日本科研人员破译米曲霉基因组

据悉,日本研究人员最近成功破译米曲霉的基因组,为酿造更具风味的酱油和酒等奠定了基础。米曲霉基因组大约有3800万个碱基对,共有8条染色体,包含约1.2万个基因。在已破译的基因组微生物中,米曲霉的碱基对数目是最多的。与相近的曲霉菌相比,米曲霉基因数量要多出30%左右。研究人员认为,这也许可以解释米曲霉所具有的一些独特生物特征。米曲霉含有大量与蛋白质和脂肪分解酶相关的基因,能够把蛋白质分解成让酿造食品更具美味的氨基酸。研究人员认为,基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件,这将有助于提高食品酿造业的生产效率…     

基因组功能注释分析米曲霉ZA189优势酿造性能的遗传基础

米曲霉ZA189是以米曲霉沪酿3.042为出发菌株经传统诱变获得的,具有中性蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶活力高的特性。为深入研究米曲霉ZA189的遗传背景,评估其作为酱油酿造菌株的性能,本研究利用新一代纳米孔测序技术完成了米曲霉ZA189基因组的测序、组装和功能注释。获得的基因组全长36.89 Mb,包含16条Scaffold,测序深度达到132.05×。基因注释表明,米曲霉ZA189基因组包含263个t RNA基因和72个r RNA基因,这是米曲霉高效表达蛋白的遗传基础。KOG和KEGG注释表明米曲霉ZA189具有强大的能量合成、蛋白质合成及次级代谢产物合成能力,这是其在发酵工业广泛应用并产生多种风味功能物质的遗传基础。碳水化合物活性酶CAZy注释和蛋白酶注释表明,米曲霉ZA189基因组中包含多达330个糖苷水解酶(GH)和30个蛋白酶基因,这是米曲霉ZA189作为酱油酿造菌株降解大豆蛋白和碳水化合物的关键性能指标。通过本研究对酱油酿造菌株米曲霉ZA189的基因组有了更加深入的理解,通过对蛋白表达系统基因、次级代谢基因、碳水化合物活性酶及蛋白酶的功能注释,为指导其在酱油酿造中的应用提供了理论支持。     

米曲霉pyrG 基因克隆及其同源转化系统的建立

建立以乳清酸核苷-5＇- 磷酸脱羧酶基因(pyrG)为选择标志,以米曲霉为宿主菌的同源转化系统。以米曲霉基因组为模板,通过PCR 扩增获得pyrG 基因,将该片段与表达载体pMD18-T 相连,转化大肠杆菌DH 5α,经蓝白斑筛选、PCR 快速筛选、酶切和测序验证,获得重组质粒pMD-pyrG,完成pyrG 基因的克隆。序列分析表明该基因与米曲霉KBN616 的pyrG 基因编码序列的同源性为99.9%,两者经推导的氨基酸的同源性为99.6%。以米曲霉 pyrG 营养缺陷株为受体菌,通过PEG/CaCl2 诱导的原生质体转化方法,将重组质粒导入该受体菌,使米曲霉pyrG 缺陷株发生基因转化,成为pyrG+,由此成功建立了以pyrG 为筛选标记基因、同型米曲霉pyrG 基因缺陷株为受体菌的基因转化系统。     

双氧水对米赫根毛霉脂肪酶在米曲霉中重组表达的调控研究

米赫根毛霉脂肪酶RML是具有广泛应用价值的重要微生物脂肪酶。本研究对双氧水调控米曲霉RML转化子ONL1表达脂肪酶进行了研究。荧光定量PCR和SDS-PAGE表明,在转化子培养过程中,维持培养体系中10 mmol/L双氧水2 h,使转化子ONL1的脂肪酶活力提高5倍。在双氧水处理过程中,RML的翻译未受影响,其表达水平的提高源于双氧水对其转录水平的调控。因此,双氧水调控melO启动子控制的外源基因的表达体现在转录水平。由于双氧水易挥发,导致其效果低于延长培养时间。为了在较短培养时间内获得高酶活,应在培养液中持续添加双氧水（10 mmol/L）。基于米曲霉转化子脂肪酶活力的分析和qPCR检测,确定以下策略可用于提高米曲霉中RML的表达水平：脂肪酶RML基因的密码子优化、信号肽序列优化、连续分批培养。     

