食品中马源性成分的实时荧光PCR检测

针对马线粒体DNA细胞色素b基因设计特异性引物和探针,建立食品中马源性成分实时荧光PCR检测方法,并经特异性和灵敏度试验验证其可行性。结果表明:该体系可扩增马DNA片段,长度为127 bp,其他常见畜、禽肉成分均无法正常扩增。该体系的检测灵敏度为1.25 pg马DNA和质量分数0.001%马肉粉。经市售食品的检测验证,表明所建立的马引物探针体系具有特异性好、灵敏度高、快速、高效等优点,可用于对食品中马源性成分的掺假鉴别检测。     

探讨《驴成分检测实时荧光PCR法》标准中检出限的合理性

目的探讨SN/T3730.4-2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第四部分:驴成分检测实时荧光PCR法》标准中检出限规定的合理性。方法参考SN/T 3730.4-2013提供的引物及探针序列,采用实时荧光PCR检测方法鉴别市场抽检驴肉的真伪性。结果 Ct值在25~35之间的样品按照SN/T 3730.4-2013标准规定应判为检出驴成分,但通过对上述样品用马源性引物进行扩增和测序得知样品为马肉而非驴肉。结论建议标准应根据不同的检验对象制定不同的检出限,从而降低出现假阳性的概率。     

实时荧光PCR技术快速检测奶制品中掺入的大米源性成分

目的:建立基于实时荧光PCR技术的奶制品中掺入大米源性成分的快速检测方法。方法:以水稻的根部表达基因(gos9)为靶基因设计特异性引物和探针,经特异性实验和灵敏度实验验证引物探针可行性,并经模拟含大米奶粉及市售奶类制品检测验证其实际检测能力。结果:该引物探针体系只针对大米DNA进行扩增,与奶类主成分牛、羊及其它谷类和植物性食物DNA均无交叉扩增;最低能检测到0.1ng的大米DNA,对含大米粉的模拟混合奶粉样品,检出限可达0.1%(W/W)。将其应用于21份市售奶制品样品检测,对含大米源性成分的奶制品扩增阳性,检测结果与食品标签相符。结论:该实时荧光PCR检测体系具有快速、特异、灵敏的优点,可以准确鉴定出奶制品中大米成分,适用于奶类中掺加大米源性成分的检测。     

SN/T 2980-2011在动物源性成分检测中的适用性分析

目的 探讨行业标准SN/T 2980-2011《动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法》在动物源性成分检测中的适用性。方法 基于中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2980-2011和国家标准GB/T 25165-2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法》对鲜肉组织及加工肉制品进行动物源性成分检测实验, 建立依托上述标准的动物源性成分检测能力。结果 SN/T 2980-2011中牛源性成分检测特异性不佳, 山羊源性成分检测特异性良好, 绵羊探针仅适用于单通道实时荧光PCR检测; GB/T 25165-2010中的牛、羊源性成分检测均展示出良好的特异性。结论 建议SN/T 2980-2011行业标准的起草单位及起草人重新设计适用于三重实时荧光PCR的牛、绵羊引物及探针,既要保证引物和探针的特异性也要保证适用性。     

大豆粉转基因成分能力验证样品的检测分析

目的 提高实验室对转基因大豆定性检测的准确性和检测人员专业技术水平, 增强实验室竞争力。方法 通过核酸蛋白仪器分析法和单重实时荧光PCR (simplex real-time fluorescence PCR)法对样品内源基因扩增的循环阈值的影响来比较2种方法, 分析2种DNA提取试剂盒的提取质量。对标准SN/T 1204-2016《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》扩增反应体系中DNA模板量进行优化后, 对样品进行检测。再依据标准SN/T 1202-2010《食品中转基因植物成分定性PCR检测方法》的要求, 对样品进行检测。最后对2个标准的检测结果进行比对。结果 通过内源基因扩增循环阈值的数据确认, 更能准确反映试剂盒提取的DNA是否满足后续外源基因的分析检测要求。2种标准方法对19-N578和19-M913 2个待测样品的检测显示3种外源基因CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS均为阴性, 19-N578和19-M913待测样品均为非转基因大豆。结论 本次能力验证获得满意评价。DNA提取质量的评估, 体系中DNA模板量的优化, 检测方法的选择和实验的质量控制都是影响能力验证结果的重要因素。     

