2’-岩藻糖基乳糖的功能、合成及应用研究进展

2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)在母乳低聚糖(human milk oligosaccharides,HMOs)中含量最高,研究证明2’-FL具备调节婴儿肠道菌群平衡、抵抗病原体的黏附、免疫调节和促进婴儿大脑神经发育等功能。合成2’-FL的方法有化学合成法、酶法合成法与全细胞合成法。2’-FL已经进入商业化生产阶段,其产业化受到产量、成本、品质及安全等因素的制约,需要在合成宿主、碳源的选择等方面进一步开展相关研究。2’-FL已被美国和欧洲联盟等国家批准可添加至婴幼儿配方食品及膳食补充剂中,研究证明添加了2’-FL的婴幼儿配方奶粉在营养成分和功效上更贴近母乳。本文综述了2’-FL的结构、母乳中的含量及其生理功能,总结了现阶段2’-FL的制备方法和应用情况,展望了2’-FL未来的研究方向,为2’-FL在婴幼儿配方食品中的开发及应用提供理论支持。     

2’-岩藻基乳糖对益生菌定殖及抗炎能力的影响

目的:探究2’-岩藻基乳糖（2’-Fucosyllactose,2’-FL）对乳酸菌和双歧杆菌增殖、粘附肠道细胞以及抗炎作用的影响。方法:以2’-FL和实验室的30株乳酸菌和双歧杆菌为研究对象,通过测定生物量、产酸和细胞粘附倍数的变化筛选出2’-FL可以增强定殖能力的菌株,再利用脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症模型进一步筛选出其中的潜在抗炎菌株,最后探究2’-FL和潜在抗炎菌株的联合抗炎效果。结果:30株实验菌株中,2’-FL仅能促进两歧双歧杆菌FL-276.1和FL-228.1的增殖,提高乳酸菌ML-1、FN515、FN518、FN249、ML329和双歧杆菌FL-276.1粘附Caco-2细胞的能力。其中两歧双歧杆菌FL-276.1、FL-228.1和鼠李糖乳杆菌FN518可以显著（P<0.05）降低脂多糖诱导的Raw264.7细胞炎症因子NO、TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌。2’-FL可以显著降低NO、IL-6和IL-1β的分泌。2’-FL与上述3株菌联用具有协同抗炎作用,但协同效果具有菌株差异性,其中FL-276.1与2’-FL协同抗炎效果最好。结论:2’-FL可以提高乳酸菌和双歧杆菌的定殖能力,并协同发挥抗炎功能,但效果具有菌株差异性,这一结果可以为预防早产儿坏死性小肠结肠炎提供新的选择。     

不同通路配置对大肠杆菌合成2’-岩藻糖基乳糖的影响

在大肠杆菌BL21 Star (DE3)中建立了2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）的从头合成途径，通过CRISPR/Cas9系统敲除了β-半乳糖糖苷酶基因lacZ M15序列和尿苷二磷酸-葡萄糖脂质载体转移酶基因wcaJ，探究了操纵子、假操纵子和单顺反子3 种不同通路配置对重组大肠杆菌合成2’-FL的影响。结果表明：从头合成途径的基因在大肠杆菌BL21 Star (DE3)过表达后摇瓶发酵产生的2’-FL质量浓度为0.34 g/L。敲除lacZ M15和wcaJ后，重组菌产生的2’-FL质量浓度增加到了1.26 g/L。在操纵子形式下，重组菌BS-7摇瓶发酵产生的2’-FL质量浓度最高，达1.92 g/L。BS-7在10 L发酵罐中分批补料发酵37 h后产生的2’-FL质量浓度达到14.04 g/L，2’-FL产率为0.59 g/（L·h），乳糖转化率为63%。因此，大肠杆菌合成2’-FL过程中，较低的基因表达强度更有助于提高其产量，同时可提高底物的转化效率。     

2’-岩藻糖基乳糖的微生物合成研究进展

2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）是母乳寡糖中含量最高的寡糖（约占31%），在婴幼儿的生长发育中起重要作用。2019年底，2’-FL已经在欧盟获批作为新型食品投入市场，因此，如何高效、安全地生产2’-FL成为当下的研究热点。与其他方法相比，利用微生物细胞工厂进行2’-FL的合成具有成本低、安全、快捷等特点，是实现大规模生产2’-FL的可行方法。本文主要针对微生物合成2’-FL过程中关键酶的活性、产物的分泌和积累、底物和中间代谢产物的分解代谢以及辅因子再生等方面进行综述，并对未来的发展趋势进行展望。     