双氧水对米赫根毛霉脂肪酶在米曲霉中重组表达的调控研究（英文）

米赫根毛霉脂肪酶RML是具有广泛应用价值的重要微生物脂肪酶。本研究对双氧水调控米曲霉RML转化子ONL1表达脂肪酶进行了研究。荧光定量PCR和SDS-PAGE表明,在转化子培养过程中,维持培养体系中10 mmol/L双氧水2 h,使转化子ONL1的脂肪酶活力提高5倍。在双氧水处理过程中,RML的翻译未受影响,其表达水平的提高源于双氧水对其转录水平的调控。因此,双氧水调控mel O启动子控制的外源基因的表达体现在转录水平。由于双氧水易挥发,导致其效果低于延长培养时间。为了在较短培养时间内获得高酶活,应在培养液中持续添加双氧水(10 mmol/L)。基于米曲霉转化子脂肪酶活力的分析和q PCR检测,确定以下策略可用于提高米曲霉中RML的表达水平:脂肪酶RML基因的密码子优化、信号肽序列优化、连续分批培养。     

根癌农杆菌介导酸性蛋白酶在泡盛曲霉中表达的研究

利用Gateway克隆技术快速构建丝状真菌表达载体,以米曲霉α-淀粉酶A启动子(amyB)、α-糖苷酶终止子(agdA)及黑曲霉酸性蛋白酶基因(pepA)分别构建入门载体,以带有潮霉素抗性标记(hygB)的农杆菌双元载体pHGW为目的载体,通过LR连接反应,构建根癌农杆菌介导丝状真菌重组表达载体pHGW-apA。转化泡盛曲霉宿主菌,筛选的转化子经传代培养确定其遗传稳定性,PCR及测序分析表明,hygB和目的基因pepA整合到了泡盛曲霉基因组。转录水平上的RealTime-PCR定量分析、表达水平上的Western Blotting分析以及培养液酶活分析表明酸性蛋白酶基因pepA在泡盛曲霉中得到正确表达。为丝状真菌表达载体快速构建与外源基因在丝状真菌中快速表达提供了可行的方法。     

荧光定量PCR检测霉变烟叶中米曲霉方法的建立

为建立快速高效的烟草霉变微生物定量与定性的检测方法,本研究针对陈旧烟叶中分离的米曲霉的rDNAITS1基因片设计一对特异引物,制备含ITS1基因的重组质粒作为阳性对照,建立了米曲霉基因组的SYBR Green I应该定量PCR检测方法。结果显示,标准曲线的相关系数为0.998,最低可检测浓度为101copy/μL的阳性质粒,与其他的微生物的基因组不发生交叉反应,该技术可为检测烟叶霉变微生物提供快速可靠的检测手段。     

米曲霉沪酿3．042制曲过程中碱性蛋白酶的表达分析

测定了米曲霉3.042种曲在固体制曲时碱性蛋白酶的酶活,同时利用实时定量PCR分析了碱性蛋白酶基因alp A的表达.结果显示在培养过程中,碱性蛋白酶基因转录水平和表达水平总体上都呈上升趋势,其中转录水平的增长率要比翻译水平大,说明该基因的表达调控主要在转录水平上.     

2株米曲霉的特色酶系对酱油理化指标及品质的影响

选取酶系差异较大的2株米曲霉菌株进行酱油发酵,通过形态学分析、发酵酱油理化指标及滋味感官测定,探究米曲霉酶系组成特点与酱油品质形成的关系。研究表明:米曲霉SWJS-AO-K具有蛋白类酶活力优势,中性蛋白酶、酸性蛋白酶和氨肽酶活力分别为米曲霉SWJS-AO-D成曲的2.2倍、2.6倍和4.4倍。然而,米曲霉SWJS-AO-D降解碳水化合物类酶活力突出,如糖化酶和纤维素酶等酶活力分别为米曲霉SWJS-AO-K的1.8倍和1.3倍。酶活力的差异与后期酱油理化指标及感官特性存在紧密联系。具有高活力蛋白酶类的米曲霉SWJS-AO-K在发酵酱油过程中具有较高的总氮含量和美拉德反应程度,且其苦味氨基酸含量也相对较高。具有高活力降解碳水化合物酶类的米曲霉SWJS-AO-D在还原糖以及鲜、甜味氨基酸总含量上具有优势,相对米曲霉SWJS-AO-K发酵酱油分别提高了80.80%,5.14%和4.10%,这与米曲霉SWJS-AO-D发酵酱油具有较高的鲜、甜味相符,表明具有降解碳水化合物酶类优势的米曲霉对发酵酱油的鲜味、甜味物质生成具有积极影响,这与行业内一直以来侧重筛选高蛋白酶活力的米曲霉基础导向有所不同。本研究结果将对米曲霉筛选、育种及差异化发酵应用提供重要的理论依据。     

