不同处理方式对红肉中N-羟乙酰神经氨酸解离的影响

应用不同方法处理红肉(猪肉与牛肉),研究能够有效解离红肉中N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)的预处理方式。将红肉通过水煮、微波加热和有机酸腌制等不同方式进行处理,利用酸水解法释放红肉中的两种唾液酸成分Neu5Gc和N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac),经1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧苯(1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene,DMB)衍生化后用高效液相色谱检测其含量;另外还采用β-半乳糖苷酶水解红肉,再测定水解液中的Neu5Gc和Neu5Ac。结果表明:沸水浴处理红肉后其Neu5Gc和Neu5Ac都有一定程度的解离,水煮时间越长,红肉中Neu5Gc和Neu5Ac解离效果越好,且猪肉中的Neu5Gc相比牛肉的更容易水煮解离。采用微波炉高温处理红肉也能够解离Neu5Gc,但是解离率不超过70.0%,且处理时间影响较小;而Neu5Ac的解离率都低于Neu5Gc。红肉通过不同的弱有机酸腌制处理后Neu5Gc和Neu5Ac解离率差别不大,且醋酸腌制处理后Neu5Gc解离效果较好。另外,β-半乳糖苷酶能有效解离猪肉中Neu5Gc,水解时间越长,解离率越高。对于牛肉,Neu5Gc解离率最高为84.0%,解离效果不如猪肉。     

高效液相色谱-荧光检测法测定发酵红肉制品中Neu5Gc

基于高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)技术,建立红肉发酵及制品中N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)的定量分析方法。成功搭建了以酸水解释放试样中的Neu5Gc,4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺盐(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride,DMB)为衍生化试剂,并采用安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱等系列条件的HPLC-FLD分析检测方法。该方法经验证:Neu5Gc在25～400μmol/L范围内与Neu5Gc峰面积的线性关系良好,R2=0.999 41;样品加标平均回收率在96.4%～99.07%之间;RSD为1.2%,重复性的RSD为1.5%;仪器检出限为0.001μmol/L,定量限为0.003μmol/L。检测发酵红肉样品中Neu5Gc的质量分数在9.59～20.08μg/g之间,不同的发酵红肉制品Neu5Gc的含量之间均存在显著性差异(p0.05)。本方法能有效分离Neu5Gc目标峰(分离度R1.5)、操作简单、重复性好、灵敏度和精密度高,可广泛用于发酵红肉制品中Neu5Gc的定量测定。     

9种鱼卵中的游离态及结合态唾液酸含量的分析比较研究

从不同品种鱼卵中提取出游离态唾液酸和总唾液酸，采用DMB试剂对这2种唾液酸分别进行衍生化标记，再利用高效液相色谱(HPLC)系统性对比分析了9种鱼卵中N-乙酰神经氨(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)的存在形式及含量的差异。结果表明，游离态和结合态的Neu5Ac在鲫鱼鱼卵中含量最高，每克鱼卵干重中分别含1.61μg和4.07μg;Neu5Gc仅存在于黄花鱼、鳜鱼和鲂鱼的鱼卵中，其中鲂鱼鱼卵中游离态Neu5Gc含量最高，每克鱼卵干重中含0.57μg；而鳜鱼鱼卵中结合态Neu5Gc含量最高，每克鱼卵干重中含0.24μg。以上结果为鱼卵的深度开发利用提供理论依据。     

