紫外诱变法选育酒酒球菌乙醇胁迫耐受菌株及其发酵性能研究

该研究以酒酒球菌（Oenococcus oeni）SD-2a为研究对象,采用紫外诱变法选育乙醇胁迫耐受突变菌株,评价其在乙醇胁迫条件下的生长能力,并测定其产β-葡萄糖苷酶活性及其在模拟酒中苹果酸、乳酸含量及活菌数的变化。结果表明,分离筛选到3株乙醇胁迫耐受性好的突变菌株,分别编号为UVe1、UVe2、UVe3,在高体积分数乙醇（12%和14%）胁迫环境下,3株突变菌株的生长速度均显著高于出发菌株SD-2a（P＜0.05）;突变菌株UVe2的β-葡萄糖苷酶活性显著高于出发菌株SD-2a和对照菌株L-450（P＜0.05）;在模拟酒中,3株突变菌株的苹果酸降解与乳酸生成速度均显著高于出发菌株SD-2a（P＜0.05）,且突变菌株UVe1和UVe2的存活率显著高于出发菌株SD-2a（P＜0.05）;综上,突变菌株UVe2具有优良商业酒酒球菌的潜力。     

酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性与耐酸胁迫能力的相关性分析

目的:β-葡萄糖苷酶是葡萄酒中结合态香气物质释放的关键酶,但其活性受诸多因素的影响。本研究旨在从酒酒球菌自身耐酸能力的视角去分析评估菌株糖苷酶活性,探索酸胁迫下不同耐酸表型酒酒球菌与其β-葡萄糖苷酶活性之间存在的相关性关系。方法:结合利用离子注入诱变与胁迫环境筛选的方式,获得耐酸(p H 3.0)、酸敏(p H 9.0)突变酒酒球菌菌株,对其β-葡萄糖苷酶的活力进行测定,并筛选3组酸胁迫下表型差异大的β-葡萄糖苷酶基因送样测序。结果:耐酸突变酒酒球菌的β-葡萄糖苷酶酶活力是出发菌株的2~4倍,是相应酸敏突变株的2~7倍。测序结果显示,除菌株a3的β-葡萄糖苷酶基因在108位(G置换成C)和1 232(A置换成T)位处发生了突变外,其余菌株β-葡萄糖苷酶的基因均未发生改变。结论:酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性与菌株酸胁迫能力显著相关(P0.05)。耐酸胁迫能力越强的菌株,β-葡萄糖苷酶活性越高。     

酒类酒球菌β-葡萄糖苷酶研究进展

酒类酒球菌（Oenococcus oeni）是葡萄酒苹果酸乳酸发酵（MLF）中的主要微生物,糖苷物质是葡萄酒中的重要香气前体物,β-葡萄糖苷酶是降解糖苷物质的关键酶。酒类酒球菌β-葡萄糖苷酶对增加葡萄酒香气,提升葡萄酒整体品质具有重要作用。该文介绍了β-葡萄糖苷酶的定义、分类、作用机制和测定方法,阐述了酒类酒球菌β-葡萄糖苷酶活,探讨了pH值、发酵温度、乙醇浓度、糖含量和二氧化硫含量对酶活的影响,在分子生物学水平上研究了酒类酒球菌β-葡萄糖苷酶基因,并对酒类酒球菌葡萄糖苷酶未来的研究热点和研究方向进行了展望。这对深入认识葡萄酒生物增香机理和提高葡萄酒整体品质具有重要意义。     

