以变性染色皮粉为底物的蛋白酶活力检测方法研究

以活性染料Remazol brilliant blue R(RBB)对皮粉进行染色,制备了在较宽的pH范围内稳定的热变性染色皮粉。研究了反应时间、底物和蛋白酶浓度等因素对酶催化染色皮粉水解速度的影响,建立了一种基于变性皮粉-RBB底物的蛋白酶活力检测方法。用建立的方法,对几种常用的制革蛋白酶进行酶活力测定,并与常用的基于酪素底物的福林法和LVU法进行对比,结果表明:对于大部分蛋白酶,2种底物检测结果有较大差异。     

蛹虫草发酵液活性多糖微量测定方法的建立与评价

为准确、快速检测蛹虫草发酵液中活性多糖的含量,以蒽酮-硫酸法为基础,将常规测试体系缩小10倍,系统研究水浴时间、显色剂质量浓度、葡萄糖质量浓度及其二者浓度比对测定结果的影响;建立并评价蛹虫草发酵液活性多糖微量测定方法。结果表明,常规法在波长624 nm处有最大吸收;微量测定体系波长选择为630nm,与常规法相比相对误差小于2%;在微量测定体系下沸水浴8 min,蒽酮显色剂质量浓度2 mg/m L,葡萄糖标准溶液质量浓度0.1~0.5 mg/m L时,测定结果与常规法测得的数值相关性达到0.999,表明可采用建立的微量法来代替常量法快速检测蛹虫草发酵液活性多糖的含量。     

福林酚法测定酿酒白曲酸性蛋白酶活力的条件试验

在国标GBT23527-2009福林酚试剂法测蛋白酶活力的基础上,以自产白曲为材料,研究底物浓度,反应时间,酶液浸取时间以及三氯乙酸沉淀时间对酶活测定结果的影响,并对方法进行部分改进。实验结果显示:国标法测白曲酸性蛋白酶活力时,存在底物不足的问题,利用Hanes作图法求得该酶米氏常数Km约为2.67g/L,确定底物酪蛋白浓度为30g/L;由反应进程曲线得到,反应时间5min更适合酶活测定;酶液浸取时间长会增加比色测定时背景值的干扰,在不影响测定结果的情况下,缩短了酶液的浸取时间;充分摇匀的前提下,三氯乙酸沉淀时间对测定结果无显著影响。     

纸色谱法用于α-葡萄糖苷酶抑制动力学跟踪的研究

将纸色谱测定微量葡萄糖的方法移植到α-葡萄糖苷酶活性测定及其抑制动力学筛选跟踪，优化了以麦芽糖为底物的反应条件，并以甘草α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选为例证实了该法的可行性。试验结果表明：1）酶反应最佳条件：底物浓度10mg／mL、酶用量为100耻L、反应时间8h；2）纸色谱法测定微量葡萄糖最佳条件：点样量70μL、展开体系正丁醇-丙酮-水（2：7：1）、展开方向为径向、比色波长为365nm；3）甘草水提物及其多糖、皂甙、黄酮组分均为α-萄糖苷酶抑制剂，其中水提物和黄酮组分抑制效果较好。该法堪为传统Trembly法的可靠替代，尤其是在天然植物色素难以脱除，严重干扰比色时更是如此。     

基于MnO2纳米片类氧化酶特性的有机磷农药荧光分析方法建立

利用MnO2纳米片类氧化酶特性并结合有机磷农药的酶抑制原理,构建一种快速、简便、高灵敏有机磷农药荧光分析方法。通过测定反应体系荧光强度前后的变化,可以检测样品中有机磷农药的含量。通过优化酶浓度、底物浓度和反应时间,发现乙酰胆碱酯酶浓度为9.375 U/L,底物浓度为10 mmol/L,反应时间为11 min时,该荧光分析方法检测性能最佳,对氧磷的动态检测范围为1.56～200 ng/mL,检出限达到0.5 ng/mL（RSN=3）,运用该方法测定标准添加的自来水、卷心菜、燕麦样品的回收率在83.4%～105.9%之间,表明该方法具有很高的灵敏度与准确性,为快速高灵敏测定有机磷农药提供一种新的可能。     

