极大节旋藻(Arthrospira maxima)高分子量基因组文库构建及其应用

构建了极大节旋藻fosmid文库.该文库含有4300个克隆,重组率是100%,插入片段集中在30～36 kb之间,平均为33 kb,覆盖率为节旋藻基因组的25.8倍.随机挑选100个克隆进行双末端测序,得到110个序列,经生物信息学分析筛查到67条功能基因序列.选取了14对特异的末端序列作为序列标签位点并设计引物,采用STS-PCR反应池法通过多轮筛选,得到127个阳性克隆,按照相互位置关系,绘制了4个连续的克隆重叠群.该研究为深入了解极大节旋藻分子遗传特性和绘制物理图谱奠定了基础.     

16S rRNA基因与16S-23S rRNA转录单元内间隔区序列分析及其在节旋藻和螺旋藻分类鉴定中的应用

测定了节旋藻属3个品系和螺旋藻属1个品系的全长16SrRNA基因基因和16S rRNA转录单元内间隔区序列（ITS）,分析了已知的节旋藻、螺旋藻和相关品系的相应序列的同源性,构建了系统发生树,并评价了这两段DNA序列在节旋藻、螺旋藻种属分类和种质鉴定中的意义。结果表明：（1）16SrRNA基因序列和ITS序列均可用于节旋藻属和螺旋藻属的属间分类,以两序列为基础的系统学分析结果一致;（2）ITS序列变异程度高于16SrRNA序列,适用于节旋藻和螺旋藻属内品系或种质鉴定;（3）节旋藻属可明确界定,16SrRNA基因序列相似性大于98％,ITS序列相 似性大于88％;（4）螺旋藻属某些品系间16SrRNA序列和ITS序列相似性较低,与不同属间的序列相似性程度为同一水平。     

节旋藻硝酸盐转运蛋白基因Amnrt P序列分析

应用生物信息学软件对获得的节旋藻硝酸盐转运蛋白基因(Amnrt P)全长序列进行了结构特征、同源性比较、多序列比对、系统发育学分析等.结果表明:该基因全长为1515 个核苷酸,编码 504 个氨基酸,平均 GC 含量为43.8%,疏水氨基酸的比例为47.6%.该硝酸盐转运蛋白含有 12 个跨膜结构域(Transmembrane domains,Tm),膜拓扑结构与 NRT2 家族的类似,并发现了多个 NRT2 家族的保守序列.同源性搜索显示与属于 NRT2 基因家族的海洋蓝藻的氨基酸序列相似性为75%～89%.采用邻接法(NJ)、最大简约法(MP)和最大似然法(ML)构建了分子系统树,结果表明 3 种树的拓扑结构基本相似,并且在蓝藻中基于硝酸盐转运蛋白基因的系统发育关系与形态学分类结果相一致.所获 Amnrt P 基因属于 NRT2 基因家族,可成为蓝藻系统进化研究的分子标记,并为了解节旋藻中硝酸盐吸收与转运的基因结构和分子机制奠定了一定的基础.     

铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa PCC7820生物钟基因的克隆及其蛋白相互作用分析

为了深入研究铜绿微囊藻生物钟调控的分子机制,根据蓝藻钟基因的同源序列设计合成了简并引物,通过PCR和染色体步行的方法获得了铜绿微藻Microcystis aeruginosa PCC7820的生物钟基因簇kaiABC.kaiA基因全长873bp,编码一个由290αα组成,分子量大小为33.3kDa的蛋白;kaiB基因全长315bp,编码分子量大小为11.8kDa的蛋白;kaiC基因全长1563 bp,编码蛋白分子量大小为58.3kDa.Kai蛋白间的相互作用是昼夜节律计时产生的重要过程,利用酵母双杂交系统检测了三种Kai蛋白间的相互作用,结果表明KaiA、KaiB和KaiC蛋白自身及KaiA与KaiC、KaiB与KaiC之间都能发生明显的相互作用,而KaiB和KaiA之间没有检测到相互作用.     