肉制品中唾液酸含量和形态分析及在加工中的变化

本文主要运用了高效液相色谱法测量了我国牛肉、猪肉等常见肉类及常见熟食制品如火腿、香肠、卤牛肉、风干羊肉、香辣鸭脖中的两种唾液酸N-羟乙酰神经氨酸（N-Glycolylneuraminic acid,Neu5Gc）、N-乙酰神经氨酸（N-Acetylneuraminic acid,Neu5Ac）的含量、存在形式以及不同加工方式对其含量及存在形式的影响。结果表明红肉中Neu5Gc含量：牛肉46.57±2.53 μg/g>猪肉28.69±1.03 μg/g>羊肉29.09±2.32 μg/g,红肉中同时含有结合态Neu5Gc和游离态Neu5Gc,结合态Neu5Gc含量普遍高于游离态Neu5Gc。红肉中Neu5Ac含量：羊肉200.15±24.96 μg/g>猪肉110.89±5.71 μg/g>牛肉80.97±5.60 μg/g。白肉中不含Neu5Gc,鸭肉的Neu5Ac含量最高,为185.73±23.11 μg/g。熟食肉制品中,牛肉制品的Neu5Gc含量仍高于其他红肉熟食制品,并在白肉熟食制品中检测出了Neu5Gc的存在。对红肉进行蒸煮、油炸及腌制处理后Neu5Gc和Neu5Ac含量都有所下降,其中经过油炸处理的样品Neu5Gc和Neu5Ac含量下降最为明显,其次是腌制、蒸煮。本文还研究了蒸煮时间对猪肉中唾液酸含量的影响,即随着蒸煮时间的增加,Neu5Gc、Neu5Ac含量变化的总体趋势减少,蒸煮45 min后结合态唾液酸明显减少,游离态增多。即红肉中特异性含有Neu5Gc,白肉类熟食制品中也可能含有Neu5Gc,通过加工可改变肉制品中唾液酸的含量和形式,但是每种加工方式对于唾液酸含量及形式的改变不同。     

高效液相色谱法测定母乳中唾液酸含量

建立荧光高效液相色谱(fluorescence detector-high performance liquid chromatography,HPLC-FLD)测定母乳中唾液酸N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolyl neuraminic acid,Neu5Gc)含量的分析方法。利用酸水解法释放出母乳中的唾液酸,以4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺盐(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride,DMB)为衍生化试剂,50℃避光衍生150min,采用荧光高效液相色谱仪检测。色谱条件：LiChrosorb RP-18柱(250mm×4mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-超纯水(7:8:85),流速0.9mL/min,进样体积10μL,柱温30℃,荧光检测器激发波长373nm,发射波长448nm。结果表明：唾液酸在50～400μmol/L范围内与唾液酸峰面积的线性关系良好,平均回收率为94.0%,精密度的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.4%,稳定性RSD为1.0%,重复性RSD为0.8%,Neu5Ac的最低检出限为0.02μmol/L,Neu5Gc的最低检出限位0.03μmol/L。该方法简单、重复性好、灵敏度高,可广泛用于奶粉、牛奶及母乳中唾液酸含量测定。     

红肉中N-羟乙酰神经氨酸解离方法的研究进展

免疫原性的N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)属于致癌的高风险物质,人体中的Neu5Gc主要是通过红肉的摄入而在人体内积累,因此,N-羟乙酰神经氨酸的致癌性又将红肉的安全隐患问题推上了新的高度,探索屠宰前后Neu5Gc安全稳妥的解离方法以及解离机制势在必行。本文简要介绍了Neu5Gc的来源及其结构,通过国外学者对Neu5Gc的研究,揭示了Neu5Gc对人体潜在的致癌性危害,总结了国内外关于Neu5Gc解离方法的研究现状,并对采用分子模拟方法精准预测Neu5Gc的键解离能并获取红肉中Neu5Gc的动力学变化信息研究的可行性进行了讨论。本研究旨在为肉类研究及其生产领域探索促进非人源Neu5Gc解离的方法提供理论支撑,并充分展示其在肉类研究领域的研究价值。     

奶粉中N-乙酰神经氨酸的检测

建立一种高效液相色谱荧光测定奶粉中N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)含量的分析方法。该方法利用酸水解释放出奶粉中的Neu5Ac,用邻苯二胺盐(OPD)作为衍生化试剂,80℃避光衍生100 min,采用高效液相色谱荧光检测。色谱条件为:用Thermo Hypersil GOLD柱(250mm×4.6mm, 5μm)分离;流动相选择超纯水-乙腈作为梯度洗脱,柱温为30℃,流速为1.0mL/min;进样体积为10μL;荧光检测器激发波长为337 nm,发射波长为448 nm。结果表明:N-乙酰神经氨酸在0.5～200μg/g范围内线性关系良好(R~2=0.9994),回收率为98%～119%,检出限为0.5μg/g。该方法具有灵敏度高,重复性好等特点,可准确测定市售奶粉中N-乙酰神经氨酸的含量。     

