酪蛋白糖巨肽分离条件的研究

探讨了利用了(NH4)2SO4分级沉淀、三氯乙(TCA)纯化酪蛋白的胃蛋白酶水解物中 CGMP的工艺.结果表明,经过20%和65%饱和度的硫酸铵沉淀胃蛋白酶水解物,质量分数为12%的TCA纯化得到的样品,其纯度为91.2%.整个工艺路线简便、快捷、成本较低,适合工业化生产.     

凝胶层析和离子交换层析结合法纯化重组降血压肽VLPVPR

为了提高VLPVPR的纯度,采用凝胶层析结合离子交换层析的方法对VLPVPR进行纯化。先用Sephadex G-10凝胶对VLPVPR溶液脱盐,再考察离子交换剂(SP Sepharose Fast Flow和Q Sepharose Fast Flow)对重组降血压肽VLPVPR的纯化效果,确立纯化VLPVPR的优化工艺。实验结果表明SP Sepharose Fast Flow不适于VLPVPR的纯化。采用Q Sepharose Fast Flow的纯化工艺为:上样量为柱床体积的10%,用10mmol/L pH9.0的CHES缓冲液洗脱,流速为1mL/min。VLPVPR回收率为93.8%,纯度达到47.2%。采用Q Sepharose Fast Flow纯化提高了VLPVPR的纯度。     

蛋白A的固定及在抗体亲和纯化中的应用

目的 以蛋白A作配基偶联活化的Sepharose 4FF后纯化兔免疫蛋白IgG.方法 以环氧氯丙烷(ECH)活化凝胶,正交试验确定最佳活化条件;以纯化数据确定抗体兔免疫蛋白IgG纯化最佳缓冲液盐浓度.结果 Sepharose 4FF最佳活化条件:ECH浓度20％(v/v),0.8 mol/L NaOH添加量为1 mL/1 g Sepharose 4FF湿胶,活化时间2.5 h,反应温度40℃.结论 建立将活化琼脂糖凝胶Sepharose 4FF与蛋白A偶联的条件,可应用于纯化兔免疫蛋白IgG.     

金枪鱼碎鱼肉中肌红蛋白的初步提取和纯化

研究了从肌红蛋白含量较高的金枪鱼加工废弃物碎鱼肉中提取氧合肌红蛋白，得到了提取的最佳实验条件：样品体积2．5倍的0．01mol／LpH8．6Tris-HCI缓冲液、提取1．5h、硫酸铵饱和度90％盐析等，并经透析、DEAE-Sepharose FF离子交换柱进行了初步的层析纯化，得到蛋白质量分数迭87．11％的肌红蛋白。     

阴离子交换树脂分离酪蛋白糖巨肽工艺条件优化

采用离子交换树脂从乳清粉中分离酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide,CGMP),筛选适于分离CGMP的离子交换树脂并考察静态吸附过程中吸附pH值、吸附时间、缓冲液浓度等因素对CGMP分离效果的影响。乳清粉溶液在pH5.1时离心除杂后与201×4树脂混合,吸附条件为吸附pH3.9、吸附时间1h、缓冲液浓度0.02mol/L、洗脱液为0.5mol/L pH4.0的氯化钠溶液、洗脱时间4h;100g乳清粉利用此工艺条件可得1.45g唾液酸含量10.4%(以蛋白质计)的CGMP。该工艺方法分离过程简单、纯化效果好、唾液酸含量高,适用于工业化生产。     

PEG/(NH4)2SO4双水相体系提取和纯化糖化酶

用PEG／（NH4）2SO4双水相体系提取，纯化糖化酶，研究了影响体系分配系数，回收率和纯化因子的因素从而确定了萃取糖化酶的最佳条件。在WPEG为0．24，W（NH4）2SO4为0．08条件下，分配系数最小，达0．022，回收率为95．6％。     

