培养基组成对布拉氏酵母生长的影响及其优化

对益生菌布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)的培养基组成及培养条件对其生物量的影响进行了研究。通过单因素试验探讨培养基中碳氮源种类,磷酸二氢钾和硫酸镁浓度、pH以及接种量对布拉氏酵母生物量的影响;利用正交试验确定摇瓶培养的最适条件。结果表明布拉氏酵母的发酵培养基组成为:葡萄糖45 g/L,酵母膏12 g/L,磷酸二氢钾0.8 g/L,硫酸镁0.5 g/L。培养条件为:培养基初始pH5.5,接种量9%,培养时间24 h。在此条件下得到的布拉氏酵母菌体干重为6.5 g/L。     

常压室温等离子体诱变与微生物微液滴培养选育谷胱甘肽高产菌株

为提升野生毕赤酵母菌株BY-1产谷胱甘肽的能力,通过常压室温等离子体（atmospheric and room temperatureplasma,ARTP）诱变技术得到诱变菌株BY-1-26。进一步在摇瓶培养过程中添加1,2,4-三氮唑,提高诱变菌株产量。最后将1,2,4-三氮唑作为筛选因子,利用微生物微液滴培养（microbial microdroplet culture system,MMC）仪对诱变菌株进行适应性进化,获得了1株高产谷胱甘肽的突变株BY-2-24,并对其遗传稳定性进行研究。结果表明：出发菌株BY-1经过ARTP诱变处理、抗性梯度平板初筛、MMC适应性进化、摇瓶复筛等,可以选育高产谷胱甘肽突变株。突变株BY-2-24摇瓶产量达（312.13±2.62）mg/L,较出发菌株提高134.26%,且经过7次传代培养,仍然具有较好的遗传稳定性。同时,生物量提高118.33%,表明诱变菌株的生长能力得到提高。研究表明,ARTP与MMC联合应用作为一种简便高效的微生物诱变方式,可用于定向诱变筛选高性能微生物菌株,为高通量选育目标菌株提供了参考。     

贵州黑糯米酒曲优良酵母菌分离筛选与鉴定

从贵州黑糯米酒曲中分离出酵母菌312株。通过菌落形态菌体形态观察及生理生化实验将其初步鉴定至5个属。酵母属57株、假丝酵母属14株、复膜孢酵母属28株、毕赤酵母属212株、德巴利氏酵母属1株。经TTC法、杜氏管法、发酵法及玉米糖化醪法逐级筛选,最终筛选出1株产酒量高产香好的菌株,编号为Q3～J8。并提取菌株Q3-M8ITS序列进行分子生物学鉴定,Q3-J8为布拉酵母（Saccharomyces boulardii）。     

常压室温等离子体诱变与微生物液滴培养系统联用筛选L-组氨酸产生菌

利用常压室温等离子体（ARTP）诱变技术,对野生型谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 14067诱变处理。通过全自动高通量微生物液滴培养系统（MMC）和平板选育组氨酸结构类似物的抗性突变株。使用48孔板发酵初筛及摇瓶发酵复筛,最终从耐受3-氨基-1,2,4-三氮唑10 g/L和D-组氨酸8 g/L的抗性突变株中筛选得到菌株Cg-F4,其L-组氨酸产量为（0.561±0.016）g/L,并且经过7次连续传代实验验证了该菌株稳定性良好。     

常压室温等离子体快速诱变酒精酵母及其突变株的特性研究

常压室温等离子诱变技术可以快速有效的诱变微生物。利用ARTP技术对酵母菌进行诱变,得出其致死时间为90s;通过筛分实验对不同突变标准下的正负突变率进行了统计,得到5株较优良突变株;对其进行多次筛分实验,发酵结果比较一致;遗传稳定性试验结果表明,突变株具有较好的遗传稳定性;通过发酵期间的突变株的失重多于出发菌株的情况验证筛分结果：突变株优于出发菌株。     

低产双乙酰酵母菌株的选育及大生产应用的初步研究

本实验采用微波诱变与甲基磺酸乙酯（EMS）诱变相结合的方法对出发菌株2．003行诱变,以筛选出产双乙酰值低的酵母菌株。小试实验表明：与出发菌株相比,突变株B82的双乙酰生成量下降了40％;经大生产试验,突变株B82双乙酰峰值低、还原快,有一定的应用价值。     