不同品系节旋藻乙酰辅酶A羧化酶基因的克隆比较

本实验克隆了节旋藻及其高乙酰辅酶A羧化酶活性突变株的乙酰辅酶A羧化酶d—CT、D—CT、BC和BCCP四个亚基的ORF序列，片段大小分别为981bp、948bp、723bp和537bp。对原藻株和突变株乙酰辅酶A羧化酶的四个亚基进行序列比对，并与Genbank中节旋藻全基因组测序结果进行比较，发现四个亚基的ORF序列完全一致。该结果表明节旋藻乙酰辅酶A羧化酶高度保守，乙酰辅酶A羧化酶四个亚基的ORF序列并未发生改变，并不是导致乙酰辅酶A羧化酶活性在出发株与突变株中出现差异的原因。     

节旋藻FACHB341 Rubisco基因部分序列的克隆和分析

以节旋藻FACHB34l为材料，对所克隆Rubisco基因进行了核苷酸序列测定和分析，由此推导出相应的氨基酸序列，并与部分其他蓝藻的同源基因进行了同源性分析。结果表明：所克隆DNA片段包含Rubisco大小亚基基因部分序列及rbcX基因序列，长度为2073bp，其中rbcL和rbcX基因之间存在两个转录茎环结构；大小亚基酸性氨基酸和碱性氨基酸的比例分别为13．14％和14．51％，疏水氨基酸的比例为42．16％；rbcL核苷酸序列与集胞藻PCC6803、Prochlorothrix hallandica、聚球藻PCC630l、Agmenellum quadruplicatum和鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性分别为91．7％、79．9％、74．8％、77．2％和76．1％；rbcS核苷酸序列与鱼腥藻PCC7120同源序列的相似性为67．6％，而与PCC630l和集胞藻PCC7002同源序列的相似性分别为30．1％和63．8％。     

具有5+12优质亚基节节麦的低分子量谷蛋白基因序列分析

根据低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)基因编码区保守序列设计引物,对具优质高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)5 12的节节麦材料AS63进行扩增,得到长度约为900bp和1000bp的DNA片段,克隆测序后获得3个LMW-GS基因序列LMWD-1(GenBank登录号AY841013)、LMWD-2(GenBank登录号AY841014)和LMWD-3(GenBank登录号AY841015)。它们具有小麦低分子量谷蛋白基因的典型结构特征。其中,LMWD-1和LMWD-2具有完整编码区,长度分别为1065bp和972bp,可分别编码333和302个氨基酸残基的成熟蛋白,且第一个半胱氨酸残基均出现在重复区第13位。在重复区,LMW-1的两个疏水单元为PIIIL和PVIIL,而LMWD-2的两个疏水单元为PIIIL和SVIIL。LMW-1的重复区中还存在一个连续13个Q组成的短肽。LMWD-3由于编码区内存在提前终止密码子,为不表达的假基因。氨基酸序列比较发现,LMW-GS基因的N-末端区序列具有位点特异性,且LMW-1和LMWD-2与普通小麦Gtu-D3位点的LMW-GS基因有很高的一致性。     

大熊猫朊病毒基因克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊病毒基因序列设计引物对,采用PCR方法扩增了大熊猫的朊病毒基因,将其克隆到T-Easy载体,序列测定及分析表明所克隆的大熊猫PRNP基因(GeneBank收录号为AF327449)片段为795bp,编码264个氨基酸的前体蛋白,推测其分子量约28．5ku。与已报道的牛(GeneBank收录号为AF455119)、绵羊(GeneBank收录号为AF367623)的相应序列作比较分析,核苷酸序列同源性分别为99％和83％,其编码的氨基酸同源性均为100％。在所克隆的大熊猫PRNP基因中未发现与朊病毒敏感性连锁的氨基酸多态性位点。     