微量测定木聚糖酶活力的新方法——MBTH法

建立一种木聚糖酶活力的微量测定新方法--3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法。根据木聚糖及其酶解产物的特殊性,研究MBTH法的显色条件,并以多点测定法对酶活力测定中的几个关键参数进行探讨。结果表明：蛋白质在其质量浓度低于30μg/mL时对测定无干扰;木聚糖溶液的最佳测定质量浓度为4mg/mL;较高的酶解温度会使木聚糖酶在测定过程中失活,因此,酶活力测定的最佳温度为30℃,而远低于该酶的最适温度;酶解时间为60min以内;酶解产物与MBTH试剂的反应时间应控制在13～16min之间,以15min为最佳。以酶解时间为30min计,本法检测限为0.135mU/mL,定量限为0.451mU/mL,适当延长酶解时间可相应提高酶活力检测灵敏度。该法准确度高,结果稳定,灵敏度远高于DNS法。     

测定发酵调味品中微量铁的新法研究

研究发现,在H2SO4介质中,微量铁(Fe3+)对过氧化氢氧化甲基红的褪色反应具有明显的催化作用。铁的浓度在一定范围内与lgA0/A有良好的线性关系(A0为非催化反应溶液的吸光度,A为催化反应溶液的吸光度),用于发酵调味中微量铁的测定得到了较满意的结果。文中确定了测定的最佳酸度、温度、反应时间和试剂用量,从而建立了测定发酵调味品中微量铁的新方法。该法的检测下限为4.0×10-9g/mL,测定范围为4～20ng/mL,标准加入平均回收率为95.4%。     

纤维素酶的CMC酶活测定条件的研究

研究和分析了羧甲基纤维素酶(CMC酶)活性测定法的实验条件.通过单因素实验对酶促反应时间、酶促反应温度、pH、测定波长、底物浓度、粗酶液和底物添加量六个影响因素进行了研究.最后结合正交实验、方差分析和多重比较.确定了纤维素酶活力测定的最佳条件组合.结果表明,在pH6.2、粗酶液和底物添加量各为2mL的情况下,影响纤维素酶活力测定的主次因素依次为酶促反应时间、酶促反应温度、测定波长和底物浓度.纤维素酶活力测定的最佳条件为:在酶促反应温度为40℃,pH6.2,底物浓度为10g/L,粗酶液和底物添加量各为2mL,酶促反应时间30min,测定波长为520nm.     

基于酶反应动力学理论优化脂肪酶活力测定体系

为了提高棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)法测定脂肪酶活力的灵敏度和准确度,以来源于Rhizopus oryzae的脂肪酶Lipase F-AP 15为研究对象,首先对其最适反应pH和反应温度进行优化,然后将表面活性剂作为激活因子引入酶活力测定体系,探究影响机制,并依据酶反应动力学理论优化测定条件(底物浓度、酶质量浓度、反应时间),对优化的p-NPP法的重复性和准确性进行了检验,最后以另一个来源的脂肪酶Lipase-PPL为模型,以同样思路与方法改进与优化其酶活力测定体系,以考察优化方法和思路的适用性。结果表明：表面活性剂PEG 8000的引入使得覆盖在脂肪酶活性位点的α-螺旋结构被重排而打开,脂肪酶由封闭构象转为并保持在活化构象,脂肪酶活性增强;优化测定体系的最适条件为pH 8.0、反应温度30℃、酶质量浓度1.00 mg/mL、底物浓度6 mmol/L、反应时间5 min,在此条件下测得的酶活力是常用p-NPP法(pH 8.0、反应温度30℃、酶质量浓度2.50 mg/mL、底物浓度10 mmol/L、反应时间8 min)测得酶活力的1.4倍;重复性和准确性试验显示,优化p-NPP法重...     

基于纳米酶技术检测柑桔果实中葡萄糖

目的建立纳米酶检测体系快速检测葡萄糖含量的技术。方法采用甲烷氧化细菌的发酵代谢产物甲烷氧化菌素(methanobactin,MB)与Cu²⁺、纳米金(AuNPs)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,Gox)进行配位结合形成具有过氧化物酶和葡萄糖氧化酶性质的纳米酶检测体系,并对柑桔果实中葡萄糖含量进行测定。结果Gox浓度0.81 U/mL、MB-Cu@AuNPs模拟酶浓度2×10^-5mol/L、对苯二酚浓度5×10^-4mol/L、反应温度60℃、pH 8为最佳检测条件;反应时间5 min,葡萄糖浓度线性范围为1×10^-3-5×10^-2mol/L。结论纳米酶检测体系对柑桔果实中葡萄糖含量的测定具有良好的稳定性,相比较常规快速血糖仪检测速度更快。     