基于ARTP技术快速选育番茄红素高效合成突变株

为了提高番茄红素的生物合成水平,本研究利用常压室温等离子体注入技术对番茄红素生产菌三孢布拉霉负菌(Blakeslea trispora(-))进行诱变选育。首先建立了番茄红素含量分析的标准曲线和等离子体诱变致死率曲线。通过构建的"马鞍形"致死率曲线确定了合适的诱变处理时间,经过数轮肉眼初筛和摇瓶复筛,获得了一株产量为0.85±0.04 g/L的突变株ARTP-3,比出发菌株番茄红素的产量提高51.4%,且传代实验表明该菌株的番茄红素产量遗传稳定性较好。本研究不仅获得了一株具有较大经济价值的番茄红素高效合成突变株,建立的育种方法也可为其他工业微生物特别是丝状真菌的选育提供有益的参考。     

高产酯酶细菌的筛选、鉴定及复合诱变选育

该研究从大曲中筛选出高产酯酶的细菌,对其进行形态学鉴定和分子生物学鉴定,利用常压室温等离子体-紫外（ARTP-UV）复合诱变选育出优良突变株,并进行遗传稳定性试验,提高其产酶能力。结果表明,从某浓香型酒厂大曲中筛选出一株产酯酶酶活力为（13.73±0.04）U/m L的细菌,编号为S3-51,其被鉴定为少见鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）。对菌株S3-51进行ARTP-UV复合诱变,选育出酶活最高的突变株ARUV3-2,经遗传稳定性测试后,菌株ARUV3-2的酯酶酶活力稳定在（17.42±0.32）U/m L,相比于初筛时的产量提高了26.88%。菌株ARUV3-2为脂肪酸乙酯类化合物的工业合成和白酒质量的提升提供潜力。     

耐酒精酿酒酵母大气压等离子体诱变条件的建立及选育

酿酒酵母在酒类发酵过程中起着非常重要的作用,但普遍存在耐酒精能力弱、发酵速度慢等问题。本研究采用大气压等离子体技术对酿酒酵母进行诱变,以酵母菌株S1为出发菌株,以致死率和正突变率为指标,对酵母菌菌龄、酵母菌浓度、辐照电压、辐照时间、样品与等离子电极间距和氩气流速等影响大气压等离子诱变的因素进行研究,并通过TTC显色反应、耐酒精性能测定、遗传稳定性实验、糖类发酵实验、致死温度测定、耐高糖度测定、产酯能力测定等对突变酵母进行筛选。确立了酿酒酵母大气压等离子体诱变的最佳条件为:酵母菌菌龄为12 h、酵母菌浓度为106个/m L、辐照电压为165 V、辐照时间为14 min,样品与等离子电极间距为4 cm和氩气流速为1.0 L/h,最终筛选得到1株综合性能较强的突变酵母菌株S45。     

产GABA菌株的诱变选育及培养基优化的研究

γ-氨基丁酸是一种天然存在的非蛋白质氨基酸,具有多种对人体有益的功能。通过对一株GABA高产乳酸菌进行紫外诱变,诱变后得到1株高产GABA突变株LP-S2,GABA产量平均达到7.274g/L,比出发菌株提高了53.07%。通过连续传代遗传稳定性较好。对突变株LP-S2进行发酵培养基的优化。最终GABA最大产量达到9.703g/L。通过紫外诱变的方法,扩大了GABA产生菌来源。为发酵法生产GABA奠定了更好的基础。     