酪蛋白糖巨肽的生理功能及发展前景

酪蛋白糖巨肽（casein Glycomacmpepride，简称CGMP）是一种含有唾液酸的糖肽，用凝乳酶或酸性蛋白酶水解牛乳酪蛋白（主要是K-酪蛋白），乳清中含有CGMP。简述CGMP的化学结构、制备、检测方法、生物活性、研究现状及应用前景。     

文蛤纤维素酶分离纯化及性质

采用缓冲液提取、(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析,从文蛤(Meretrix meretrix L)中分离纯化出一种纤维素酶。结果显示:纯化后的纤维素酶比活力达到40.33 U/mg,纯化倍数为13.12;SDS-PAGE检测其亚基相对分子质量为59 700;文蛤纤维素酶的最适pH为5.2,最适反应温度为45℃,该酶在p H 4～6和4～50℃范围内有较好的稳定;在最适条件下,以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物测得其Km值为0.111 mmol/L。     

两步盐析联合双水相萃取提取纯化蓝藻中藻蓝蛋白

以巢湖新鲜蓝藻为处理对象,采取冻融破壁的方式获取藻蓝蛋白的粗提液,采取两步盐析联合双水相萃取的方法提取纯化藻蓝蛋白。运用0.618法选点实验研究了两步盐析中(NH4)2SO4饱和度对提取纯化影响,构建了聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）-(NH4)2SO4的双水相体系,综合考虑PEG相对分子质量、PEG质量分数、(NH4)2SO4质量分数、pH值和藻蓝蛋白质量浓度对提取纯化藻蓝蛋白的影响。结果表明：室温25 ℃条件下,一步盐析时(NH4)2SO4的最佳饱和度为21%,二步盐析时(NH4)2SO4的最佳饱和度为30%。两步盐析后得到的藻蓝蛋白构建成PEG-(NH4)2SO4的双水相体系后,当PEG相对分子质量1 000、PEG 1 000质量分数10%、(NH4)2SO4质量分数25%时,藻蓝蛋白的纯度可达3.45。     

人血清白蛋白和干扰素α2b融合蛋白在毕赤酵母中表达及质量控制

筛选获得毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K/hsa-ifnα2b,胞外分泌表达rHSA-IFNα2b药物蛋白.经摇瓶及5L发酵罐条件优化,确定最佳发酵条件.经50 L发酵罐工艺放大,发酵产量稳定,可达到350 mg/L.离心获得发酵上清液,超滤浓缩10倍,再依次通过Blue Sepharose 6FF亲和层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析及Q Sepharose 6FF离子柱纯化.纯化产品进行SDS-PAGE纯度检测、SEC-HPLC检测、相对分子质量测定、N端测序、内毒素检测和生物活性检测.筛选获得一株高产菌,优化获得最佳的发酵条件.纯化产品检测(SEC-HPLC)纯度大于95％,相对分子质量为85821,氨基酸的N端测序为DAHKSEVAHRFKDLG,与预期的相符.内毒素含量小于5EU/mg,符合国家药典的要求.体外生物细胞活性高达1.6×106 IU/mg.具有良好的工业应用价值.     

Emulsifying Peptides from the Tryptic Hydrolysis of Casein

ABSTRACT: Casein was hydrolyzed by trypsin to 5% degree of hydrolysis, and the hydrolysate was fractionated by ultrafiltration. While screening for the best emulsifying properties, the retentate fraction was systematically fractionated by ammonium sulfate precipitation, ion exchange, and reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC). Residue from 30% ammonium sulfate saturation yielded 3 fractions on anion exchange chromatography. Preparative reverse-phase HPLC was used to isolate 4 peptides with good emulsifying properties for characterization. Computational methods were used to complement amino acid sequencing, and the peptides were identified as originating from αs-1 casein (f167-208), β-casein (f48-63), and (f129-184). A 4th peptide could not be conclusively identified. Properties of the emulsifying peptides are discussed.     

