绿芦笋过氧化物酶的酶学特性

过氧化物酶(POD)是植物木质化过程关键酶之一。为控制绿芦笋贮藏及加工过程中产生的木质化问题,以愈创木酚为底物,采用分光光度法对绿芦笋POD酶学特性进行研究。结果表明:绿芦笋POD的最适pH值为6.0,最适温度35℃。90℃处理6 min或100℃处理2 min可使酶基本失活。以愈创木酚为底物时,绿芦笋POD催化愈创木酚的反应符合米氏方程,动力学参数Km=1.56 mmol/L,Vmax=1 111.11 U/min;K+、Mg~(2+)和Na+对POD有明显的激活作用,Ca~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Fe3+和Mn~(2+)对POD有抑制作用。几种抑制剂的抑制效果排序为:EDTA-2Na柠檬酸亚硫酸氢钠抗坏血酸。     

木霉LE02 β-1，3-葡聚糖酶酶学特性的研究

对木霉菌株LE02所产β-1,3-葡聚糖酶的酶学特性进行了研究。结果表明,该酶最适反应温度为55℃、最适反应pH值为5.0。Co~(2+)、K+、Zn~(2+)、Li~+、Ba~(2+)、Cu~(2+)以及1.0mmol/L的Fe~(2+)对该酶没有影响,Cd~(2+)和10.0mmol/L的Mg~(2+)对酶具有部分抑制作用,而低浓度的Hg~(2+)、5.0mmol/L以上的Mn~(2+)和10.0 mmol/L的Fe~(3+)能强烈抑制该酶的活性。该酶只能作用于β-1,3-糖苷键,以Larinami为底物时其米氏常数K_m值为128.34μg/mL,最大反应速度V_m为23.01μg/(min·mL)。经过SDS-PAGE测定的分子质量近似为80.137ku。     

Thermotoga neapolitana中α-半乳糖苷酶基因的克隆表达与酶学性质研究

将新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的耐热α-半乳糖苷酶基因经PCR扩增,以p ET-28a为表达载体,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行表达,用0.8 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,采用超声波细胞破碎菌体得到α-半乳糖苷酶。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法获得α-半乳糖苷酶的分子质量约为35 ku。并对α-半乳糖苷酶的酶学性质进行研究,结果表明:该α-半乳糖苷酶的最适反应温度为85℃;最适反应p H值为5.0;在金属离子对酶活影响的研究中发现Al~(3+)、Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、Zn~(2+)、Co~(2+)对酶活起到促进作用,Cu~(2+)、Fe~(2+)、Ag~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)的终浓度达到100 mmol/L时对酶活有较强的抑制作用;具有较好的热稳定性,在95℃处理38 h后仍具有50%的活性。     

芦笋过氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶特性及抑制条件的研究

采用分光光度法对芦笋组织中与老化相关的过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的酶学特性进行了研究。结果表明,芦笋POD和PAL的最适pH分别为4.0和8.8,且在pH值6的柠檬酸缓冲液中酶活力均明显下降;最适温度分别为55℃和60℃,且在20℃以下和60℃以上活性显著降低;1mmol/L Ca~(2+)显著(P<0.05)抑制芦笋POD和PAL酶的活力;POD和PAL最适底物浓度分别为70μL/100mL和0.02mol/L,Km分别为2.694×10~(-4)mol/L和0.1381mmol/L。     

黑曲霉B0201生料发酵产单宁酶的提取及酶学性质研究

对黑曲霉B0201利用五倍子为诱导物生料发酵产胞外单宁酶的提取及酶学性质进行了研究.结果表明:硫酸铵两步沉淀的饱和度为40%和90%;该酶的最适温度为40℃,最适pH为5.0,低于60%时的热稳定性高,60℃以上迅速失活.Zn~(2+)、Mg~(2+)、吐温80、EDTA等对酶活力无明显影响,Fe~(3+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Ba~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Al~(3+)等对酶有抑制作用.以没食子酸丙酯(PG)为底物,单宁酶的米氏常数Km为0.514mmol/L,Vmax为71.8μmol/L·min.     

鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

试验研究皱纹盘鲍内脏中β-葡萄糖苷酶的分离纯化技术,以及pH、温度及金属离子和某些抑制剂对β-葡萄糖苷酶活性的影响。结果表明,以硫酸铵分级盐析鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶,选取30%饱和度的硫酸铵初步盐析除杂,80%饱和度的硫酸铵沉淀,能使鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶的初步纯化效果最佳;经SDS-PAGE分析,透析后的鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶纯度较高,分子量约为54.0~76.0 k Da;β-葡萄糖苷酶的最适温度为50℃,最适pH为3.5,在小于50℃、pH 3.0~6.0下均能保持稳定;Zn~(2+)、Cu~(2+)和Ag+对鲍鱼脏器β-葡萄糖苷酶活性有明显的抑制作用;Na~+、K~+、Mg~(2+)、Ca~(2+)和Fe~(2+)对酶活性影响不明显;Ba~(2+)、EDTA和Mn~(2+)对酶活均有激活作用,其中,Mn~(2+)激活作用最强。以p-NPG为底物,β-葡萄糖苷酶动力学常数Km为4.66 mmol/L,Vmax为3.79 U/L。     