利用易错PCR随机突变技术突变EPSPs基因研究草甘膦抗性机理

运用易错PCR介导的随机突变技术使高抗草甘膦的菌株的5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合酶(5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate,EPSPs)基因发生随机突变,转入EPSPs基因缺陷型的大肠杆菌ER2799中,通过互补试验获得对草甘膦抗性明显降低的突变株AZ100。测序结果发现AZ100的EPSPs基因与未突变基因相比,碱基序列发生了两个位点变化,第792位的碱基由鸟嘌呤(G)突变为胸腺嘧啶(T),第1203位的碱基由胞嘧啶(C)突变为鸟嘌呤(G)。氨基酸序列也发生了相应的变化,第264位由甘氨酸(Gly)突变为缬氨酸(Val),第401位由丙氨酸(Ala)突变为甘氨酸(Gly)。二级结构预测显示此两个突变的氨基酸的位点恰好位于EPSPs与底物结合的关键部位。这两个氨基酸位点的突变,导致EPSPs在有草甘膦存在的情况下活性降低,从而导致菌株的草甘膦抗性降低。将这两个突变的碱基位点与美国的专利保护位点比较,发现这两个突变位点均不在专利保护范围之内。     

条斑紫菜锰超氧化物歧化酶基因克隆与序列分析

为研究紫菜抗逆抗病的分子机制,以本实验室建立的条斑紫菜表达序列标签(EST)和全长cDNA富集文库,结合PCR技术,克隆了条斑紫菜编码锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的cDNA及基因组DNA全长序列,并进行了序列特性相关分析.研究结果表明:该基因cDNA序列全长为958个核苷酸,包含一个完整Mn-SOD基因的ORF,编码224个氨基酸和终止密码子;该基因在基因组中序列长度为1416bp,包含4个外显子和3个内含子,这既不同于高等植物的6个外显子和5个内含子,也不同于人的5个外显子和4个内含子;该基因编码区密码子的平均GC含量为60.9%,第三位密码子的GC含量高达84.9%;序列中包含4个与Mn2 的结合位点及一个保守的金属结合结构域,预测分子量为24469.09Da,等电点为5.99;条斑紫菜Mn-SOD与人的相关蛋白具有类似的空间结构,都有6个跨膜α螺旋结构域;由cDNA序列推导的氨基酸序列与莱茵衣藻相似性为57.7%,系统发生分析表明条斑紫菜Mn-SOD与绿藻莱茵衣藻和硅藻海链藻的亲缘关系较近.这是该基因在红藻门中的首次报道.     

从鳗弧菌M3 Fosmid文库筛选aroA基因

为克隆鳗弧菌aroA基因 (它在细菌中编码合成芳香族氨基酸的关键酶--5-烯醇氏丙酮酰莽草酸3-磷酸(EPSP)合成酶),在实验室中构建了鳗弧菌M3大分子量基因组Fosmid文库,并通过克隆测序获得了部分序列,以此为基础,通过延伸测序获得了ar oA基因序列全长. 该基因全长1281bp,编码427个氨基酸,包含一个11个氨基酸残基的信号肽;编码区GC平均含量为46.8%,推测分子量为46177 Da.相似性分析表明,鳗弧菌的aroA核苷酸和氨基酸序列与其他弧菌的相似性最高,分别在73%～75%和78%～82%;进化树结果也表明鳗弧菌ar oA与其他弧菌的亲缘关系最近.aroA基因的克隆为构建鳗弧菌弱毒疫苗奠定了基础.     

来源于芽孢杆菌(Bacillus circulans)的乳糖酶在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子选择偏好对来源于芽孢杆菌(Bacillus circulans)的乳糖酶基因lacO进行了分子改造.改造后的基因lacM按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9上,构建得到重组毕赤酵母表达质粒.PCR检测、SDS-PAGE电泳分析和酶活力测定的结果表明,lacM基因已重组到酵母染色体上,并能正常分泌表达.与未改造的基因lacO的毕赤酵母重组子相比,酶蛋白表达量明显增加,约为改造前的3倍以上.     

