2’-岩藻糖基乳糖的微生物合成研究进展

2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）是母乳寡糖中含量最高的寡糖（约占31%），在婴幼儿的生长发育中起重要作用。2019年底，2’-FL已经在欧盟获批作为新型食品投入市场，因此，如何高效、安全地生产2’-FL成为当下的研究热点。与其他方法相比，利用微生物细胞工厂进行2’-FL的合成具有成本低、安全、快捷等特点，是实现大规模生产2’-FL的可行方法。本文主要针对微生物合成2’-FL过程中关键酶的活性、产物的分泌和积累、底物和中间代谢产物的分解代谢以及辅因子再生等方面进行综述，并对未来的发展趋势进行展望。     

苯胺柱前衍生麦芽糊精的高效液相色谱-电喷雾质谱分析

研究苯胺柱前衍生寡糖混合物麦芽糊精的高效液相色谱-电喷雾质谱分析方法。优化色谱及质谱分析的条件,采用反相C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);乙腈和乙酸铵溶液(pH4.5、10mmol/L)为流动相进行梯度洗脱;在239nm波长处检测,并采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术对寡糖衍生物进行分析,建立苯胺衍生寡糖的高效液相色谱(HPLC)分离分析、电喷雾质谱(ESI-MS)及液相色谱-电喷雾质谱联用(LC-ESI-MS)组分分析方法。在液质联用条件下,麦芽糊精衍生物分离效果良好。该方法衍生化产物稳定,后处理简单,在食品体系寡糖混合物分离分析方面有潜在的应用前景。     

不同通路配置对大肠杆菌合成2’-岩藻糖基乳糖的影响

在大肠杆菌BL21 Star (DE3)中建立了2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）的从头合成途径，通过CRISPR/Cas9系统敲除了β-半乳糖糖苷酶基因lacZ M15序列和尿苷二磷酸-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，探究了操纵子、假操纵子和单顺反子3 种不同通路配置对重组大肠杆菌合成2’-FL的影响。结果表明：从头合成途径的基因在大肠杆菌BL21 Star (DE3)过表达后摇瓶发酵产生的2’-FL质量浓度为0.34 g/L。敲除lacZ M15和wcaJ后，重组菌产生的2’-FL质量浓度增加到了1.26 g/L。在操纵子形式下，重组菌BS-7摇瓶发酵产生的2’-FL质量浓度最高，达1.92 g/L。BS-7在10 L发酵罐中分批补料发酵37 h后产生的2’-FL质量浓度达到14.04 g/L，2’-FL产率为0.59 g/（L·h），乳糖转化率为63%。因此，大肠杆菌合成2’-FL过程中，较低的基因表达强度更有助于提高其产量，同时可提高底物的转化效率。     

地杆菌α-L-岩藻糖苷酶的分子改造及其在合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用

对地杆菌α-L-岩藻糖苷酶进行分子改造，以提高其酶法合成2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）的转化效率。利用易错聚合酶链式反应构建了α-L-岩藻糖苷酶的突变体文库，筛选得到一个合成2’-FL转化率提高的突变酶（mPbFuc29A1）。酶学性质研究结果表明mPbFuc29A1的最适pH值和温度分别为pH 5.0和40 ℃，最适温度较野生型PbFuc29A1提高了5 ℃；突变酶水解2’-FL的比活力提高到3 倍，但是水解4-硝基苯基-α-L-岩藻糖苷（4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside，pNP-FUC）和3’-岩藻糖基乳糖（3’-fucosyllactose，3’-FL）的比活力分别降低了22.8%和52.5%。以pNP-FUC和乳糖为底物，采用mPbFuc29A1酶法催化合成2’-FL和3’-FL，转化率分别为23.6%和56.4%，其中2’-FL的转化率较PbFuc29A1提高了9.1%。通过序列及定点突变分析发现mPbFuc29A1的氨基酸序列中有2 个位点发生突变（Asp21Val和Glu266Lys），其中位于loop区的Glu266Lys可能是mPbFuc29A1底物特异性和转糖苷产物组成发生改变的关键。优良的酶学特性使mPbFuc29A1在2’-FL合成中具有较大的应用潜力。     

