L-精氨酸生产菌的诱变育种研究

实验采用亚硝基胍对谷氨酸棒杆菌(Coynebacterumglutamicum)进行诱变处理,以添加了L-精氨酸结构类似物磺胺胍的筛选平板,筛选黄胺胍抗性突变菌株,将突变菌株进行摇瓶发酵实验,选育出1株L-精氨酸产量较高和产酸性能比较稳定的突变菌株,该菌株L-精氨酸产量比出发菌株提高了56.7%。     

野生型与突变型钝齿棒杆菌生物合成精氨酸基因簇argJBDFR的生物信息学比较

本文设计四对特异性引物分别扩增了野生型和突变型钝齿棒杆菌精氨酸生物合成基因簇argCJBDFR，对其中发生突变的基因argJ、argB及argF的变化进行了生物信息学比较，并分析了这些突变可能对精氨酸产量提高的贡献，为采用基因工程手段改良菌种提供有益的信息和指导。     

诱变育种提高嗜盐四联球菌精氨酸和瓜氨酸利用能力

以1株分离自酱醪的嗜盐四联球菌R23为出发菌株,采用紫外和等离子诱变的方法并通过高通量筛选获得了1株能够减少氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)前体瓜氨酸并能高效利用精氨酸的突变株3-H9。与野生菌株R23相比,突变株3-H9在不利于EC前体代谢的条件下,利用精氨酸和瓜氨酸的能力均有显著提高。通过基因转录水平分析和对相关酶活测定发现,突变株3-H9精氨酸代谢途径中各基因转录水平和相应酶活性均高于野生菌R23。     

Bacillus sp. Y112环糊精葡萄糖基转移酶位点R81定点突变提高产物特异性

通过对来源于海洋芽孢杆菌Y112的环糊精葡糖基转移酶进行同源建模及氨基酸序列比对,发现N末端81位精氨酸可能影响环糊精产物特异性。本研究通过定点突变将第81位点处的精氨酸突变为苏氨酸,降低了α-环糊精的生成量,将β-环糊精的比例从64%上升至71%,提高了产物的专一性。分析原因可能与取代氨基酸残基的大小及氢键作用力的变化有关。同时,突变酶的酶学性质方面保持了原始酶的嗜热性、热稳定性及耐碱性。     

微生物发酵法生产鸟氨酸

本文介绍了鸟氨酸的生物合成途径及代谢控制育种理论，提出了鸟氨酸积累突变株应具有瓜氨酸或精氨酸缺陷及精氨酸结构类似等遗传标记，并介绍了鸟氨酸的发酵研究情况。     

遗传性对称性色素异常症:一例家系报道及DSRAD基因突变的研究

目的报道1例遗传性对称性色素异常症家系,并对家系成员的DSRAD基因突变进行检测。方法PCR扩增该家系患者和健康对照个体DSRAD基因的全部外显子,并进行DNA测序,以100例无亲缘关系的正常人作对照。结果该家系患者DSRAD基因的第14外显子3388碱基发生了一个T→C的杂合突变,导致第1130位半胱氨酸被精氨酸替代,该区域可能存在DSRAD基因的脱氨基酶。家系中健康对照个体及无亲缘关系的正常人均未发现该突变。结论该遗传性对称性色素异常症家系中存在DSRAD基因的特异性突变,该突变引起编码蛋白功能缺陷,导致出现皮肤色素异常的临床表型。     

精氨酸-共轭亚油酸抗氧化活性研究

测定了精氨酸-共轭亚油酸清除超氧阴离子自由基(O2-.)、羟自由基(.OH)和二苯代苦味肼基自由基(DPPH.)的能力,并与VC的抗氧化活性进行了比较。结果表明:精氨酸-共轭亚油酸对3种自由基的清除能力均与其浓度存在着量效关系;精氨酸-共轭亚油酸对O2-.有一定的清除作用,但清除能力低于VC;精氨酸-共轭亚油酸对.OH和DPPH.有较强的清除作用,且清除能力均高于VC。在精氨酸和共轭亚油酸的协同作用下,精氨酸-共轭亚油酸的抗氧化活性得到增强。因此,精氨酸-共轭亚油酸是一种有效的抗氧化剂。     

黑曲霉β-甘露聚糖酶ManA耐热突变体的筛选

为了改造黑曲霉（Aspergillus niger）来源的β-甘露聚糖酶ManA,获得耐热性高的突变体。利用易错聚合酶链式反应（PCR）技术对构建的表达质粒pGAPZαA-manA进行随机突变,将突变文库转化至毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,表达筛选耐热性高的突变体,并进一步对突变位点进行定点突变,筛选其他耐热性高的突变体。结果表明,ManA的H283R与H283K突变体相对于野生型在耐热性方面有显著提升,75 ℃加热30 min其相对酶活由26.66%分别提升至76.95%和83.57%;在pH 3.0～9.0的条件下,50 ℃保存24 h,H283K突变体与野生型的相对酶活均在90%以上,H283R突变体在pH 3.0时的相对酶活下降到了84.72%,两个突变体的最适温度、pH及比酶活与野生型没有明显差异。说明β-甘露聚糖酶ManA的283位组氨酸（H283）对其耐热性较为关键,将该位点突变为精氨酸（R）和赖氨酸（K）时,ManA的耐热性得到显著提升。     