耐酸与酸敏酒酒球菌环丙烷脂肪酸合酶基因的差异

目的:研究筛选得到的野生耐酸与酸敏酒酒球菌环丙烷脂肪酸基因(cfa)的差异,探索酒酒球菌环丙烷脂肪酸基因与酒酒球菌耐酸性的相关性。方法:35株野生酒酒球菌中,利用酸胁迫环境筛选耐酸能力最强的菌株,并与野生酸敏菌SX-1b及实验室离子注入诱变的耐酸、酸敏突变菌a3、b2共同进行环丙烷脂肪酸基因cfa的克隆、测序和比对;选择存在氨基酸突变的野生耐酸酒酒球菌及野生酸敏菌株的cfa基因在植物乳杆菌ATCC33222中进行外源表达,从而验证耐酸菌株cfa基因与耐酸能力的相关性。结果:(1)筛选出野生型耐酸酒酒球菌CS-7b和ME-5b,确定其耐酸生长极限为p H 2.6;(2)对野生菌与诱变菌的cfa基因进行测序比对发现,耐酸菌株的野生型和诱变型的序列相同,较酒酒球菌PSU-1发生3处碱基突变,而酸敏菌野生型、诱变型的序列则与酒酒球菌PSU-1一致;(3)将SX-1b与CS-7b的cfa基因在植物乳杆菌中表达,构建重组载体pMG36ecfa1和pMG36e-cfa2,并得到对应重组菌L1和L2;(4)在pH 3.6培养基中培养,重组菌L1和L2的生长情况明显优于含空载体的植物乳杆菌L0,且L2的生长优于L1。而在p H 3.4培养基中培养,L0没有生长迹象,只有重组菌L1和L2正常生长,cfa基因的导入突破了植物乳杆菌宿主菌的生长极限。结论:酒酒球菌cfa基因及基因间存在的稳定差异与菌株耐酸表型具有一定相关性。     

酒酒球菌高密度培养条件的优化

酒酒球菌（Oenococcus oeni）主导的苹果酸-乳酸（MLF）发酵是优质葡萄酒生产的重要工艺环节,制备高活菌数的酒酒球菌发酵剂是保障该环节顺利进行的重要前提之一。研究发现,一定量的L-苹果酸可以有效促进酒酒球菌的生长,并通过高密度培养条件优化提高酒酒球菌菌体密度。结果表明,通过正交试验得出的最佳高密度培养条件为初始pH值5.1、接种量3%、L-苹果酸添加量1 g/L。在此优化条件下,酒酒球菌ES-1的菌体密度较高,为（7.33±0.40）×109 CFU/mL;进一步结合化学中和法和半连续培养法,可使最终菌体密度达（1.67±0.11）×1010 CFU/mL,是对照组的11倍。该研究获得的高密度培养优化方案可为制备优质本土酒酒球菌发酵剂奠定基础。     

中国主要葡萄酒产区酒酒球菌糖苷酶活性

在苹果酸乳酸发酵（malolactic fermentation,MLF）过程中,一些酒酒球菌产生的糖苷酶活性受葡萄酒环境的影响,筛选并利用在酿酒环境中具有高活力糖苷酶的菌株进行MLF,有助于提升葡萄酒的香气复杂性。本实验以中国5 个酿酒产区19 株酿酒特性优良的酒酒球菌和一株商业菌为实验菌株,通过测定5 种糖苷酶活性,对其中5 株糖苷酶活性高的菌株研究其在葡萄酒环境中糖苷酶的酶学性质。结果表明：20 株菌在相应底物作用下均含有可检测到的糖苷酶活力,不同菌株酶活性差异显著,地区间差异不显著。5 株糖苷酶活性高的菌株最适pH值为4.0,最适温度为45 ℃,在低水平（4%乙醇＋0.1 g/100 mL果糖）时有促进作用,高水平（14%乙醇＋2 g/100 mL果糖）时抑制作用显著,葡萄糖则表现为抑制作用,但各种酶活性表现为菌株依赖性。在模拟酒条件下,菌株相对酶活力仅是菌株酶活力的9.805%～32.331%。总之,在所选菌株中,SD-1f在葡萄酒环境中的糖苷酶活性最高。     

葡萄酒苹果酸-乳酸发酵优良菌株的筛选与发酵性能分析

酒球菌是进行苹果酸-乳酸发酵（malolactic fermentation,MLF）的主要微生物,在酿酒工业中占有重要地位。该研究从山东地区栽培广泛的公酿一号葡萄酒中分离出63株微生物,最终获得5个耐酸、耐乙醇的菌株。通过16S rRNA基因序列分析鉴定为酒酒球菌。在发酵性能分析中,菌株GM1039和GM1041在模拟葡萄酒中的降酸能力显著优于对照菌株,且在发酵过程中保持了较高的活细胞数。     