柱前衍生—高效液相色谱荧光检测法测定乳制品中6种母乳寡糖

目的：建立一种普及性强、灵敏度高,并能同时测定乳制品中6种母乳寡糖的高效液相色谱—荧光检测分析方法。方法：样品经冰醋酸沉淀,滤纸过滤后,经2-氨基苯甲酰胺溶液衍生,离心后经有机滤膜过滤,用AdvanceBio Glycan Map色谱柱分离,以乙腈-50 mmol/L甲酸铵溶液（pH 4.4）为流动相,梯度洗脱分离,并使用荧光检测器检测。结果：6种母乳寡糖在1.00～400.0 mg/L质量浓度范围内线性关系良好,相关系数均＞0.999,方法检出限为4.1～10.9 mg/kg,回收率为71.3%～90.2%,日内相对标准偏差（RSD）为1.0%～6.3%,日间相对标准偏差＜10.0%。结论：该方法简单、快捷,可有效降低衍生峰的干扰,适用于乳制品中3′-岩藻糖基乳糖、2′-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖、3′-唾液乳糖和6′-唾液乳糖6种母乳寡糖的日常检测。     

基于2种衍生化方法对牛乳中寡糖的高效液相色谱-质谱联用分析

利用Sep-Pak C_(18)柱和石墨化碳柱对已脱脂和除去蛋白质的牛乳进行分离纯化,并采用1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one,PMP)和2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone,AMAC),2种衍生化试剂对其进行衍生化处理,通过高效液相色谱进行优化,AMAC衍生化的结果(约有67个峰)明显优于PMP衍生化的结果(约20个峰),最终确定AMAC为最佳衍生化试剂,并利用最终优化好的高效液相色谱条件,采用高效液相色谱-串联离子阱飞行时间质谱对牛乳中寡糖进行测定,最终测得7种乳寡糖并获得该7种乳寡糖的单糖组成。     

基于SPE-GC-MS对白酒中6种长链游离脂肪酸的测定及差异性分析

为建立一种准确测定白酒中月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸六种长链游离脂肪酸（FFAs）的方法，该研究基于衍生化-气相色谱-质谱（GC-MS）法，对衍生化试剂、萃取方法及色谱柱进行优化研究。结果表明，白酒中6种长链游离脂肪酸的最佳测定条件为采用BF3-甲醇为衍生试剂，采用固相萃取（SPE）法，CP-WAX色谱柱进行气相色谱-质谱（GC-MS）分析。在该分析条件下，6种长链游离脂肪酸在线性范围内相关系数R2均>0.993，方法检出限为0.002～0.009 mg/L，方法的精密度试验结果相对标准偏差（RSD）为3.9%～9.3%，回收率为92%～112%。该方法准确度和精密度良好，适合于白酒中月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸6种长链游离脂肪酸的定量检测。     

2’-岩藻基乳糖对益生菌定殖及抗炎能力的影响

目的:探究2’-岩藻基乳糖（2’-Fucosyllactose,2’-FL）对乳酸菌和双歧杆菌增殖、粘附肠道细胞以及抗炎作用的影响。方法:以2’-FL和实验室的30株乳酸菌和双歧杆菌为研究对象,通过测定生物量、产酸和细胞粘附倍数的变化筛选出2’-FL可以增强定殖能力的菌株,再利用脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症模型进一步筛选出其中的潜在抗炎菌株,最后探究2’-FL和潜在抗炎菌株的联合抗炎效果。结果:30株实验菌株中,2’-FL仅能促进两歧双歧杆菌FL-276.1和FL-228.1的增殖,提高乳酸菌ML-1、FN515、FN518、FN249、ML329和双歧杆菌FL-276.1粘附Caco-2细胞的能力。其中两歧双歧杆菌FL-276.1、FL-228.1和鼠李糖乳杆菌FN518可以显著（P<0.05）降低脂多糖诱导的Raw264.7细胞炎症因子NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌。2’-FL可以显著降低NO、IL-6和IL-1β的分泌。2’-FL与上述3株菌联用具有协同抗炎作用,但协同效果具有菌株差异性,其中FL-276.1与2’-FL协同抗炎效果最好。结论:2’-FL可以提高乳酸菌和双歧杆菌的定殖能力,并协同发挥抗炎功能,但效果具有菌株差异性,这一结果可以为预防早产儿坏死性小肠结肠炎提供新的选择。     