罗伊氏乳杆菌J1胃肠道耐受性评价及其对免疫相关基因调控的体外研究

以分离自传统发酵乳制品中的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri,L.reuteri)J1为研究对象,对其黏附性能、生长特性、对胃肠道环境的耐受能力以及该菌株作用于Caco-2细胞不同时间后免疫相关基因表达量的动态变化进行评价。结果显示,罗伊氏乳杆菌J1具有良好的黏附性,黏附率达87.93%,具有定植于肠道中的潜力。该菌株在4 h进入对数期,14 h进入稳定期。在肠道耐受性评价中,菌株在pH为2.0和3.0条件下处理3 h后,其存活率分别为86.77%、97.12%;在胆盐质量浓度分别为0.3、0.5和1.0 g/100 mL的培养基中处理4 h后,其存活率分别为105.00%、82.60%和82.18%;经模拟人工胃液处理3 h后转入人工肠液继续培养8 h,存活率达82.71%;该菌株在7 g/100 mL的盐溶液中处理24 h后,其存活率为80.36%。此外,108CFU/mL的罗伊氏乳杆菌J1可刺激Caco-2细胞中免疫相关因子IL-1β的表达,抑制促炎因子IL-6和趋化因子IL-8的表达。综上表明,罗伊氏乳杆菌J1具有定植于肠道上皮细胞的潜力,耐受胃肠道环境,并发挥一定的免疫调节作用。     

一株高产丁酸的丁酸梭菌分离鉴定及其生物学性质研究

从健康成人新鲜粪便中筛选得到一株高产丁酸的丁酸梭菌C1-6,分析其生长特性和部分生物学性质。从形态学特征、生理生化试验、16S rDNA基因序列同源性以及多位点序列分型(Multi-site sequence typing,MLST)等方面对菌株进行鉴定;分析了该菌的部分生物学性质,包括发酵液中丁酸含量,对酸、胆盐、模拟消化道的耐受性以及抗生素抗性。结果表明,丁酸梭菌C1-6的24 h发酵液中丁酸含量达到2.1 g/L左右;对酸、胆盐以及模拟消化道环境具有较强的耐受性,其在pH2和pH3的酸性条件下孵育3 h后的存活率分别为72.5%和91.8%,对胆盐的耐受性随胆盐浓度的提高略有上升,当胆盐浓度为1%时,其存活率为104.63%,经过模拟消化道环境后其存活率仍高达93%以上;除对氯霉素、卡那霉素等氨基糖苷类抗生素和青霉素具有抗性外,对氨苄西林、四环素、万古霉素、头孢呋辛均比较敏感,有必要进一步评价其耐药基因的转移风险。由以上结果发现,丁酸梭菌C1-6有一定的潜在应用价值。     

布拉酵母高密度发酵培养基及发酵工艺优化

为实现布拉酵母高密度培养,对其高密度发酵培养基和发酵工艺进行优化。采用Plackett-Burman试验筛选培养基中的显著因素,并进行中心组合设计。通过人工神经网络（artificial neural network,ANN）和响应面试验建立菌体布拉酵母产量与培养基之间的关系模型,利用遗传算法（genetic algorithm,GA）进行全局寻优。结果表明,ANN模型有较好的数据拟合能力和预测能力,更适合处理复杂的非线性问题。GA优化获得最佳培养基组合：葡萄糖40.52 g/L、蛋白胨36.8 g/L、玉米浆17.32 g/L、硝酸钾14 g/L、酵母营养盐1.5 g/L、磷酸二氢钾0.6 g/L、硫酸镁0.8 g/L。利用该培养基进行摇瓶培养,菌体布拉酵母产量可达到8.21 g/L,比优化前提高1.39 倍。在此基础上利用1 L发酵罐培养确定最佳发酵工艺：温度30 ℃、接种量10%、pH 5.0、溶氧40%。利用50 L发酵罐进行扩大培养,流加葡萄糖和蛋白胨控制发酵液中葡萄糖3 g/L、氨氮0.06 g/L,菌体布拉酵母产量达到51.21 g/L。     