纤维素酶活测定影响因素的研究

研究和分析了3,5-二硝基水杨酸法测定羧甲基纤维素酶糖化力的实验条件,尤其是对测定波长的选择、底物和酶液加量、空白样的选择、酶液稀释倍数对酶活的影响等方面进行了创新性的探究;另外对常规性的影响因素:酶促反应时间、反应pH、底物的浓度等传统因素做了研究。实验表明:在40℃,pH4.6,底物浓度为10g/L,底物和酶液加量各2mL,酶促反应时间5min,空白样选择终止空白,测定波长480nm处测定OD值比较适宜。     

蛋白酶水解啤酒糟蛋白动力学研究

为了研究蛋白酶水解啤酒糟蛋白的动力学性质,采用pH-stat法,以蛋白酶对啤酒糟中提取的蛋白进行水解处理.探讨了底物浓度[S]、酶与底物浓度比[E]/[S]和反应时间t对产物水解度DH的影响.建立了[S]及t同DH间的数学模型.通过不同底物浓度加碱量随水解时间的变化速度,测定出蛋白酶水解啤酒糟蛋白的K_m值.     

脂肪酶水解壳聚糖作用研究

通过还原端基含量测定、粘度测定研究了脂肪酶非专一性对壳聚糖的降解作用,探索了酶反应过程中温度、pH、加酶量、底物浓度、反应时间、金属离子等因素对脂肪酶降解壳聚糖的影响,以及不同脱乙酰度和不同分子量的壳聚糖与脂肪酶降解反应的关系。结果表明,以壳聚糖为底物的脂肪酶的一些催化特性为最适温度50～55℃,最适pH5～5.5,反应时间在3～4h范围内;降解作用随着酶用量和底物浓度的增加而增加,水解反应不符合Michaelis-Menten方程;3mmol/L的Cu2 ,10mmol/L的Mg2、Ca2 对脂肪酶有一定的激活作用,10mmol/L的Ba2 、Zn2 、Fe3 对该酶有一定的抑制作用,随着底物壳聚糖脱乙酰度的提高,降解速度降低。     

酶底物法快速检测食品中的大肠埃希氏菌

目的将水质检验的酶底物法用于食品检验,探索酶底物法是否能快速检测食品中的大肠埃希氏菌。方法测定食品样品,比较酶底物法与传统鉴定法结果的一致性。结果传统方法检出24份阳性和8份阴性,酶底物法检出25份阳性和7份阴性。实验结果进行X~2检验,结果无显著性差异(X~2=0.087,P0.05)。32份样品MPN值结果一致,8份样品MPN值有差异,其中7份样品酶底物法的MPN值大于传统法。结论酶底物法可用于食品中大肠埃希氏菌的快速检测,具有快捷简便、特异性高的优势。     

简易半微量凯氏定氮法

在酱油生产过程中,原料中蛋白质和酱油成品中全氮的测定是两个比较重要的项目。蛋白质和全氮的测定常采用凯氏定氮法,此法又分为常量、半微量、微量法三种。国家标准规定为半微量凯氏定数法。根据调查,山东省绝大多数酿造厂采用常量法,这种方法是一次消化、一次蒸馏,不但平行测定耗时长,而且浪费试剂。半微量法是一次消化,多次蒸馏,利于平行测定,便于比较测定结果的准确性。但半微量法需要一套特制的半微量定氮装置,价格较高,稍不小心,容易损失。就此,我们通过大量对照试验,用普通玻璃仪器代替半微量定氮装置,取得了理想的结果。     