不同发酵条件对模拟葡萄酒中酒酒球菌柠檬酸代谢的影响

以酒酒球菌31-DH进行模拟酒苹果酸-乳酸发酵,使用离子排斥色谱法测定相关代谢物质的含量,研究苹果酸-乳酸发酵期间及发酵后p H、乙醇和葡萄糖对柠檬酸代谢的影响。结果表明:该方法耗时短、前处理简单、分离度良好、回收率为87%~108%、精密度为0.77%~4.33%,满足分析要求。当发酵液处于低p H,高酒精度,低葡萄糖浓度时,柠檬酸代谢缓慢,乳酸、乙酸及2,3-丁二醇的产量较低,双乙酰含量峰值较高。当发酵液中不含有乙醇时,苹果酸、柠檬酸、葡萄糖代谢迅速,伴随菌体的大量生长,乳酸、乙酸、2,3-丁二醇含量较高,但无双乙酰的产生。当发酵液中不含有葡萄糖时,柠檬酸代谢速率加快,乳酸产量较低,2,3-丁二醇及双乙酰产量较高。p H、乙醇、葡萄糖均显著影响酒酒球菌31-DH对柠檬酸的代谢。     

酒类酒球菌的分离及发酵适应性研究

对我国葡萄酒主产区的酒类酒球菌进行了分离和筛选。通过考查分离菌株苹果酸—乳酸发酵性能后,对鉴定为酒类酒球菌的127株菌株进行了pH、SO2和酒精单因素耐受性试验,然后再选择抗性较好的初选菌株(8株)进行复合因子(pH×酒精×SO2)梯度筛选实验。结果表明,有4株酒类酒球菌分离株具有较强的苹果酸—乳酸发酵适应性,其中分离菌株O.oeniSD-2a对胁迫条件的适应性显著高于对照商业菌株O.oeni31DH。     

酒酒球菌和酿酒酵母共接种发酵动力学模型建立

为研究酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和酒酒球菌(Oenococcus oeni)共发酵过程中菌体生长、底物消耗和产物生成的动力学变化,选取本土O.oeni ZX-1、MG-1分别与S.cerevisiae VW、AW同时接种,每隔24 h测定发酵体系内S.cerevisiae活菌数、还原糖含量、乙醇体积分数、O.oeni活菌数和L-苹果酸含量,采用经典Logistic、Boltzmann、SGompertz和DoseResp模型对测定值进行非线性拟合。结果表明,Boltzmann模型可以较好地反映S.cerevisiae生长和乙醇体积分数变化;Logistic模型对还原糖含量变化拟合效果最佳;4个处理组的O.oeni生长和L-苹果酸含量变化动力学模型中,Boltzmann模型和DoseResp模型拟合系数R²一致,均能较好预测共发酵过程中O.oeni生长和L-苹果酸含量的变化趋势。综合分析,供试本土O.oeni分别与S.cerevisiae VW、AW共接种均可顺利完成发酵,建立的动力学模型可为本土菌株的工业化酿酒工艺优化控制提供数据...     

Interaction of pH, ethanol concentration and wine matrix on induction of malolactic fermentation with commercial 'direct inoculation' starter cultures

The effect of the interaction between pH (2.9–3.5), alcohol concentration (12.5–14.5% v/v) and wine matrix (Chardonnay, Grenache blend and Cabernet Sauvignon) on malolactic fermentation (MLF) induced by two commercially available directly inoculated Oenococcus oeni starter cultures was determined. Wine matrix had greatest impact on the rate of MLF, followed by pH and alcohol; the matrix effect was significantly modified by pH and bacterial culture. The rate of L-malic acid degradation by starter culture A was 3.3–61.3% in the Grenache blend and 3.3–4.5% in the Chardonnay wine compared to the Cabernet Sauvignon wine, for the pH/alcohol ranges 2.9/14.5 to 3.5/12.5. L-malic acid degradation rate by starter culture B was lower but less affected by wine matrix. The rate of L-malic acid degradation was closely related to culture viability, with a high rate of L-malic acid degradation being associated with bacterial growth and vice versa . Treatment of two wines in which MLF had previously failed to complete with various combinations of nutrients, carbon fining and heating, restored MLF, suggesting that a growth-limiting nutrient was absent and/or a toxic substance not related to pH, alcohol or SO₂ concentration was present. This work demonstrated that the wine matrix may affect culture viability more significantly than either pH or alcohol concentration. A high rate of MLF was shown to depend on factors permitting bacterial growth, however, the two strains studied responded differently to the wine matrix, suggesting that malolactic bacteria vary in tolerance to various stresses in the wine environment.     