中国蛤蜊内源酶性质的研究

研究了中国蛤蜊的肌肉与消化腺中内源酶的性质。结果表明:1中国蛤蜊肌肉中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H为7.0与9.0,可能存在同工酶;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Ca2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Cu2+在5mmol/L时,对酶活力有激活作用,随着浓度升高对酶活力有抑制作用;Mn2+在5~15 mmol/L时,对酶活力影响不大,在20 mmol/L时对酶活力有激活作用。2消化腺中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H 8.0;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Mn2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Ca2+在5 mmol/L时,对酶活力有抑制作用,随着浓度升高有促进作用。Cu2+在5~15 mmol/L时对酶活力有促进作用,当浓度为20 mmol/L时,对酶活力有抑制作用。3肌肉中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H 10.0;Mn2+、Ca2+对淀粉酶活力有促进作用;Pb2+在5~10 mmol/L时对酶活力有促进作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有抑制作用;Mg2+在5~10 mmol/L时对酶活力有抑制作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有促进作用;Cu2+在5 mmol/L时对酶活力有促进作用,随着浓度升高,对酶活力有抑制作用。4消化腺中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H为9.0;Ca2+在20 mmol/L时对淀粉酶活性有促进作用,低于此浓度有抑制作用。Pb2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+对淀粉酶活性皆有不同程度的抑制作用。     

内切型菊粉酶酶学性质的研究

以食品与生物工程实验中心酶工程实验室保藏的黑曲霉菌种作为菌源,利用黑曲霉细胞深层发酵法生产内切型菊粉酶。通过测定发酵液酶活,从20株黑曲霉菌株中筛选得到产菊粉酶活力最高的编号为E133131的一株黑曲霉菌株,酶活为0.66U/mL。对黑曲霉E133131号菌株所产内切型菊粉酶进行了酶学性质的研究,得到以下结论:最适pH为4.5;最适温度为60℃;最佳底物浓度为4mmol/L;米氏常数(Km)为1.434mmol/L;Ca2+对内切型菊粉酶有激活作用,当加入浓度为1.5mmol/L的Ca2+时,使酶活从0.66U/mL提高到1.09U/mL;Mn2+、Cu2+和Mg2+对内切型菊粉酶有抑制作用,其中Cu2+的抑制作用最大,使酶活从0.66U/mL降低到0.095U/mL;Na+、K+、Zn2+、Fe2+、Mg2+对内切型菊粉酶的酶活影响不大;pH在4.5~8.0范围内,温度在50~60℃之间,内切型菊粉酶的酶活力较稳定。     

海参肠组织蛋白酶D的提取及酶学特性研究

本研究以海参肠为原料,采用p H3.0 50 mmol/L甘氨酸-盐酸缓冲体系,按1∶6(w/v)的料液比,在4℃浸提1 h,获得海参肠组织蛋白酶D的粗酶液。以酸变性牛血红蛋白为底物,进行酶活测定,并研究了该酶的酶学性质。结果表明,海参肠组织蛋白酶D粗酶的最适p H为3.0,在p H3.0~7.0之间稳定性较好;最适反应温度为50℃,在4~40℃具有较高稳定性。5 mmol/L的金属离子Mg~(2+)、Ca~(2+)、Ni~(2+)、Zn~(2+)、Cd~(2+)和K~+对该酶有激活作用,而Fe~(3+)和Fe~(2+)则对其有抑制作用。天冬氨酸蛋白酶抑制剂Pepstatin A对该酶活性有较强的抑制作用。上述结果说明,在本研究条件下提取获得的海参肠组织蛋白酶D粗酶是一种酸性蛋白酶,其组成以天冬氨酸蛋白酶为主。     

曹州木瓜过氧化物酶酶学特性研究

以曹州木瓜果实为试验材料,采用分光光度法对曹州木瓜过氧化物酶(POD)的酶学特性进行研究,为控制木瓜加工贮藏过程中的酶促褐变提供理论依据。试验结果表明:曹州木瓜POD的最适pH 5.8,最适反应温度45℃,90℃处理75 s或者100℃处理30 s后POD活性完全丧失。其过氧化物酶催化的酶促褐变反应动力学符合米氏方程,动力学参数Km=18.17 mmol/L,Vmax=1 666.67 U。抑制剂对POD的抑制作用从大到小依次为VC亚硫酸氢钠柠檬酸EDTA-2Na。Na+,K+,Mg2+,Mn2+和Ca2+对POD具有激活作用,Zn2+,Ba2+和Cu2+在低浓度时对POD有激活作用,高浓度时有抑制作用。     