SPE-LC-MS/MS法检测肉粉中5种硝基呋喃类药物的代谢物

采用同位素稀释法结合固相萃取净化技术,建立了准确、灵敏的肉粉样品中5种硝基呋喃类药物的代谢物的液相色谱-串联三重四极杆质谱检测方法。样品中添加同位素内标,经盐酸水解,2-硝基苯甲醛衍生,乙酸乙酯提取,HLB固相萃取小柱净化,采用C18色谱柱分离,乙腈-甲酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱,串联质谱ESI正负离子切换模式电离,多反应监测（MRM）模式检测。结果表明,5种硝基呋喃类药物的代谢物在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数均大于0.9990;方法的检出限为0.05 μg/kg~0.2 μg/kg;在低、中、高3个添加水平,平均回收率（n=6）为80.33~103.24%,日内精密度在4.60~9.85%;添加水平为0.5 μg/kg时,日间精密度（n=5）小于10.3%。本方法净化效果好,灵敏度高、准确性好,适用于基质复杂的肉粉样品中5种硝基呋喃类药物的代谢物的测定。     

高效液相色谱-荧光检测法测定红肉及其加工肉中唾液酸含量

采用高效液相色谱-荧光检测法对红肉及其加工肉中两种唾液酸N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc）进行定性和定量分析。利用单因素试验对衍生化与样品酸解条件进行优化,并借助超声缩短酸解时间。结果表明,以盐酸作为酸解试剂,超声辅助酸解30 min,4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺盐作为衍生化试剂,衍生化试剂浓度为13 mmol/L,样品与衍生化试剂比值为1∶1,衍生化时间120 min时,检测效果最佳。Neu5Ac和Neu5Gc在0.1～10 μg/mL范围内线性良好,回收率为91.2%～119.7%,检出限分别为0.003 mg/kg和0.01 mg/kg,重复性的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）为0.7%～1.8%,精密度RSD分别为1.4%和1.2%。本方法具有灵敏度高、分析时间短、重复性及准确性好等特点。     

短链脂肪酸气相色谱-质谱测定方法的建立

肠道微生物群及其主要代谢物短链脂肪酸(SCFAs)被认为是肠道内环境稳定和代谢疾病发生的重要因素。气相色谱-质谱(GC-MS)是生物样品中最常用的短链脂肪酸谱分析方法。三甲基硅基(TMS)衍生化试剂N，O-双(三甲基硅基)-三氟乙酰胺(BSTFA)是气相色谱/质谱分析中常用的提高灵敏度和准确性的试剂，采用BSTFA对粪便、盲肠和结肠内容物的SCFAs进行GC-MS分析，并采用选择离子监测模式对短链脂肪酸进行高灵敏度的定量分析。在37 ℃条件下，用BSTFA衍生的SCFAs具有良好的线性关系(R2>0.998)，回收率86%~96%，精密度RSD<4%。结论:采用GC-MS和BSTFA衍生化结合的方法可应用于粪便中SCFAs的定量分析，是一种准确、通用的检测方法。     

GC-MS/MS法测定饮用水中2种卤代酸残留量

建立生活饮用水中二氯乙酸、三氯乙酸2种卤代酸残留量的气相色谱-串联质谱(gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)检测方法,比较硫酸-甲醇溶液、三甲基硅重氮甲烷(trimethylsilyl diazomethane,TMSCHN_2)己烷溶液衍生化试剂用于2种卤代酸化合物衍生化反应的差异。生活饮用水样品经甲基叔丁基醚超声提取,弗罗里硅土固相萃取柱(Florisil)净化,硫酸-甲醇溶液、三甲基硅重氮甲烷己烷溶液衍生,采用GC-MS/MS多反应监测模式分析,外标法定量。结果表明,采用优化后条件,二氯乙酸、三氯乙酸在0.005 mg/L～0.200 mg/L的定量范围内,线性关系良好,相关系数均在0.99以上。选取3种不同水样品,在空白样品添加浓度为0.02、0.04、0.1 mg/L的范围内,二氯乙酸、三氯乙酸的平均回收率范围为86.1%～96.5%,相对标准偏差小于5.2%。二氯乙酸、三氯乙酸经TMSCHN_2衍生后的响应是经硫酸-甲醇溶液衍生后响应的1.69、1.71倍。采用TMS-CHN_2衍生的方法,大大缩短了检测时间,提高检测效率,降低了检测成本,有利于大批水样品的日常检测。     