致病性鳗弧菌金属蛋白酶基因克隆及序列分析

从我国山东沿海发病的鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到一株致病性鳗弧菌（Vibrio anguillarum）W-1，该菌的胞外蛋白酶活性为4226u/ml，部分纯化的胞外蛋白酶对海水养殖大菱鲆鱼有一定的毒性。应用PCR扩增，从鳗弧菌W-1染色体DNA扩增出一条长约1.925kb的特异性PCR产物，DNA序列分析表明：克隆的片段含有完整的金属蛋白酶基因阅读框，编码611个氨基酸残基的蛋白质，该金属蛋白酶基因与一株致病性鳗弧菌蛋白酶基因的核苷酸及氨基酸序列同源性为100%，而与解蛋白弧菌（V.proteolyticus)、创作弧菌（V.vulnificus）、霍乱弧菌（V.cholerae)、斑点气单胞菌（Aeromonas punctata），嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的氨基酸序列同源性分别为73%、70%、69%、53%、51%。     

鳗弧菌溶血素基因的克隆及突变株的构建

PCR扩增出鳗弧菌M3溶血素基因的保守区序列,根据保守区序列设计引物,利用反向PCR和巢式PCR扩增出溶血素基因的部分序列,结合构建的鳗弧菌M3的基因组文库,克隆出溶血素基因的全长序列。根据基因推测的氨基酸编码序列与已发表的血清型为A的鳗弧菌PT84057有86％的相似性。用自杀质粒对鳗弧菌M3染色体上的溶血素基因进行了插入突变,将突变株对金鱼进行肌肉注射,结果发现,突变株的毒力没有发生显著的变化,证明所克隆的溶血素基因对鳗弧菌M3的毒力没有直接的贡献。     

真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因的克隆及表达分析

采用同源克隆的策略,设计了3对引物,首次分离、克隆了2820bp的真鲷肌肉生长抑素(MSTN)基因组序列,该序列在GenBank上注册(注册登录号为AY965686).经过剪接、比较,分析了真鲷MSTN基因的序列和结构特征.真鲷的MSTN基因具有3个外显子、2个内含子,整个开放阅读框编码着384个氨基酸,第1个外显子上有一个连续11个Q氨基酸的残基,C-末端具有9个保守的半胱氨基酸及一个RVRR的蛋白酶解加工位点.在第1、第2内含子和3'非翻译区上分别具有一个微卫星重复序列.RT-PCR分析表明,MSTN基因在真鲷不同组织中都有表达,但表达量具有明显的差异;MSTN在肌肉中表达量最高,其次是脑、小肠、头肾、鳃和性腺,心脏、眼睛、肝脏中只有极少量表达,脾脏中没有检测到MSTN的表达.     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及其转基因烟草抗虫性初探

从未成熟的大豆叶中提取总ＲＮＡ，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因单一目的片段，克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）ＳｍａＩ位点上。序列分析表明，该基因与报导的序列高度同源：其核苷酸序列及推论的编码氨基酸序列的同源率分别为９９．５％和９８．２％。由此，构建了大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因的植物高效表达载体ｐＢｉｎＳＫＴＩ。并采用农杆菌介导的叶盘法转化了烟草，获     

O139霍乱弧菌LPS基因和O抗原基因在大肠杆菌中的克隆表达及O抗原基因结构的初步研究

本研究采用构建基因文库的方法,构建了O139霍乱弧菌的粘粒基因组文库及重组粘粒的亚克隆文库.另外构建了质粒基因组文库.从文库中筛选到可以表达O139霍乱弧菌LPS和O抗原的重组克隆,经鉴定重组克隆表达的LPS和O抗原不但具有与O139霍乱弧菌的LPS和O抗原具有相同的反应原性,而且还具有相同的免疫原性.O抗原基因的部分测序分析表明,O139霍乱弧菌的抗原基因与O1群霍乱弧菌的O抗原基因不同源.