不同加工处理方式对牛肉中Neu5Gc解离的影响

研究不同红肉及加工肉制品的N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc）含量,不同油炸温度对牛肉中Neu5Gc含量的影响,不同蒸煮时间对牛肉汤中Neu5Gc含量的影响以及不同酶制剂对Neu5Gc的解离效果并从中筛选出能够解离Neu5Gc的酶进行进一步探究。结果表明,牛肉中的Neu5Gc含量最高为（58.45±0.98）μg/g。当油炸温度达到150?℃时,牛肉中Neu5Gc的损失随着温度的升高而增大。随着蒸煮时间的延长,牛肉汤中Neu5Gc的含量逐渐增加。此外,研究结果表明菊粉酶对Neu5Gc有解离作用,且通过正交试验获得菊粉酶作用于Neu5Gc标准品的最适条件为水浴时间30?min、水浴温度50?℃、菊粉酶添加量为质量分数0.8%,对Neu5Gc标准品的解离率可达到（50.52±0.88）%。但是,由于牛肉基质成分复杂,筛选出的菊粉酶最适作用条件作用于牛肉时,解离率仅为（7.29±2.67）%。本实验旨在为人们的日常饮食提供科学指导,并为后续开展红肉中Neu5Gc安全、稳妥的解离方法提供实验依据。     

红肉中N-羟乙酰神经氨酸在人体中的代谢途径及危害

唾液酸(Sialic acid,Sia)是一类含有9个碳骨架的酸性糖类,在胚胎和中枢神经系统发育、细胞识别、黏附、分化、信号传导等多方面具有重要的生理意义。N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)是一种含有9个碳原子并具备吡喃糖结构的酸性氨基糖。Neu5Gc作为唾液酸中的一种比较特殊的存在,与人类癌症以及动脉粥样硬化、2型糖尿病等疾病的发生发展有着密切联系。该文主要阐述了Neu5Gc的基本结构以及在人体的来源、代谢、吸收和蓄积的过程,并介绍了红肉特异性致病理论及Neu5Gc的危害。     

高效液相色谱-串联质谱法测定母乳中的 N-乙酰神经氨酸

目的建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定母乳中N-乙酰神经氨酸的分析方法。方法用盐酸对样品进行酸水解释放出母乳中的结合态N-乙酰神经氨酸,高速离心后,采用C_(18)柱进行分离。以0.1%甲酸-乙腈溶液和0.1%甲酸-水溶液作为流动相进行梯度洗脱,电喷雾质谱检测,正离子多反应监测模式(MRM)进行定性和定量分析。结果在优化的条件下,N-乙酰神经氨酸在0.01~0.5 mg/L范围线性关系良好(r=0.9997)。以10、50、100 mg/kg 3个添加水平进行加标回收试验,N-乙酰神经氨酸的平均回收率为95.0%~98.7%,相对标准偏差为11.6%~14.5%,N-乙酰神经氨酸的检出限为0.21μg/kg。结论该方法简单、快速、重复性好、灵敏度高,可广泛用于母乳中N-乙酰神经氨酸的测定。     

Comparison of spectrophotometric and HPLC methods for determining sialic acid in infant formulas

Two methods for determining sialic acid in infant formulas – spectrophotometry and HPLC with fluorescence detection – have been optimised and validated, the first one allows to determine total sialic acid while the second allows to differentiate the two main forms of sialic acid (N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) and N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc)). A common sample preparation procedure (hydrolysis and purification) for both methods has been proposed. The linearity (from 6 to 150 μg of total sialic acid in the assay for spectrophotometry, and from 12.5 to 250 ng and 1 to 5 ng of Neu5Ac and Neu5Gc, respectively, for HPLC) is adequate. The detection and quantification limits (0.29 and 0.97 mg of total sialic acid/L of reconstituted sample, respectively, for spectrophotometry, and 0.03 and 0.08 mg Neu5Ac/L; 0.003 and 0.009 mg Neu5Gc/L of reconstituted sample, respectively, for HPLC) are low enough for the determination of sialic acid in infant formulas. The precision of both methods, expressed as relative standard deviation, is less than 6%, and the accuracy evaluated by recovery assays show 104% recovery for spectrophotometry; 95% for Neu5Ac and 109% for Neu5Gc for HPLC. Samples analysed show no significant differences (α < 0.05) attributable to the method used; consequently, both of them could be applied after common sample preparation, the choice of technique depending on the facilities available in the laboratory.     