天然姜油掺假的气相色谱-质谱定性鉴别

采用气相色谱-质谱法,对姜油掺假植物性豆油进行鉴定分析。姜油经甲酯衍生化后,采用气相色谱-质谱
仪进行分析,检测姜油中是否含有豆油的特征成分（十八碳一烯酸、十八碳二烯酸、十八烷酸和十六烷酸）,判断
姜油样品中是否掺杂豆油。结果表明：姜油经过甲酯衍生化后,利用豆油的特征性峰,能鉴别出姜油中是否掺有豆
油,检出限可达1%。该方法灵敏度较高、定性鉴别结果可靠,可以为姜油的质量安全控制提供重要的技术依据。     

PMP-HPLC-MSn法分析弱酸降解鲍鱼性腺多糖产生的寡糖

为考察鲍鱼性腺硫酸多糖（abalone gonad sulfated polysaccharide,AGSP）在弱酸降解过程中产生的寡糖,对不同酸浓度的降解产物1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone,PMP）衍生化后,进行高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MSn）法检测。在AGSP的弱酸降解产物中发现了2 种二糖（disaccharides,DS1、DS2）和1 种四糖（tetrasaccharide,TS）。2 种二糖均是由己糖醛酸通过糖苷键连于己糖,其中DS2的结构确定为β-GlcA（1→2）-Man,而TS是由2 个DS2连接而成。在100 ℃加热1 h的条件下,在0.1～2.0 mol/L的三氟乙酸浓度范围内,这3 种寡糖的产率都随着酸浓度的增加呈升高趋势。     

重组大肠杆菌补救途径合成2′-岩藻糖基乳糖的分子克隆和产物合成分析

2′-岩藻糖基乳糖作为人乳寡糖中含量最多的一种，对婴幼儿健康生长发育有重要作用，是极具应用价值的母乳概念配方奶粉添加剂。该研究通过比较不同来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶，选定幽门螺杆菌来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因fucT2与脆弱拟杆菌来源的L-岩藻糖激酶基因fkp共表达，构建了2′-FL的补救合成途径。对乳糖转运蛋白LacY以及2′-FL运出蛋白伯氏耶尔森氏菌来源的糖转运蛋白Tpyb或大肠杆菌来源的糖转运蛋白SetA适量过表达，大幅增加了胞外产物浓度。比较BL21(DE3)、C41(DE3)、JM109(DE3)这3种菌株的2′-FL合成能力，得到了基于JM109(DE3)的2′-FL最终合成菌株J2-V8。通过发酵条件优化，在摇瓶中48 h得到2′-FL的胞外质量浓度为2.67 g/L,较初始菌株提高了5倍，转化率为0.82 mol/mol岩藻糖，以上结果为2′-FL的生物制备技术开发提供了借鉴。     

SPE-HPLC-MS/MS法检测动物源性运动食品中喹乙醇及卡巴氧代谢物残留

建立一种快速、高效的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法（SPE-HPLC-MS/MS）测定动物源性运动食品中的3-甲基-喹喔啉-2-羧酸（MQCA）及喹恶啉-2-羧酸（QCA）的方法。样品前处理采用碱水解提取MQCA和QCA,经PAX固相萃取柱（60 mg/3 mL）净化后检测。以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相,在质谱检测器的多反应监测（MRM）模式下进行分析。结果表明,MQCA和QCA在0.1～50.0 ng/mL质量浓度范围内线性关系良好,相关系数R2为0.999 6～0.999 8,检出限均为0.05 μg/kg,定量限均为0.20 μg/kg。平均加标回收率为83.67%～96.08%,精密度试验结果相对标准偏差（RSD）为1.75%～3.10%。该方法具有前处理简单、净化效果好、灵敏度高和检测速度快的优点,适用于动物源性运动食品中的MQCA及QCA残留量的检测。     