辣木凝乳酶水解酪蛋白位点及其酪蛋白磷酸肽、酪蛋白糖巨肽

基于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,液相色谱-串联质谱法研究辣木凝乳酶对酪蛋白的酶切位点和水解特性,并分析该凝乳酶水解产生的酪蛋白糖巨肽和酪蛋白磷酸肽。结果表明,辣木凝乳酶酶切κ-酪蛋白的Arg 93-His 94位点导致凝乳,区别于其他已报道的凝乳酶,具有明显特异性。酶作用下κ-酪蛋白的米氏常数Km=0.49 mg/mL,最大反应速率Vm=45.2 U/min,有效促进酪蛋白胶束的聚集和凝乳。该酶对α-、β-、κ-酪蛋白产生不同程度的水解,对α-酪蛋白的水解速度最快,说明其适用于软质奶酪的加工。以酪蛋白为底物,通过钡-乙醇沉淀法得到酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides,CPPs）,产率为15.87%,得到的CPPs可以使钙沉淀推迟23 min,有利于钙离子被肠道有效吸收。以水牛乳为底物时,乳凝固后析出的乳清中含酪蛋白糖巨肽6.61 mg/mL,糖基化程度477.527 μg/mg。研究为新型植物凝乳酶的研发,及其在奶酪、酪蛋白活性肽等产品的应用提供科学依据。     

酪蛋白水解物的类蛋白反应修饰及其产物ACE抑制活性特征

采用碱性蛋白酶水解酪蛋白,制备水解度为10.9%、IC50值为52.6μg/mL的酪蛋白水解物,并利用响应面法优化碱性蛋白酶催化的类蛋白反应修饰条件。修饰反应时间固定为6h时,适宜的条件为酶添加量3.1kU/g pro、底物质量浓度50g/100mL、反应温度25℃。制备9个修饰程度不同的修饰产物,结果显示：修饰产物ACE抑制活性均提高,并且活性最高的修饰产物的IC50降低至14.9μg/mL。该修饰产物离心分级后,上清液部分和沉淀部分的ACE抑制活性分别低于和高于修饰产物,表明沉淀部分是提高ACE抑制活性的主要原因;Tricine-SDS-PAGE电泳分析表明,修饰产物及沉淀部分有较大分子质量的肽分子生成;该修饰产物和上清液部分、沉淀部分的进一步酶水解处理则显示,酶水解会导致它们的ACE抑制活性降低,但是仍然高于最初的酪蛋白水解物。     

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

利用硫酸铵盐析、季氨乙基-琼脂糖凝胶FF（Q-Sepharose FF）离子交换层析、苯基-琼脂糖凝胶6 FF（Phenyl-Sepharose 6 FF）疏水层析和丁基-琼脂糖凝胶HP（Butyl-Sepharose HP）疏水层析对黑曲霉来源β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定其分子质量,并对其酶学性质进行研究。结果表明,经分离纯化后得到分子质量约为116 kDa的β-葡萄糖苷酶,纯化倍数达到50.39倍,回收率为4.65%,比酶活为103.80 U/mg,该β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH值为5.0,在温度30～50 ℃,pH 2.0～8.0之间具有较好的稳定性。     

Effect of extraction buffer on estimating calpain and calpastatin activity in postmortem ovine muscle

The effect of extraction buffer on extractable calpain and calpastatin activity in postmortem muscles was examined. Muscles were removed from ovine carcasses 24 h after slaughter and extracted with three volumes of two extraction buffers containing 20?(pH 7.5) and 100 (pH 8.3) mM Tris. There was a significant difference in pH of the muscle homogenates, having a pH of 5.84 and 7.58 for 20 and 100 mM Tris base, respectively. Calpastatin, μ-calpain and m-calpain all had significantly reduced activity in extracts made with 20 mM Tris (pH 7.5) buffer compared to 100 mM Tris (pH 8.3) buffer, showing a loss of, respectively, 30, 57 and 37%. These results indicate the impact of choice of buffer on the extractable calpains and calpastatin activity from postmortem muscle. To avoid loss of calpains due to isoelectric precipitation, the pH of the muscle homogenate (after homogenization and prior to the first centrifugation) must be above 6.2.     