地杆菌α-L-岩藻糖苷酶的分子改造及其在合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用

对地杆菌α-L-岩藻糖苷酶进行分子改造，以提高其酶法合成2’-岩藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）的转化效率。利用易错聚合酶链式反应构建了α-L-岩藻糖苷酶的突变体文库，筛选得到一个合成2’-FL转化率提高的突变酶（mPbFuc29A1）。酶学性质研究结果表明mPbFuc29A1的最适pH值和温度分别为pH 5.0和40 ℃，最适温度较野生型PbFuc29A1提高了5 ℃；突变酶水解2’-FL的比活力提高到3 倍，但是水解4-硝基苯基-α-L-岩藻糖苷（4-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside，pNP-FUC）和3’-岩藻糖基乳糖（3’-fucosyllactose，3’-FL）的比活力分别降低了22.8%和52.5%。以pNP-FUC和乳糖为底物，采用mPbFuc29A1酶法催化合成2’-FL和3’-FL，转化率分别为23.6%和56.4%，其中2’-FL的转化率较PbFuc29A1提高了9.1%。通过序列及定点突变分析发现mPbFuc29A1的氨基酸序列中有2 个位点发生突变（Asp21Val和Glu266Lys），其中位于loop区的Glu266Lys可能是mPbFuc29A1底物特异性和转糖苷产物组成发生改变的关键。优良的酶学特性使mPbFuc29A1在2’-FL合成中具有较大的应用潜力。     

高效液相荧光色谱法检测婴幼儿配方食品中7种母乳低聚糖

摘 要: 目的 建立高效液相荧光色谱法(high performance liquid chromatography with fluorescence detector, HPLC-FLD)检测婴幼儿配方食品配方奶粉中7种母乳低聚糖(human milk oligosaccharides, HMOs)的分析方法。方法 婴幼儿配方食品复溶后, 首先通过酶解处理(β-半乳糖苷酶和淀粉葡萄糖苷酶)去除婴幼儿配方食品基质中存在的HMOs干扰物, 例如麦芽糖糊精和低聚半乳糖, 酶解后向样品溶液中添加内标物质, 后使用衍生化方法使得目标HMOs和内标物质均标记荧光基团(2-氨基苯甲酰胺), 即可运用HPLC-FLD对其进行检测。该方法使用HMOs外标法进行目标物的定量分析, 且标准物质信号均亦通过内标物矫正。结果 婴幼儿配方食品中7种HMOs可通过酶解、衍生及HPLC-FLD检测, 使用外标法进行定量分析。通过内标物质可矫正信号, 减少实验偏差。7种HMOs [2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose, 2’-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose, 3-FL)、双岩藻糖基乳糖(difucosyllactoses, DFL)、乳糖N-四糖(lacto-N-tetraose, LNT)、乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose, LNnT)、3’-唾液酸乳糖(3’-sialyllactose, 3’-SL)和6’-唾液酸乳糖(6’-sialyllactose, 6’-SL)]可检测范围分别为20.0~1247.9、18.3~1146.2、7.6~455.1、16.4~821.9、16.3~814.2、7.2~431.6、8.0~477.2 mg/100 g powder, 准确度范围为91%~110%, 相对标准偏差低于2%。结论 该方法可实现0~36月龄婴幼儿配方食品中7种HMOs的定量检测, 结果准确可靠。     