米曲霉AS3.800基因工程转化体系的构建

采用紫外突变结合砂芯漏斗过滤筛选,得到米曲霉双重营养缺陷型突变菌株AS3.800(niaD-,pyrG-)。应用生物信息学软件辅助分析米曲霉基因,了解转录调控元件。通过PCR技术成功地从米曲霉AS3.800总DNA中分别扩增niaD、pyrG基因表达框(expression cassette),构建筛选标记质粒pUCniaD和pUCpyrG,并尝试原生质体转化AS3.800(niaD-,pyrG-)。     

米曲霉机理性探索对酱油生产的启示

将相同培养条件下的不同米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株之间进行了比较基因组学和蛋白质组学的研究,分析酱油发酵过程中米曲霉的关键基因和蛋白对酱油风味产生的影响。通过米曲霉沪酿3.042（中国）和米曲霉RIB40（日本）菌株的基因组学比较,发现与酱油风味物质形成相关的特异基因。围绕米曲霉3.042及其诱变菌株米曲霉100-8的蛋白质组学比较,找到米曲霉代谢过程中与风味物质形成有关的蛋白,为酱油工艺的改进提供了理论基础。     

酱油酿造中米曲霉与风味酵母协同制曲的研究

本文通过添加一株嗜盐产香酵母菌(鲁氏酵母)与米曲霉协同制曲,探讨制曲过程中酶系、各项理化指标及风味与酵母代谢调控的相关性。动态监测制曲过程中酵母菌落数、米曲霉孢子数、酶系活力、理化指标的变化规律及采用GC-MS对成曲进行挥发性成分分析。结果表明,当酵母的添加量为1.5×106个/g曲料,米曲霉接种量为0.15%(m/m)时,米曲霉孢子数无明显变化,中性蛋白酶活与对照组相当,36 h时达到3100 U/g,α-淀粉酶活较对照组降低了22%,糖化酶活与对照组相比增加了7%,氨肽酶活、酸性羧肽酶活与对照组无明显差异。制曲结束时对照组与添加酵母氨基态氮和还原糖含量基本相近,有机酸含量低于对照。添加酵母和对照组成曲中分别检测出32种,23种挥发性风味物质。综合分析知,接种一定量的酵母菌协同制曲并未对米曲霉生长及酶系产生显著影响,但改善了曲料的风味品质。     

酱油酿造过程中米曲霉酶系的影响因素

0前言 酱油酿造的过程实际上是以微生物作为动力,产生一系列复杂的生物、化学反应的过程.大多数酿造酱油的生产厂家采用米曲霉作为动力微生物,主要是因为米曲霉产生的酶系十分丰富.米曲霉的酶系包括蛋白酶、肽酶、谷氨酰氨酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、转化酶、纤维素酶及麦芽糖酶等.各种酶系对酱油风味的形成有着各自不同的作用,生产中米曲霉酶系各种影响因素的控制将对酱油的品质、风味和产量都产生极其重要的作用.下面就影响米曲霉酶系形成、作用的因素作一简单探讨.     

基于Illumina Hiseq高通量测序红曲霉转录组学分析

分别以铵态氮、亚硝态氮为氮源培养安卡红曲霉（Monascus anka）GZUM-25，采用Illumina二代测序平台（Illumina Hiseq）对红曲霉GZUM-25进行转录组测序分析，分析不同氮源条件下调控红曲霉菌丝生长和产色素的差异表达基因，并对基因进行GO功能富集及KEGG通路富集分析。结果表明，从铵态氮和亚硝态氮培养下的安卡红曲霉GZUM-25基因组中共获得95个差异表达基因，其中，上调基因有37个，下调基因有58个。差异表达基因主要富集的功能为生物学过程、细胞组分和分子功能，富集的通路为磷酸肌醇代谢、淀粉和蔗糖代谢、苯乙烯降解、氨基苯基酸酯降解。     

一种适用于真菌的高通量分子鉴定方法的建立

真菌在生物领域扮演着重要的角色,随着分子生物技术的发展,从分子水平对真菌的鉴定及对遗传转化子的验证成为必需的试验环节。但目前尚无一种比较理想的高通量分子鉴定的方法。设计一种新的高通量装置,并且建立适用于这种高通量装置的,由PCR介导的分子鉴定方法,主要通过对实验室常用菌株里氏木霉基因组上相关纤维素酶编码基因、调控基因,酿酒酵母基因组上磷酸甘油酸激酶1基因的启动子区,酿酒酵母胞内表达载体上木聚糖酶基因的克隆验证及对实验室保藏菌株草酸青霉、葡枝根霉、黑曲霉、碳黑曲霉、日本曲霉及上述两株菌株的ITS基因克隆验证,RAPD分析,确定这种方法的高效性及应用广泛性。这种方法的建立很大程度上解决了高通量分子鉴定的瓶颈问题。     