以蚯蚓为原料制备生物态含铁蛋白质纯品

以获取高营养性的蚯蚓含铁蛋白质为目的，根据蚯蚓体内血红蛋白分子结构的特性与分布状态，采用了双水相萃取等分离纯化工艺进行了制备生物态含铁蛋白质纯品的研究。结果表明，用聚乙二醇（12％，W／W）．硫酸铵（12％，W／W）组成的双水相萃取样品后直接用等电点沉淀法，即在pH约为5．1的缓冲液中进行透析可获得高纯度的蚯蚓含铁蛋白。在此基础上若再采用Q Scpharosc fast flow离子交换层析和梯度洗脱的方法就能使产品的质量进一步提高。综合分析说明了研究中所采用的工艺较简单，成本不高，可操作性好，且能获得高品质的含铁蛋白质产品。研究为从食品层面上利用开发蚯蚓、推动饲养蚯蚓产业的发展和制备补血功能食品等提供了实验数据。     

分离纯化提高鸡肝酯酶对农药抑制响应的研究

本文对鸡肝酯酶粗酶液分别进行了硫酸铵分级盐析、硫酸铵分级盐析+透析和硫酸铵分级盐析+排阻色谱三种分离纯化操作,并采用四种结构不同的有机磷、氨基甲酸酯类农药,考察了不同的分离纯化操作对鸡肝酯酶对农药抑制响应的影响。发现经过这三种分离操作后,酯酶对农药抑制的响应程度显著提高,其被四种农药抑制的程度分别提高了6.49~11.30%、14.30~26.26%和10.95~39.87%,而敏感酯酶回收率分别为86.07~89.96%、66.60~73.57%和33.01~41.62%。由于分级盐析+排阻色谱的回收率过低,分级盐析+透析操作对于大规模的检测用酶制备更为实用。此外,研究还发现对这四种农药较敏感的酯酶均集中地分布在相同的分离部分,因此推测鸡肝酯酶粗酶液中对农药抑制敏感的酯酶可能是一种酶或几种溶解性质及分子量都比较接近的酶的混合。     

盐析法提取卵黄免疫球蛋白的研究

为了确定盐析法提取特异性卵黄免疫球蛋白的最佳盐浓度，采用SDS—PAGE鉴定IgY的纯度，用RID测定IgY含量，间接ELISA法检测特异性卵黄抗体的活性。结果表明：用饱和度50％的硫酸铵盐析一次，再用140g／L的硫酸钠溶液盐析，可以获得469，6的回收率和77％的纯度。盐析液经超滤膜包超滤后制得的冷冻干燥制品，保持了完整的抗体结构和良好的抗体活性。这一结果为IgY的进一步分离纯化奠定了基础。     

PURIFICATION OF AMINOPEPTIDASE FROM THE JAPANESE CLASSIFIED BARLEY FLOUR

In a search for biologically active materials from the classified barley flour produced in Japan an aminopeptidase activity was identified. In this paper, the purification of aminopeptidase is described. The activity of the enzyme was monitored using L-leucine-p-nitroanilide as the substrate. After extraction using 20 mM sodium acetate buffer, pH 5.5, from the 95–75% classification flour, ammonium sulfate fractionation was performed between 30 and 50% saturation. The aminopeptidase was then purified about 160-fold to homogeneity as assessed by HPLC using the following sequential chromatography steps: hydrophobic interaction chromatography, Sephacryl S-200HR gel chromatography, DEAM-ion exchange chromatography, hydroxylapatite chromatography, Sephacryl S-100HR gel chromatography. The molecular weight of this enzyme was estimated as 62 kDα by size exclusion HPLC. The enzyme had a K_m value of 0.22 mM and α pH optimum of 7.0.