菊粉外切酶的异源表达、纯化及酶学性质

将菊粉降解菌Paenibacillus sp. Lfos16的菊粉外切酶基因克隆至表达载体p ET-28a (+),转入Escherichia. coli BL21(DE3)中实现了异源表达。利用镍柱亲和层析纯化重组菊粉外切酶,并进行SDS-PAGE检测。重组菊粉外切酶的表观分子质量为87 k Da,经纯化后,重组菊粉外切酶的比酶活为348.30 U/mg。重组菊粉外切酶作用菊粉和蔗糖的酶活分别为259.37 U/m L和592.16 U/m L,I/S值为0.438,且重组酶水解菊粉的主要产物为果糖。重组菊粉外切酶最适作用温度为40℃,且当温度低于30℃时酶活较稳定;最适作用pH为6。Ag~+、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)、Hg~(2+)、Fe~(3+)具有显著抑制作用。重组菊粉外切酶对菊粉的K_m为19. 28 mg/m L,Vmax为0.18 mg/(min·m L)。     

基于正交试验的蔗糖酶酶学特性研究

蔗糖酶是一类由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)合成并分泌到胞外的果糖基转移酶。为了进一步提高蔗糖酶活性,对该酶进行单因素试验及正交试验优化。通过单因素试验优化得到一定范围内酶活随p H升高而降低,最适温度为60℃,Mn2+对酶活促进作用最强,Ca2+浓度为0.3 mmol/L时,促进作用最强。通过对各类因素的正交试验,确定蔗糖酶活性最高的条件为:p H 4.2,65℃,Ca2+浓度为0.2 mmol/L,Mn2+浓度为0.2 mmol/L。此时蔗糖酶的单位转化率达到18.06%/(m L酶·min),酶活为2.709 U/m L酶。     

粪肠球菌SK32.001精氨酸脱亚胺酶的分离纯化及酶学性质研究

对Enterococcus faecalis SK32.001所产的精氨酸脱亚胺酶(ADI)进行分离纯化并对其酶学性质进行研究。实验结果表明,通过细胞破碎,硫酸铵沉淀,Hi Prep Q FF 16/10阴离子交换层析,Sephadex G-75等纯化方法获得电泳纯精氨酸脱亚胺酶,分子量约为42ku,催化最适温度和p H分别为50℃和6.5,在30~40℃和p H5.5~7.5时较稳定。不同浓度的Zn2+对酶活性影响较大。1mmol/L的Zn2+和10mmol/L的Co2+、Ca2+、Mg2+对酶活有较大的促进作用,10mmol/L的Cu2+对酶的抑制作用最强。精氨酸脱亚胺酶在最适反应条件测定其米氏常数为1.33mmol/L,最大反应速度为2.41μmol/min。     

一种Kappa-卡拉胶酶的克隆、表达及其酶学性质研究

将来源于Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5菌株的κ-卡拉胶酶基因克隆到载体p ET-28a上,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达。克隆得到的κ-卡拉胶酶基因序列全长1194 bp,编码一个由398个氨基酸残基组成的蛋白酶,该蛋白酶的分子量为48 ku,结构域分析表明该κ-卡拉酶符合GH16家族的特点。对重组κ-卡拉胶酶的酶学性质进行考察:重组κ-卡拉胶酶只能够专一性的降解κ-卡拉胶;该酶的最适温度和pH分别是55℃和pH 9.0,重组酶在40℃保温1 h可保持95.0%的活性,在45℃保温1 h残余酶活与对照比较仍保留60.0%,在pH 8.0~10.0的缓冲液中处理30 min,仍能保持80%以上的酶活力,低浓度的Na+和K+以及1mmol/L的Sn~(2+)、Fe3+、EDTA、DTT、Tween-20、Tween-80和Triton X-100、β-mercaptoethanol、SDS、Urea对重组酶活具有显著的促进作用;而高浓度的Na+和K+以及1 mmol/L的Cd~(2+)、Ba~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)、Ca~(2+)对重组酶活性有不同程度的抑制作用。     

凝结芽孢杆菌RY237 β-半乳糖苷酶酶学性质研究

为研究乳品中具有应用价值的乳糖酶,以乳糖为唯一碳源,用邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)法,从产乳酸的细菌中筛选出了产乳糖酶活力高的菌株RY237,其活性达4.98 U/m L,鉴定为凝结芽孢杆菌。研究了乳糖酶的酶学性质,该酶最适反应温度和最适p H分别为50℃和6.0。该酶在温度40~50℃具有良好的稳定性;p H5.5~8.0表现稳定,p H7.0出现酶活峰值。金属离子Ca~(2+)、K+、Zn~(2+)、Mn~(2+)、Na+、Mg~(2+)对酶活具有抑制作用,Cu~(2+)对酶活具有完全抑制作用,EDTA对酶活具有激活作用。凝结芽孢杆菌RY237乳糖酶活性高、性能优良,具有应用价值。     