优良降酸酵母菌的筛选及发酵性能

以能够降解L-苹果酸的酿酒酵母FM-cs-08为出发菌株,分别进行紫外诱变和60Co诱变,旨在诱变得到降酸能力显著提高又具有良好发酵性能的酿酒酵母菌。最终筛选得到诱变菌株FM-cs-08-2U,降L-苹果酸比率达到（29.48±0.21）%,比出发菌株提高了（25.44±0.89）%。对诱变菌株FM-cs-08-2U的耐受性及发酵特性进行研究,结果表明该菌株耐受最低pH值为2.5,耐受最高SO2质量浓度为800 mg/L。用FM-cs-08-2U发酵蓝莓果酒,得到果酒残糖量（3.70±0.10）g/L,pH值为3.18±0.01,有机酸含量（8.64±0.02）g/L,酒精度（12.00±1.00）%,结果证明菌株FM-cs-08-2U适合酿造蓝莓果酒。     

植物乳杆菌R23产苹果酸乳酸酶特性研究

目的:为苹果酸乳酸酶(MLE)酶制剂的生产和果酒的生物降酸提供理论依据。方法:以植物乳杆菌R23为材料,研究乳酸菌生物量、培养温度、pH值、L-苹果酸浓度、NAD+含量及供厌氧等环境条件对其产MLE能力的影响。结果及结论:植物乳杆菌R23在对数生长期内,产MLE的量及其活力随着菌量的增加而增加;产酶活力较高的时期是在细菌生长进入稳定期的4～8h内;植物乳杆菌R23最适产酶温度35℃,pH6.0～7.0;适量的L-苹果酸和NAD+以及厌氧发酵对其产酶和酶活力均有促进作用。     

Differentiation of Australian wine isolates of Oenococcus oeni using random amplified polymorphic DNA (RAPD)

Intraspecific variation of Oenococcus oeni , the preferred lactic acid bacteria species for inducing malolactic fermentation in wine, was studied using the randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) strain fingerprinting technique. Ten of fifteen isolates of O. oeni from Australian wineries situated in different wine regions could be distinguished by the RAPD technique. Strains of O. oeni which originated from the same winery were either indistinguishable or closely related to each other. Six different commercially available O. oeni strains could be differentiated with the four RAPD primers used and their genetic similarity determined. Analysis of O. oeni present in wines from a single source of fruit (Cabernet Sauvignon, vintage 2002) that underwent spontaneous malolactic fermentation revealed wide genetic variation amongst the isolates. Each fermentor contained several different O. oeni strains, which were present throughout alcoholic and malolactic fermentation. These data highlight the sensitivity of RAPDs when suitable primers are applied to O. oeni of unknown genetic origin, thus enabling O. oeni strains with desirable sensory and fermentation properties to be genetically analysed.     

不同酒类酒球菌苹果酸—乳酸发酵对葡萄酒中氨基酸的影响

不同酒类酒球菌茵株完成MLF后,葡萄酒中氨基酸均发生显著变化:种类增多,诸多氨基酸含量提高。SD-2a发酵酒样中的丙氨酸和谷氨酸、SD-1b发酵酒样中甘氨酸、丝氨酸和脯氨酸、SD-2h酒样中谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸含量明显增加;含量呈极显著增加的氨基酸为:在SD-2h发酵酒样中的丙氨酸、在SD-1b发酵酒样中的丙氨酸、缬氨酸和谷氨酸;对照菌株31DH发酵酒样中各种氨基酸的增减没有达到显著水平。葡萄酒学院分离筛选的3个菌株发酵酒样中的精氨酸含量增加,而对照菌株31DH则有所降低。因此,3个菌株代谢特性良好,在葡萄酒中不会导致致癌物质——氨基甲酸乙酯的前体物脲、瓜氨酸等的过多合成。鉴于各种氨基酸独特的生化和生理特性,3株酒类酒球菌菌株完成MLF后,氨基酸种类、含量的增加可以提高葡萄酒的营养价值和保健功能。