具有α-葡萄糖苷酶抑制作用益生菌的筛选及特性分析

以实验室77 株益生菌为研究对象,从其菌体细胞代谢物（cell-free excretory supernatants,CFS）和细胞内容物（cell-free extracts,CFE）两方面分析菌株对α-葡萄糖苷酶的抑制活性;同时还从耐酸性、细胞黏附性等方面对具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的菌株进行了益生特性评价;最后利用主成分分析进行综合性评价,以期筛选出具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的益生菌。结果表明,77?株益生菌的CFE对α-葡萄糖苷酶没有抑制作用;而CFS对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用,抑制率为2.53%～15.76%。选取抑制率明显高于其他益生菌（编号为ST-2、1.1881、GS-3和BLP12）菌株进行益生特性的研究。其中ST-2表现出很高的耐酸性和细胞黏附性;GS-3在模拟消化液中有很强的耐受性等,各菌株特性不一。主成分分析表明菌株BLP12的综合性能最好：其对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达15.10%;于pH?2.0孵育3?h后,存活率能达到71.04%;于2.0%的胆盐条件下孵育24?h,存活率为0.70%;依次经模拟唾液、胃液、肠液消化后,存活率仍能达到88.27%,但对HT-29细胞的黏附率较低,仅为1.93%,总体上菌株BLP12对体外模拟胃肠环境的适应性很强。该菌株经过16S基因序列鉴定为植物乳杆菌,可作为降糖益生菌株应用于降糖食品的开发。     

In vitro screening of probiotic properties of Saccharomyces cerevisiae var. boulardii and food-borne Saccharomyces cerevisiae strains

The probiotic potential of 18 Saccharomyces cerevisiae strains used for production of foods or beverages or isolated from such, and eight strains of Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, was investigated. All strains included were able to withstand pH 2.5 and 0.3% Oxgall. Adhesion to the nontumorigenic porcine jejunal epithelial cell line (IPEC-J2) was investigated by incorporation of 3H-methionine into the yeast cells and use of liquid scintillation counting. Only few of the food-borne S. cerevisiae strains exhibited noteworthy adhesiveness with the strongest levels of adhesion (13.6-16.8%) recorded for two isolates from blue veined cheeses. Merely 25% of the S. cerevisiae var. boulardii strains displayed good adhesive properties (16.2-28.0%). The expression of the proinflammatory cytokine IL-1alpha decreased strikingly in IPEC-J2 cells exposed to a Shiga-like toxin 2e producing Escherichia coli strain when the cells were pre- and coincubated with S. cerevisiae var. boulardii even though this yeast strain was low adhesive (5.4%), suggesting that adhesion is not a mandatory prerequisite for such a probiotic effect. A strain of S. cerevisiae isolated from West African sorghum beer exerted similar effects hence indicating that food-borne strains of S. cerevisiae may possess probiotic properties in spite of low adhesiveness.     

罗伊氏粘液乳杆菌K07的生物学特性及其基因分析

从新疆昭苏县传统发酵乳酪中分离出2株罗伊氏粘液乳杆菌（编号K07、K08）,对2株菌的生长和产酸性能、耐酸耐胆盐、模拟胃肠道的耐受、产罗伊氏菌素能力和抗氧化活性进行了评估;此外还测定了2株菌的抑菌性能并对K07菌株进行基因分析。结果表明,2株菌均在培养12 h后进入对数生长末期,发酵终点pH值为4.45。K07对酸、胆盐和模拟胃肠道的耐受及抗氧化能力强于K08。pH值2.50处理4 h,K07存活率为73.27%。0.15%胆盐胁迫下K07菌株OD600 nm 上升0.3个单位需5.50 h,模拟胃肠道试验K07的存活率为74.13%。两株菌的无细胞提取物抗氧化活性高于完整细胞,其中K07无细胞提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除率为42.39%、15.69%,还原力17.96%。K07产罗伊氏菌素量为183.05 mmol/L显著高于K08,且K07抑菌性能较好,对白色念珠菌和无乳链球菌的抑菌圈直径为22.20 mm、18.26 mm。K07基因组全长1 950 440 bp,预测蛋白质编码基因2 067种,GC含量为38.69%。研究结果显示罗伊氏粘液乳杆菌K07具有良好的益生特性,为后续产业化应用提供理论依据。     

发酵前包被布拉迪酵母生长代谢及其抗逆性机理

以布拉迪酵母为研究对象,以海藻酸盐为制备材料,基于内源乳化凝胶化法,对酵母菌进行了发酵前包被和包被后培养。以未包被游离酵母菌为对照,研究了其包被后的生长和代谢特点,并探讨其抗逆性机理。结果表明,相对于游离培养,微胶囊化包被的布拉迪酵母最终活菌数显著增多,并有更多的乙醇生成;微胶囊化布拉迪酵母的胞外甘油浓度下降明显,而胞内甘油浓度则显著升高,可比游离条件下高出157.3%;此外,微胶囊化布拉迪酵母的胞内海藻糖含量比游离条件显著提高110.3%。结论:微胶囊内部微环境为布拉迪酵母提供了更稳定的增殖空间,并使其代谢向着有利于甘油和海藻糖积累的途径进行,从而提高了细胞的抗胁迫能力。     