含L-精氨酸和抗氧化物质组方的毒理学安全性研究

为探究含L-精氨酸和抗氧化物质组方的毒理学安全性,该文按照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)重点开展了含L-精氨酸、山楂提取物、知母提取物和虾青素组方的毒理学评价。毒理实验显示,该组方小鼠经口急性毒性试验中最大耐受剂量值(maximum tolerance dose,MTD)>20.0 g/(kg·BW),Ames试验、小鼠骨髓微核试验和小鼠精子畸形试验均未见该组方样品有致突变作用。大鼠30 d喂养试验各项指标也均未见明显毒性反应。该组方属于无毒级、无遗传毒性,不会引起突变,为其临床应用及保健食品研发提供毒理学方面的科学依据。     

解除硝酸盐呼吸和氮通量限制对钝齿棒杆菌产精氨酸的影响

精氨酸广泛应用于食品、医药和工业领域中，其生产方式主要是微生物发酵法。钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)是精氨酸生产的重要工程菌株。该文针对课题组前期构建的钝齿棒杆菌(CCM01)进行代谢改造，探究了arnR和cgl2482的敲除对钝齿棒杆菌产精氨酸的影响。采用无痕敲除方法构建工程菌株并对其进行摇瓶发酵，测定菌体生长量、L-精氨酸产量、葡萄糖消耗量考察菌株产L-精氨酸的影响。硝酸盐能提高钝齿棒杆菌在氧气不足时的生长率，并且arnR的敲除有助于L-精氨酸的生产，arnR敲除菌株CCM02较对照菌株产量提高了8.58%,且当硝酸盐浓度在1.5 mmol/L时对积累L-精氨酸最为有利，产量达到17.09 g/L;cgl2482的敲除有助于氮源流入精氨酸合成途径，其敲除菌株CCM03精氨酸产量达到了17.88 g,较对照提高了4.9%;最终在CCM03发酵中添加1 g/L的尿素、50 g/L的谷氨酸钠以及1.5 mmol/L的硝酸盐时，L-精氨酸产量达到22.25 g/L,较CCM01提高了46.8%。     

钝齿棒杆菌产精氨酸代谢途径中argB基因的扩增及其序列分析

根据GenBank报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032序列,设计并合成一对引物,获得了全长argB基因片段.将其克隆到pGEM T Easy载体中,经测序鉴定后,以其为DIG标记探针,通过SouthernBlot分析钝齿棒杆菌A.S1.542与谷氨酸棒杆菌ATCC13032,argB基因核苷酸同源性高达99%,氨基酸序列95%相同.     

argR基因对钝齿棒杆菌发酵过程中产精氨酸特性的影响

本文测定了一株钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）诱变菌和二株基因工程菌发酵过程中产arginine曲线、生长曲线以及发酵液中碳源消耗量和pH值的变化。实验结果显示Arg产量最高的菌株为C．crenatumA．S．M2.sp，其产量达到9mg／ml，据此认为钝齿棒杆菌中的argR基因可能为Arg代谢中的一个正调控因子。     

钝齿棒杆菌ArgR蛋白的表达、纯化及其多聚体的形成

通过PCR技术从钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.542基因组中扩增得到长度为516bp的argR基因,将其连接到原核表达载体pET22b(+),并转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET22b-argR,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在33℃诱导8h实现高效可溶性表达,获得了一个分子质量为20kD的融合蛋白ArgR。用纯化后的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价高达1:160000。Western blot分析结果表明,L-精氨酸介导重组蛋白形成的多聚体,可与自制的鼠抗ArgR多克隆抗体进行特异性反应,与预期结果一致,表明ArgR通过与精氨酸共孵育形成了多聚体,该结果有助于采用凝胶阻滞方法对ArgR蛋白与钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径中各操作子的结合情况进行进一步研究。     

吐温-80对钝齿棒杆菌产L-赖氨酸的影响

对吐温-80提高L-赖氨酸产量的分子机制进行探究。以钝齿棒杆菌MT-M4 ΔproB为出发菌株,在菌株生长至对数初期36 h时,添加5 mg/mL吐温-80进行摇瓶发酵,通过反转录实时荧光定量聚合酶链式反应（reversetranslate real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）监控相关基因的转录水平、胞内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form,NADPH）水平及α-酮戊二酸脱氢酶复合物（α-oxoglutarate dehydrogenase complex,ODHC）的活力。摇瓶发酵结果表明,添加吐温-80使L-赖氨酸产量提高了215%;RT-qPCR结果表明,编码ODHC的基因odhA、sucB和lpdA、参与ODHC调控的基因pknG、dtsR和ppp以及合成NADPH的磷酸戊糖途径基因zwf的转录水平均发生了变化,其中odhA、sucB、lpdA、pknG及dtsR1基因分别发生了上调,ppp基因下调,相应ODHC活力提高了32.9%;zwf基因上调了17.6 倍,相应胞内NADPH水平提高了137%。因此,在对数生长初期36 h添加吐温-80具有双重功效,既提高了ODHC的表达又使NADPH积累,从而诱导L-赖氨酸的高产。     