米曲霉的次级代谢调控研究进展

米曲霉是酱油、黄豆酱等传统酿造调味品的主要生产菌株,具有悠久的应用历史。近年来,人们逐渐发现除了酿造功能之外,米曲霉还有丰富的次级代谢产物,其中不乏具有抑菌、抗氧化等功能的活性分子,在医药、美妆等领域具有极大应用潜力。但因为米曲霉次级代谢网络的复杂性,这些活性分子的产生规律和调控机制尚未被完全阐明,难以开发适用于工业场景的高产工程菌株,限制了米曲霉在工业领域的广泛应用。随着技术的进步和研究的深入,米曲霉次级代谢途径及其调控方式逐步被揭示和阐明,将会有效推动新功能化合物的进一步发掘以及高产工程菌株的选育和应用。文章综述了米曲霉次级代谢产物及分子调控的最新研究进展,并对这一领域的未来发展进行了展望。     

米曲霉3.042尿苷/尿嘧啶营养缺陷型遗传转化体系的构建

米曲霉对潮霉素等多种抗生素不敏感,对其基因改造有一定困难。该研究以米曲霉3.042为出发菌株,建立pyrG筛选标记遗传转化体系。首先,分别运用紫外诱变法和左右臂同源重组法破坏米曲霉自身的pyrG基因,在含有5-氟乳清酸和尿苷/尿嘧啶的培养基平板进行筛选,最终两种方法分别获得性状稳定的尿苷/尿嘧啶营养缺陷型突变株米曲霉O11和米曲霉g-1。随后以缺陷型突变株为出发菌株,利用农杆菌转化法转入包含pyrG回补标记的质粒,其中米曲霉g-1突变株获得原养型的回补菌株,紫外诱变法获得的缺陷型突变菌株米曲霉O11未能恢复为原养型。研究表明米曲霉3.042 pyrG基因大片段缺失的缺陷型菌株,可直接以自身pyrG基因作为选择标记进行遗传改造。     

酱油酿造优良米曲霉菌株的高效选育

该研究选取酱油酿造的米曲霉菌株为研究对象,通过开展高效复壮选育优良菌株的工艺实验,建立了米曲霉氨基酸态氮得率的筛选模型,获得氨基酸态氮得率与K值和菌落直径d的关系,建立回归方程U=0.035d+0.332K+0.060,米曲霉氨基酸态氮得率的高低可以通过酪蛋白平板上菌落直径大小和K值来确定,同时结合米曲霉菌落在酪蛋白平板上的形态特征可以准确地选育氨基酸态氮得率高的米曲霉菌株。如果米曲霉菌落在酪蛋白平板上的菌落直径和K值都相对较大,同时满足孢子较多,菌丝较厚较致密,那么该菌株的氨基酸态氮得率水平也较高,通过菌落直径d、K值和菌落形态特征,可以初步判断菌株发酵放油的氨基酸态氮水平,可以减少复筛的工作量,同时提高复壮筛选的效率和质量。     

不同诱变方法对米曲霉酶系的影响

通过酪蛋白上米曲霉的菌落大小和透明圈大小的比值可以初步确定米曲霉的产酶能力，将分离纯化得到的米曲霉菌株用紫外线、硫酸二乙酯以及复合诱变，结果表明，不同诱变方法对米曲霉的酶系分布均有影响，用紫外线-硫酸二乙酯复合诱变作用比用紫外线和硫酸二乙酯单独作用对酶系的影响更明显。     

红曲霉中桔霉素定量分析及其合成相关基因簇的研究

目的对红曲霉中真菌毒素桔霉素进行定量分析,并研究桔霉素合成相关基因簇,为从基因水平上对桔霉素的产生进行调控、提高红曲霉相关食品的安全性提供理论依据。方法采用高效液相色谱(HPLC)法对3株红曲霉(紫色红曲霉YY-1、M2,丛毛红曲霉FJ-1)在液态发酵过程中产生的桔霉素开展定量分析,采用二代测序技术鉴定桔霉素合成基因簇的序列特征,应用实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法进行相关基因表达水平分析。结果在固态培养和液态发酵过程中,3株红曲霉菌体生长情况无明显差异;在液态发酵过程中,HPLC结果显示M2桔霉素产量最高,其次为YY-1,FJ-1产量最少;M2、YY-1、FJ-1桔霉素合成基因簇相似度达99.9%;膜转运蛋白基因(orf5)、聚酮合酶基因(pksCT)、氧化还原酶基因(ctnB)、转录调节蛋白基因(ctnA)、脱氢酶基因(orf1、ctnE)六个基因表达水平在M2中最高,在FJ-1中最低。结论桔霉素的产量差异与桔霉素合成基因簇所表达酶的种类无关,而与其基因表达的调控相关。