内参基因对试验数据进行校正。以虫草素含量最低的野生蛹虫草组为对照，米基虫草组RNR-LC、RNR-M2基因的mRNA表达量分别是野生蛹虫草组的1.28倍和1.47倍，蚕蛹虫草组分别是其2.35倍和3.84倍。与对照组相比，RNR-M2 mRNA表达随虫草素的增加总体呈现升高的变化规律。两种基因在不同蛹虫草菌株中的相对表达量存在显著性差异（p<0.05）。RNR-M2基因在高虫草素菌株中存在明显的表达优势，而RNR-LC基因表达量与虫草素含量无明显变化关系，二者不存在协同调控作用。推测RNR-M2基因在虫草素合成途径中起着重要的正向调控作用。     

海洋来源褐藻胶裂解酶及其基因B1SM的克隆和表达

从海洋来源的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.) B1基因组中克隆1个褐藻胶裂解酶基因,并在大肠杆菌中实现异源表达,分离纯化重组酶并研究其酶学性质。通过Touch down PCR与热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)从假交替单胞菌B1基因组中扩增到1个褐藻胶裂解酶基因(B1SM),将目的基因插入到p GEX-4T-1载体,转化到宿主大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli) BL21 (DE3)。结果显示,从菌株B1克隆得到褐藻胶裂解酶基因B1SM,序列长度为1 005 bp,编码334个氨基酸,理论等电点为8. 51,编码蛋白质的理论分子质量为37. 13 k Da。重组褐藻胶裂解酶B1SM的最适pH和温度分别为8. 0和25℃。该褐藻胶裂解酶在pH 7. 0～9. 0范围内,25℃下保温1 h,仍剩余60%以上活力,pH稳定性较好。在最适pH 8. 0和30℃下保温1 h重组酶仍剩余60%以上活力。该研究为褐藻胶裂解酶基因B1SM在E. coli BL21(DE3)中实现了异源表达,为褐藻胶裂解酶的制备和研究奠定基础。