2′-岩藻糖基乳糖的生物合成菌株构建及发酵条件研究

2′-岩藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL)可作为益生元添加到婴幼儿配方奶粉中,对婴幼儿肠道菌群和免疫系统的发育至关重要。通过共表达L-岩藻糖激酶/GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(L-fucokinase/GDP-L-fucose pyrophosphorylase,fkp)基因和α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-fucosyltransferase,futC)基因,以大肠杆菌Escherichia coli BL21star(DE3)为出发菌株,异源表达脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)来源的fkp和futC基因,建立了2′-FL的合成途径。通过CRISPR/Cas9系统敲除β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶(UDP-glucose lipid carrier transferase,WcaJ)基因,阻断中间代谢产物的分解,探究该类基因对2′-FL合成的影响。实验结果显示:单敲除LacZ基因促进2′-FL的产量并提高1.88倍,对菌体生长影响不显著;叠加敲除基因LacZ和WcaJ后,2′-FL的产量提高4.89倍,且对菌体生长没有显著影响。通过摇瓶发酵优化,确定了发酵条件为:采用限定性培养基(DM培养基),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导浓度为0.2 mmol/L,诱导温度为25℃,接种量为5%。在此条件下摇瓶培养,2′-FL产量最高可达1.44 g/L。研究表明敲除β-半乳糖苷酶和UDP-葡萄糖脂质载体转移酶基因可显著提高2′-FL产量,为扩大其工业化生产提供参考依据。     

离子色谱法测定母乳中的寡聚糖与游离唾液酸

母乳寡聚糖(HMOs)是母乳中第三大营养素,其含量仅次于乳糖与脂肪,是婴儿健康成长的重要营养来源。本研究采用离子色谱法(IC)建立并验证了测定母乳中6种主要母乳寡聚糖含量的方法,包括3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、乳糖-N-新四糖(LNnT)、乳糖-N-四糖(LNT)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)及3'-唾液酸乳糖(3’-SL)。另外,母乳中另一种活性成分唾液酸(Neu5Ac)也可以同时测定。将母乳样用超纯水稀释,微孔滤膜过滤后进样分析。以水-氢氧化钠溶液-乙酸钠溶液为流动相,选用CarboPacTMPA-1分析柱进行色谱分离,用脉冲安培检测器检测。所测7种分析组分在该试验条件下能很好分离,且在较宽的质量浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系(r0.999)。方法的检出限(3 s/n)分别为5.2,0.4,2.8,2.5,1.0,1.8,0.5 mg/L母乳,定量限分别为19.8,9.8,19.9,19.7,9.9,9.9,5.0 mg/L母乳。通过测定分泌型与非分泌型的3段乳得出该方法的线性范围与定量限能够满足各类母乳样品的需求。以母乳作为基质,测得各分析组分的加标回收率(n=6)在91.8%～106.1%之间,母乳基质与加标样测定值的相对标准偏差(n=6)小于3.7%。本方法样品处理简单快速,具有较低的检出限与定量限,较宽的线性范围,良好的重现性与回收率,适用于母乳样品中6种主要寡聚糖与游离唾液酸的准确测定。     

重组大肠杆菌补救途径合成2′-岩藻糖基乳糖的分子克隆和产物合成分析

2′-岩藻糖基乳糖作为人乳寡糖中含量最多的一种，对婴幼儿健康生长发育有重要作用，是极具应用价值的母乳概念配方奶粉添加剂。该研究通过比较不同来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶，选定幽门螺杆菌来源的α-1,2-岩藻糖基转移酶基因fucT2与脆弱拟杆菌来源的L-岩藻糖激酶基因fkp共表达，构建了2′-FL的补救合成途径。对乳糖转运蛋白LacY以及2′-FL运出蛋白伯氏耶尔森氏菌来源的糖转运蛋白Tpyb或大肠杆菌来源的糖转运蛋白SetA适量过表达，大幅增加了胞外产物浓度。比较BL21(DE3)、C41(DE3)、JM109(DE3)这3种菌株的2′-FL合成能力，得到了基于JM109(DE3)的2′-FL最终合成菌株J2-V8。通过发酵条件优化，在摇瓶中48 h得到2′-FL的胞外质量浓度为2.67 g/L,较初始菌株提高了5倍，转化率为0.82 mol/mol岩藻糖，以上结果为2′-FL的生物制备技术开发提供了借鉴。     