大蒜多酚氧化酶的酶学性质及其在热加工中的变化

采用丙酮粉法提取大蒜中的多酚氧化酶(PPO),并对其酶学特性进行研究。结果表明,大蒜多酚氧化酶最适反应温度为40℃、最适反应pH值为4.0和7.0。邻苯二酚是大蒜PPO的最适底物。动力学实验表明大蒜PPO的米氏常数K_m 470 mmol/L、最大反应速率V_(max) 666.67 U/min。在10 mmol/L时,Cu~(2+)对PPO活性有明显抑制作用,Ca~(2+)和Mg~(2+)对PPO活性有轻微促进作用;Mn~(2+)对PPO活性有明显促进作用。在低浓度时,草酸对大蒜PPO的抑制效果大于L-半胱氨酸和柠檬酸亚锡二钠,高浓度时与后两者相当。热加工结果表明,在75℃、85%湿度条件下,大蒜PPO酶活保留时间较长。     

黄孢原毛平革菌低温产酶条件优化及酶学性质研究

以酶活力为评价指标,对白腐真菌产酶条件进行优化,并对其部分酶作用特性进行了研究.结果表明:该菌10℃条件下产LiP、MnP和Lac的最佳碳源是葡萄糖;最佳氮源是牛肉膏;最佳培养时间为72h～108h.LiP、MnP和Lac的最适反应pH值范围均为4.4～4.8,最适底物浓度为0.8 mmol/L～1.2mmol/L;金属离子Cu2+、Ca2+ 对LiP、MnP和Lac有激活作用,Fe2+ 对3种酶活有一定的抑制作用;而Na+ 则完全抑制LiP的活性,Zn2+、Mg2+对3种酶活影响不大.     

产谷氨酸脱羧酶片球菌的鉴定及其酶学性质

从发酵蔬菜中分离一株产谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)的乳酸菌HS2,其菌体细胞转化Glu 1h,转化液中γ- 氨基丁酸含量可达(3.114 ± 0.133)g/L,通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育分析,鉴定菌株HS2 是戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。菌株HS2 GAD 最适作用温度为35℃,最适作用pH4.5。酶的热稳定较好,在pH4.0～6.5 于50℃处理4h,酶活基本稳定。Ca2+ 对酶有激活作用,5mmol/L 和50mmol/L Ca2+ 浓度使酶活分别提高了37.21% 和23.02%。Mg2+ 和Mn2+ 在50mmol/L 浓度时激活作用明显,而Co2+在5mmol/L 浓度激活作用较好。     

假单胞菌H3壳聚糖酶的纯化及部分酶学性质

对 Pseudmona sp.H3产生的壳聚糖酶粗酶液采用(NH_4)_2SO_4盐析、Sephadex G-25脱盐、Sepharose Q-XL阴离子交换层析和Superdex G-75分子筛层析进行纯化,经SDS-PAGE鉴定为单蛋白带,分子质量约为33.8ku,酶反应最适温度为40℃,最适pH为5.0,降解壳聚精(D.A.90.14％)Km值为3.59g/L,V_(max)值为 3.80mmol/(L·min);Ba~(2+)、K~+、Co~(2+)对该酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Al~(3+)、Cu~(2+)则对酶有抑制作用;此外,该酶除了能降解壳聚糖以外,还具有CMCase活性。     

Paenibacillus puldeungensis LK18普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质研究

本研究根据类芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的保守区设计兼并引物,从Paenibacillus puldeungensis LK18中扩增出普鲁兰酶基因(pul A),将其连接至p ET-28a(+)载体上,构建出重组表达载体p ET-28a(+)-pul A,转入到EscherichiacoliBL21(DE3)中,成功地表达了重组普鲁兰酶。结果表明:该普鲁兰酶基因全长1968 bp,编码655个氨基酸。通过Ni柱亲和层析纯化出重组蛋白,测定其比酶活为508.8 U/mg,分子量约为76.95 ku。该重组酶的最适反应温度为45℃,在35℃～40℃下保温120 min后剩余酶活达60%以上;最适作用p H为6.0,在p H 6.0～8.0条件具有较好的稳定性;10 mmol/L的K+和Mg~(2+)对该重组普鲁兰酶有激活作用,而Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ni~(2+)、Fe~(2+)、Cu~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)等对其有不同程度的抑制作用。本研究成功地构建出一株可高效表达普鲁兰酶的重组菌株,具备一定的工业应用价值。