吐温对钝齿棒杆菌产L-精氨酸代谢的影响

目的:以课题组构建的钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT NAGK M4 △proBANcgl1221AdtsR1(CCM01)为出发菌株,探究吐温(Tween)对该菌产精氨酸代谢的影响.方法:优化精氨酸发酵及Tween质量浓度,测定菌体生长量、L-精氨酸产量、发酵液残糖量考察Tween ...     

缺失ATP合酶和插入VHb基因对钝齿棒杆菌谷氨酸产量的影响

为了提高钝齿棒杆菌生产谷氨酸的产量,以谷氨酸生产菌钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）T6-13为出发菌株,利用同源重组技术使其缺失ATP合酶基因（atp）并进一步插入透明颤菌血红蛋白基因（VHb）,得到两株重组菌株T6-13-Δatp和T6-13-Δatp-tac-VHb,通过检测重组菌株谷氨酸产量及生长情况可以看出,在发酵32 h后,atp基因缺失菌株较出发菌株谷氨酸产出累积量高27.76%,但atp基因缺失导致菌体生长缓慢且无法到达出发菌株稳定期浓度,而插入VHb基因的atp基因缺失菌株的谷氨酸产出累积量较出发菌株高36.91%,且菌体的生长速率及稳定期浓度与出发菌株基本一致。     

氧化还原电位调控对钝齿棒杆菌代谢通量分布的影响

研究不同氧化还原电位对钝齿棒杆菌厌氧发酵特性的影响,并对菌株的代谢通量分布特征进行了分析。结果表明,氧化还原电位由－56 mV降为－400 mV时,发酵液中琥珀酸质量浓度由14 g/L上升为20.2 g/L,乳酸质量浓度由44.9 g/L下降为35.2 g/L。代谢通量分析结果表明,降低氧化还原电位对6-磷酸葡萄糖与磷酸烯醇式丙酮酸节点处的代谢流分布影响显著。氧化还原电位为－400 mV时,胞内戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway,HMP）代谢通量与－56 mV相比增加了1.74 倍,由磷酸烯醇式丙酮酸流向C4途径的代谢通量与－56 mV相比增加了78%,琥珀酸通量由31.73 mmol/（L·g·h）增加到56.53 mmol/（L·g·h）,乳酸代谢通量由159.73 mmol/（L·g·h）下降为133.50 mmol/（L·g·h）。研究结果表明6-磷酸葡萄糖与磷酸烯醇式丙酮酸节点是影响钝齿棒杆菌厌氧发酵产琥珀酸的关键节点,为后期通过菌种改造以调节乳酸和琥珀酸的生成比、实现乳酸与琥珀酸联产奠定了基础。     

钝齿棒杆菌AS1.998原生质体形成与再生条件的研究

研究了影响L-异亮氨酸(L-Isoleucine)产生菌钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.998原生质体形成和再生的各个因素。结果表明:菌体培养至对数生长期,0.8 U/mL青霉素G处理3 h后,1.0mg/mL的蛋清溶菌酶37℃,150 r/min酶解15 h,原生质体形成率可达98.0%以上,在含8.5%蔗糖的再生完全培养基上,再生率可达20.0%～30.0%。     

Isolation and identification of lipase producing thermophilic Geobacillus sp. SBS-4S: cloning and characterization of the lipase

A thermophilic microorganism, SBS-4S, was isolated from a hot spring located in Gilgit, Northern Areas of Pakistan. It was found to be an aerobic, gram-positive, rod-shaped, thermophilic bacterium that grew on various sugars, carboxylic acids and hydrocarbons at temperatures between 45°C and 75°C. Complete 16S rRNA gene sequence of the microorganism exhibited homology to various species of genus Geobacillus. A highest homology of 99.8% was found with Geobacillus kaustophilus. A partial (0.7 kbp) chaperonin gene sequence also showed a highest homology of 99.4% to that of G. kaustophilus whereas biochemical characteristics of the microorganism were similar to Geobacillus uzenensis. Based on biochemical characterization, 16S rRNA and chaperonin gene sequences, we identified SBS-4S as a strain of genus Geobacillus. Strain SBS-4S produced several extracellular enzymes including amylase, protease and lipase. The lipase encoding gene was cloned, expressed in Escherichia coli and the gene product was characterized. The recombinant lipase was optimally active at 60°C with stability at wide pH range (6-12). The enzyme activity was enhanced remarkably in the presence of Ca(+2). The K(m) and the V(max) for the hydrolysis of p-nitrophenyl acetate were 3.8mM and 2273 μmol min(-1)mg(-1), respectively. The ability of the recombinant enzyme to be stable at a wide pH range makes it a potential candidate for use in industry.