Rapid and simple method for the determination in sialic acid of yak milk fat globule membrane

A rapid and simple method for the determination of sialic acid (Neu5Ac) of yak milk fat globule membrane (MFGM) by HPLC with a diode array detector was developed and validated. Samples were cleaned up just by hydrolysis and derivatization before HPLC analysis. Separation was achieved with an Agilent TC-C18 column. The method showed a good linearity (r=0.997), the sensitivity results showed that the limits of detection and limits of quantification for sialic acid were 10.0 and 21.0 μg/mL, respectively. The recovery of Neu5Ac was 95–97%. The method proved very simple and rapid for Neu5Ac analysis since separation was completely achieved at 12 min.     

Determination of sialic acids in infant formula by chromatographic methods: a comparison of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection and ultra-high-performance liquid chromatography methods

Sialic acid determination in an infant formula presents many challenges, including efficient sialic acid release from glycoconjugates, effective sample preparation, and rugged chromatography. This work compares 2 chromatographic assays developed for determination of sialic acids in infant formula. Prior to chromatography, both assays release sialic acids by acid hydrolysis and treat the hydrolysate with a subsequent anion-exchange sample preparation. Both high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) and fluorescence ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC) sample analysis methods were evaluated to compare assay performance and convenience. Calibration ranges were chosen to encompass the expected amounts of 2 sialic acids in infant formula: N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) and N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc). Response was linear by either method with coefficients of determination of 1.00 by HPAEC-PAD between 5.0 and 100pmol of Neu5Ac and between 0.34 and 6.8 pmol of Neu5Gc and >0.99 by UHPLC between 5.0 and 260 pmol of Neu5Ac and between 0.20 and 9.8 pmol of Neu5Gc. Both methods had sufficient sensitivity to determine these sialic acids in infant formula. Three infant formulas were analyzed to evaluate accuracy and precision of the assays. The HPAEC-PAD assay was found to be faster overall and the UHPLC assay was more sensitive. Reaction efficiency, and therefore sensitivity, was dependent on the sample matrix. This work illustrates sample-specific complexity that must be considered in choosing an assay.     

N-丙酰-唾液酸衍生物的化学酶法合成及在测定禽蛋中唾液酸含量的应用

为实现禽类蛋黄和蛋清中N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac）的准确定量,消除禽蛋样品中分析物以外的物质产生的基质效应对分析结果造成的影响,本研究以甘露糖胺为底物采用化学酶法合成了非天然唾液酸衍生物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷-N-丙酰-唾液酸（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside-N-propionyl-sialic acid,X-Gal-α-2,6-Neu5Prop）,对该衍生物在酸性条件下的水解特性以及稳定性进行研究,并以该衍生物为内标测定了鹌鹑、鹅、珍珠鸡、鸵鸟、鸭、鸽子、火鸡等9种禽类蛋黄和蛋清中Neu5Ac的含量。禽蛋样品和内标物在酸性条件下处理,唾液酸糖缀合物被解离为游离的唾液酸后经荧光标记物邻苯二胺衍生,采用高效液相色谱-荧光检测器对样品进行分析。结果表明,相同浓度的X-Gal-α-2,6-Neu5Ac和X-Gal-α-2,6-Neu5Prop在2 mol/L的醋酸溶液80℃的水解条件下水解程度相当,90 min后能够完全转化为游离的唾液酸。Neu5Ac和Neu5Prop在10 h内仍保持相似的稳定性。蛋清中Neu5Ac的含量在不同物种之间表现出很大的差异。鹌鹑蛋清中Neu5Ac的含量最低（0.13 mg/g）,而鸵鸟蛋清中的最高（2.20 mg/g）,比鹌鹑蛋清Neu5Ac含量高出近17倍。该方法能够消除生物样品中的基质效应,实现对Neu5Ac的准确定量,且样品前处理简单。因此,适合常规食品中Neu5Ac的检测与分析。     