基于HPLC-MS/MS的羊乳寡糖GP衍生化条件优化

高效液相色谱-质谱联用仪（HPLC-MS/MS）广泛应用于寡糖分析，但寡糖的复杂结构使寡糖的数据分析准确性存在诸多变数，衍生化效果的好坏对检测灵敏度与准确性至关重要。通过衍生化可以改变寡糖的疏水性或电荷性质，为提高质谱分析中多糖的电离效率和分析灵敏度提供了一种可行的方法。采用吉拉德试剂P(Girard’s Reagent P,GP)对母乳和羊乳寡糖的衍生化效率进行研究，结果表明随着GP溶液质量浓度和体积的增加，寡糖原型显著减少，50 mg 2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）中加入0.1 mol/L GP溶液5 mL时，GP衍生化效率达到99%以上，羊乳寡糖衍生化后6种寡糖检测结果与2’-FL平行一致，表明该种衍生化方法效果良好，此法可为乳寡糖的精准检测分析提供技术参考。     

The basis streamlines of activities of Department of Preventive Medicine of RAMS

The article gives a brief account of the main streamlines and scope of scientific activities of Department of Preventive Medicine of RAMS for the recent 10 years.     

两种脂肪酸聚甘油酯(PGE)的性质比较

脂肪酸聚甘油酯(Polyglycerol esters of fatty acids,简写为PGE)在常温下有半固态和固态两种存在状态,本文通过对分别添加这两种PGE的软冰淇淋基料进行粘度、pH、粒径分析和垂直扫描分散稳定性分析(Turbiscan),发现半固态PGE的添加量为0.2%时,乳状液的粘度最低,粒径最小,稳定性最好;固态PGE的添加量为0.4%时.乳状液的粘度最低,粒径最小.通过比较发现,两种PGE对基料的影响有很大差别:半固态PGE能使乳状液的粒子更小,并能有效延长乳状液的稳定性;而固态PGE由于其熔点较高,可以促进脂肪结晶.     

葵花籽油中酸价测量结果的不确定度评价

目的 分析食用油中酸价测定的不确定度来源并建立不确定度评定方法, 为检验数据的可靠性和准确性提供参考。方法 依据GB 5009.229-2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》和JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》建立数学模型, 计算各变量的不确定度, 最终计算扩展不确定度。结果 结果显示, 样品中酸价的扩展不确定度为U=1.764×10?3 mg/g, 样品中酸价含量为(0.16±0.002) mg/g(置信水平95%, 包含因子k=2)。结论 在测定过程中, 测量重复性对总的不确定度影响最大, 其次是滴定管的体积。     

有梭织机稀密路织疵成因分析

从有梭织机打纬过程中织机构件的位置和状况对纬纱之间距离的影响出发,推导出纬向密度计算公式,直观分析了影响纬向密度的各种因素,提出了为减少稀密路织疵在国产老织机上采取的几项改进措施：采用弹簧回综、机外送经、电子驱动、导布辊加压等装置。     

啤酒小麦木聚糖酶酶学性质的研究

通过DNS法测定小麦木聚糖酶酶促反应的最适条件。结果表明:小麦木聚糖酶酶促反应的最适温度是50℃,最适pH是5.5~6.0,最适底物浓度是1.0000%,最适底物与酶液用量比例为9/1,最适反应时间为5-9min。     

酶水解猪皮胶原的色谱分离研究

比较详细地描述了用现代色谱分离的试验方法.用本实验室自制的弱阳离子交换树脂将猪皮胶原的酶水解产物成功地分离为5个组分,并详细讨论了影响分离效果的各种因素,确定了最佳分离条件.     

曲虫治理效果分析

通过对曲虫治理应用研究效果的分析 ,结果表明 :质量效果提高 7% ,糖化力效果提高 80 % ,综合效果提高 92 7%。     

分离高温盐的工艺条件研究

文章利用不同温度下Na ,K ∥Cl-,SO2 -4 —H2 O四元体系相图 ,对通过物理方法分离高温盐中一水硫酸镁和氯化钠的工艺条件进行了分析。得出当循环母液和高温盐配成的浆料温度超过 5 5℃ ,浆料液体中氯化镁达到一定浓度时 ,才能分离出纯净的一水硫酸镁和氯化钠。     

核苷酸磷酸基团保护的研究

将谷氨酸钠、5′－磷酸鸟苷按1：1混合后，添加柠檬酸，然后用硬脂酸包覆，能够有效地保护核苷酸5′－位上的磷酸基团。其中，（5′－磷酸鸟苷＋谷氨酸钠）：柠檬酸：硬脂酸＝30.3:9.1:60.6时，5′－磷酸鸟苷的残存率可达93％。