罗丹明类柱前衍生剂HPLC-MS法检测果蔬中的单氰胺

合成了新型化学衍生试剂罗丹明B-N-羟基琥珀酰亚胺酯(RBS),基于RBS柱前衍生和高效液相色谱-质谱联用法建立了果蔬中单氰胺的检测方法。样品经乙酸乙酯萃取,用RBS衍生化后,采用高效液相色谱-质谱联用法测定。结果显示:衍生化试剂RBS具有很好的质谱检测灵敏度,对单氰胺的衍生化反应高效、专一。单氰胺浓度在0.005～5 mmol/L时呈现良好的线性关系,相关系数为0.9969,该方法的检出限为0.001 mmol/L,定量限为0.0025 mmol/L,样品加标回收率为77.56%～105.21%,相对标准偏差为1.88%～4.04%。该方法选择性好、灵敏度高、检测限低,可满足果蔬中的单氰胺残留量的测定。     

高效液相色谱法测定乳酸菌发酵液中γ-氨基丁酸

通过对衍生试剂浓度、衍生时间、衍生温度、检测波长、流动相比例与柱温条件的选择,建立了一种高效液相色谱（HPLC）法灵敏检测发酵液中γ-氨基丁酸（GABA）含量的方法。以邻苯二甲醛为衍生化试剂,衍生时间5 min,衍生温度为室温,色谱条件为：检测波长228 nm,流动相为乙腈-20 mmol/L结晶乙酸钠溶液（21∶79,V/V）,柱温30 ℃,流速0.8 mL/min。结果表明,在γ-氨基丁酸含量0.05 μg/mL～0.50 mg/mL范围内线性关系良好（相关系数R2=0.999 4）,平均加标回收率为91.87%～105.58%,精密度试验结果相对标准偏差（RSD）为0.55%～3.74%（n=5）,检出限为0.02 μg/mL。采用该方法检测发酵液中γ-氨基丁酸含量,其含量范围在0.157～0.369 mg/mL之间。该方法操作简单、灵敏、准确可靠,适用于发酵液中γ-氨基丁酸含量的检测。     

2’-岩藻糖基乳糖的功能、合成及应用研究进展

2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)在母乳低聚糖(human milk oligosaccharides,HMOs)中含量最高,研究证明2’-FL具备调节婴儿肠道菌群平衡、抵抗病原体的黏附、免疫调节和促进婴儿大脑神经发育等功能。合成2’-FL的方法有化学合成法、酶法合成法与全细胞合成法。2’-FL已经进入商业化生产阶段,其产业化受到产量、成本、品质及安全等因素的制约,需要在合成宿主、碳源的选择等方面进一步开展相关研究。2’-FL已被美国和欧洲联盟等国家批准可添加至婴幼儿配方食品及膳食补充剂中,研究证明添加了2’-FL的婴幼儿配方奶粉在营养成分和功效上更贴近母乳。本文综述了2’-FL的结构、母乳中的含量及其生理功能,总结了现阶段2’-FL的制备方法和应用情况,展望了2’-FL未来的研究方向,为2’-FL在婴幼儿配方食品中的开发及应用提供理论支持。     

GC-MS法同时快速检测纺织品中酚类化合物的研究

通过超声提取、衍生化后气相色谱-质谱（GC-MS）定性定量检测技术,建立了纺织品中7种酚及其盐和酯残留总量的检测方法.样品经甲醇提取并浓缩微干后,用0.1 mol/L碳酸钾溶液转移到无机相,加入乙酸酐乙酰化后生成酯,经正己烷提取后,再由GC-MS分时段选择离子监测技术进行测定.方法简单快速,准确度和精密度高,在25μg/kg、50μg/kg和500μg/kg 3个添加水平下的回收率在86%￣104%,变异系数CV≤7%;灵敏度高,四氯苯酚、五氯苯酚和苯基苯酚的检测限分别为5μg/kg、2.5μg/kg和1.0μg/kg,而2-萘酚的检测限达到了0.5μg/kg,都低于最严格的50μg/kg的限量要求.