米糠脂肪氧化酶活力的快速测定及其酶学特性研究

紫外分光光度法是测定脂肪氧化酶活力的常用方法,但其测定准确度受到底物溶液透明度和酶液纯度的制约,尤其在反应缓冲体系的pH低于7.0的条件下,难以进行粗酶液中LOX活力的直接测定。为克服现有方法的不足,本文建立一种改良的米糠中LOX紫外光谱检测方法。首先对米糠进行脱脂处理,提高方法的检测限与精确度;采用"磷酸盐溶液-亚油酸-吐温20"体系,简单、快速地获得透明的底物溶液;在获取米糠粗酶液LOX酶学特性的基础上,通过选择合适pH的缓冲体系,确保底物溶液的相对稳定;以"磷酸盐缓冲液+底物溶液+钝化的LOX溶液"为参比,省去繁杂的酶纯化步骤。结果表明:部分脱脂对米糠中脂肪氧化酶起到激活作用,其活力最高增加了46.33%;米糠LOX最适pH7.5,最适温度35℃;其活力测定的条件为:反应缓冲体系为2.0mL0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.5)、200μL底物溶液,其中亚油酸和吐温-20浓度分别是2.53×10-3mol/L、1.68×10-3mol/L,测定温度25℃。此优化条件下,粗酶液添加量在10～40μL范围,反应速率与酶浓度呈正比,△OD234/min=0.001V-0.0026(R2=0.9996);米糠LOX酶促反应最大速率Vmax=0.136△A/min,米氏常量Km=11.592×10-3mol/L。该方法能简便、快速和准确地进行米糠中LOX的活力测定以及酶钝化动力学研究。     

甲硫氨酸氨肽酶高通量微型化检测方法的建立

采用甲硫氨酸对硝基苯胺底物检测甲硫氨酸氨肽酶酶活,通过优化甲硫氨酸氨肽酶检测条件提高检测方法的准确性和灵敏性,并在此基础上建立了微型化的检测方法———酶标板法,适应微型化高通量发酵培养对高通量酶活检测的要求,以实现氨肽酶产生菌真正意义上的高通量筛选。优化后的甲硫氨酸氨肽酶酶活微型化检测条件为:氨-氯化铵缓冲液40 mmol/L、pH 8.0、甲硫氨酸对硝基苯胺浓度6 mmol/L、温度60℃、酶反应时间10 min,于380nm波长比色测定。     

微量滴定法测定魔芋精粉中SO2的研究

本文提出以常量蒸馏微量滴定法，测定魔芋精粉中SO2残留量，并同蒸馏氧化法(GB/T 5009．34-1996)进行对比。对同一种样品，两种方法的测定结果分别为：2．055g／kg、2．051g／kg：变异系数分别为：0．16％、0．18％，两种方法无显著性差异。常量蒸馏微量滴定法，样品试剂用量少，缩短了分析时间，降低了成本，是一种测定魔芋精粉中SO2残留量很合适的分析方法。     

凡纳滨对虾主要过敏原鉴定及酶法消减技术的研究

以凡纳滨对虾为研究对象,用免疫印迹法检测其主要过敏原蛋白组分;用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶对凡纳滨对虾水溶性蛋白水解,消减过敏原。并且通过间接酶联免疫吸附实验和致敏豚鼠全身免疫实验对过敏原消减情况进行检测,确定酶法消减过敏原条件。结果表明,凡纳滨对虾的主要过敏原为99、33、19kD 以及14kD 的蛋白质组分。胰蛋白酶最佳水解条件为：pH8.0,酶与底物比1:100(m/m,下同),45℃,底物质量浓度3g/100mL,水解时间3h;木瓜蛋白酶最佳水解条件为pH6.5,酶与底物比1:100,60℃,底物质量浓度3g/100mL,水解时间3h;菠萝蛋白酶最佳水解条件：pH7.5,酶与底物比1:100,55℃,底物质量浓度5g/100mL,水解时间3h。并且胰蛋白酶水解产物和木瓜蛋白酶水解产物对致敏豚鼠的全身免疫实验安全性很好。     

磷脂酶酶活力测定条件的优化

采用无油磷脂为底物,酸碱滴定法测定磷脂酶LecitaseUltra的酶活力,在单因素试验的基础上,选定反应时间、反应温度、反应pH值进行响应面分析试验,建立磷脂酶酶活力的二次回归方程,通过响应面分析得到酶活力测定的优化组合条件。结果表明:反应时间、反应温度、反应pH值对酶活力都有极其显著影响,测定酶活力的最佳条件为:底物质量浓度4g/100mL、终点pH 9.0、酶液稀释倍数100倍、反应pH5.1、反应温度53℃、反应时间8min,得到磷脂酶的酶活力为9550U/g。