一株耐高乙醇和低pH己酸产生菌Lysinibacillus fusiformis- pBE3-ep-SigB的构建

以Lysinibacillus fusiformis为出发菌,分别转染SigA和SigB突变基因,获得耐高乙醇和低pH胁迫的优良己酸产生菌。以pET32a（+）-SigA/SigB为模板,采用均匀试验优化SigA/SigB易错聚合酶链式反应（ep PCR）扩增体系中的Mn2+和Mg2+浓度,通过ep PCR获得ep-SigA/SigB突变基因,与载体pBE3-MCS连接后,构建L. fusiformis-pBE3-ep-SigA/SigB突变菌体库,将两种菌体库在pH值2～5和乙醇含量2%～12%条件下进行筛选。结果表明,L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株耐受最高乙醇含量为8%左右,最低耐受pH值为2.5左右;当乙醇含量为8%、pH值为3.5时,L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株的己酸产量达到（254.35±39.74） mg/100 mL,显著高于工程菌株L. fusiformis-pBE3-ep-SigA的己酸产量（P＜0.01）,且为出发菌L. fusiformis己酸产量（93.62±10.33） mg/100 mL的271.68%,表明L. fusiformis-pBE3-ep-SigB重组菌株具有较强的抗高乙醇浓度和低pH值胁迫产己酸的能力。     

Selection of acid tolerant bifidobacteria and evidence for a low-pH-inducible acid tolerance response in Bifidobacterium longum

Acidity is an environmental condition commonly encountered by lactic acid bacteria and bifidobacteria in the gastrointestinal tract and fermented foods. In the present study, 22 strains of Bifidobacterium were screened for acid tolerance in artificial gastric juice (AGJ, pH 3.0) and fermented milk. AGJ tolerance was found to be strain-specific, with a pronounced variation among the strains. Several strains with a high survival rate in AGJ that belonged to Bifid. longum, Bifid. breve and Bifid. adolescentis were selected. Among them, only strain BL1 of Bifid longum was found to possess a high survival rate in fermented milk during refrigerated storage. Strain BL1 exhibited a survival rate of more than 25% in AGJ at pH 3.0 for 2 h and maintained a viable cfu level of more than 10(8) per gram of product in fermented milk (pH 4.6) under refrigerated conditions for 2 weeks. The acid tolerance of strain BL1 was found to depend on the final growth pH (<4.5). Rapid loss of acid tolerance was observed when the cells were shifted from acid to neutral conditions by addition of NaOH. Strain BL1 cells were able to maintain much higher intracellular pH under acid conditions, in comparison with those of AGJ sensitive mutant (BL1-S) or cells that lost acid tolerance following pH shifting from acid to neutral conditions. These results suggested that a cytoplasmic pH homeostasis system may function in the acid tolerance response in this strain.     

1 株牦牛源产细菌素植物乳杆菌的益生特性分析

为研究1 株从牦牛体内分离筛选出的高产细菌素的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SWUN5815的益生特性,本研究通过测定其抗菌活性、耐酸耐胆盐能力、黏附能力及对小鼠体质量和肠黏膜免疫影响评价其益生能力。结果表明：该菌株对牦牛源食源性致病微生物具有很强的广谱抑菌活性;在pH?2和pH?3时存活率分别为58.2%和86.9%,胆盐质量分数0.3%时存活率为66.8%,具有良好的耐酸耐胆盐能力;对Caco-2细胞黏附率为42%;对常用的抗生素敏感,不具有耐药性。短期喂服植物乳杆菌SWUN5815可以显著提高小鼠体质量（P＜0.01）,同时还可提升小鼠肠道SIgA的表达水平（P＜0.01）。综上所述,本研究分离得到的植物乳杆菌SWUN5815能很好地适应胃肠环境压力,有效提高小鼠的体质量和免疫功能,可作为候选益生性菌株。