红肉、N-羟乙酰神经氨酸与癌症关系的研究进展

世界癌症研究基金会报告指出,过多摄入红肉会增加患癌症的风险,红肉可能是导致某些癌症的原因之一。有研究得出,摄入红肉后身体内产生的一种唾液酸--N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc）可能与癌症的发生有关。本文从红肉与癌的关系,引出对Neu5Gc的讨论,从它的结构、来源、生理功能到临床应用价值,最后是与癌症可能的机制讨论,并重申它的研究价值。     

传统中式火腿加工过程中N-羟乙酰神经氨酸的动态变化

为探究传统中式火腿加工过程中不同形态N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）之间的关系，采用高效液相色谱-荧光检测（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）法测定样品中总Neu5Gc、游离态Neu5Gc、结合态Neu5Gc的含量。结果表明：上述3 种形态的Neu5Gc含量随着加工时间的延长均呈前期上升后期降低的趋势；浅层肌肉半膜肌和深层肌肉股二头肌中总Neu5Gc和结合态Neu5Gc的含量变化规律相似，因水分含量降低程度的不同而使股二头肌的变化规律滞后。发酵后期水分损失幅度变缓，股二头肌中Neu5Gc解离速率高于半膜肌；新鲜猪后腿原料中游离态Neu5Gc含量极少，甚至低于检测限，结合态Neu5Gc含量与总Neu5Gc含量（15.00～30.62 μg/g）接近。发酵半年、1 年和2 年的火腿中总Neu5Gc含量分别为（15.09±0.39）、（14.52±0.38）、（28.30±0.43）μg/g，均与猪后腿原料中的Neu5Gc含量相近。为进一步探究Neu5Gc的变化，对样品进行冷冻干燥处理以避免水分含量变化对Neu5Gc含量的影响，结果表明，随着加工时间的延长，总Neu5Gc、结合态Neu5Gc的含量逐渐降低，且发酵期降低明显，具有显著差异性（P＜0.05）；游离态Neu5G变化无明显规律，但与空白样品相比，其含量呈增加趋势。     

牛免疫球蛋白G的体外人源唾液酸化及Fc片段的制备

建立将牛免疫球蛋白G（bovine immunoglobulin G,bIgG）糖链末端N-羟乙酰神经氨酸酶切并连接人源N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac）的方法,在实现bIgG转化为人源IgG（human IgG,hIgG）的基础上,研究hIgG可结晶（Fc）片段的制备。结果表明：以170 U/mL神经氨酸酶酶切bIgG（4.0 mg/mL）后,通过β-1,4-半乳糖基转移酶和α-2,6-唾液酸转移酶分别转移半乳糖（galactose,Gal）和Neu5Ac残基,可制备增加8.4 个Gal残基和42 个Neu5Ac残基的hIgG分子。此外,在10.0 mg/mL hIgG、m（木瓜蛋白酶）∶m（hIgG）＝0.05、10.0 mmol/L半胱氨酸激活剂、2.0 mmol/L EDTA溶液、pH 7.0条件下,酶解3 h可制得hIgG的较高纯度Fc片段,最终hIgG得率为71.7%,Fc片段得率为20.8%。本研究为bIgG的产品开发和营养价值评价提供科学依据。     

Determining Neu5Ac in infant formula with ultra‐performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry

The aim of this work was to measure N‐acetylneuraminic acid (Neu5Ac) in milk‐based infant formulas. The analysis was performed by ultra‐performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry (UPLC‐MS/MS). The total Neu5Ac were released using trichloroacetic acid and hydrochloric acid and purified using a HLB column. The linearity from 0.05 to 5.0 μg/mg Neu5Ac was adequate. Sialic acid recoveries ranged from 91.8% to 112.4%. The detection and quantification limits (limit of detection, 0.01 μg Neu5Ac/mg; limit of quantitation, 1.08 μg Neu5Ac/mg) were low enough to determine the sialic acid in infant formulas. The validated method is highly reproducible and sensitive, and it is easy to perform.