基于TaqMan实时荧光PCR检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分

根据出入境检验检疫行业标准SN/T 3730.4—2013《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第4部分：驴 成分检测 实时荧光PCR法》合成引物和探针,利用TaqMan实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）技术检测鲜肉及加工肉制品中的驴源性成分。首先对13 种不同动物鲜肉组织的DNA进行驴源性成分特异 性检测,然后对驴源性DNA模板原液进行梯度稀释,检测方法灵敏度,最后在加工肉制品中检测方法的适用性。 结果表明：本研究建立的方法特异性强,除驴肉外,牛、羊、猪、马、骆驼、鹿、狗、兔、鸡、鸭、鸽子、鹌鹑 12 种动物鲜肉组织均无特异性扩增;方法的灵敏度较高,驴组分DNA的检出限可达100 fg/μL,灵敏度可达0.01%; 方法的适用性较广,可以用于加工肉制品中驴源性成分的检测。     

肉制品中鸭源性成分TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

目的 建立TaqMan探针实时荧光PCR法快速检测肉制品中鸭源性成分的分析方法。方法 以鸭生长激素(growth hormone, GH)基因为靶基因, 基于特异性保守序列设计引物和TaqMan探针, 优化反应体系和反应条件, 建立了鸭源性成分实时荧光PCR(real-time PCR)检测方法。结果 所建立的real-time PCR方法特异性强, 仅对鸭基因组DNA出现特异性扩增曲线, 对牛、羊、猪等其他异源性动物基因组DNA均无扩增曲线; 灵敏性高, 以鸭基因组DNA为模板, 检出限为1.0 pg; 重复性好, 不同浓度基因组DNA测定的Ct值变异系数小于4%。使用建立的real-time PCR方法对200份市售肉制品进行检测, 在11份肉制品中检出鸭源性成分, 同现行行业标准SN/T 3731.5—2013检测结果一致。结论 本研究所建立的real-time PCR方法检测具有特异性强、敏感性高、快速高效等特点, 适用于肉制品中鸭源性成分快速检测。     

利用实时荧光定量PCR法检测食品中鹌鹑源性成分

为建立基于TaqMan实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术在食品中的鹌鹑源性成分的定量检测方法,根据现行检验检疫标准(SN/T 2727-2010)合成引物及探针。首先对13种不同动物鲜肉组织的DNA进行鹌鹑源性成分特异性检测,然后对鹌鹑源性DNA模板原液进行梯度稀释,检测方法灵敏度,最后在加工制品中检测方法的适用性。研究结果表明:建立的方法特异性强,除鹌鹑肉外,牛、羊、猪、马、驴、狗、兔子、鸡、鸭、鸽子、火鸡、鱼12种动物鲜肉组织均无特异性扩增;方法的灵敏度较高,鹌鹑组分DNA的检出限可达10 fg/mL,灵敏度可达0.001%;方法的适用性较广,可以用于加工制品中鹌鹑源性成分的检测。     

骨胶原蛋白肽粉中DNA的提取及猪、羊源性成分的检测

目的 优化深加工骨胶原蛋白肽粉中DNA的提取方法, 鉴定检测其动物源性成分。方法 采用2种试剂盒法, 并对试剂盒部分步骤进行适度修改后提取骨胶原蛋白肽粉中的基因组DNA, 分别用猪、羊引物和探针对提取的DNA片段进行实时荧光PCR扩增检测。结果 只有DNeasy Blood & Tissue Kit提取试剂盒法提取的DNA纯度较好, A260/A280比值为1.73, 浓度为8.2 ng/μL, 并且经18S rDNA片段的PCR扩增结果表明样品中含有哺乳动物DNA, 且DNA中不含抑制PCR反应物质。检测结果表明该骨胶原蛋白肽粉中含有猪源性成分。 结论 采用试剂盒法提取深加工骨胶原蛋白肽粉中DNA时, 需对部分步骤做修改后才可进行。     

肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR检测

通过实时荧光PCR技术检测肉制品中鸵鸟源性成分。根据鸵鸟线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因(COX1)序列,用Primer Express和DNAMAN软件设计特异性的引物和Taq Man探针,并用阳性样本进行验证。结果表明,引物和探针对鸵鸟源性成分的特异性良好,与常见物种DNA无非目标扩增,该方法的检测灵敏度达0.27 pg/反应,适用于鸵鸟源性成分的鉴定,从而建立了肉制品中鸵鸟源性成分的实时荧光PCR鉴定方法 。     

肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PCR检测研究

将荧光染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合,通过对PMA的曝光时间、浓度进行优化,确定PMA-PCR区别死活细胞的最佳条件,并制作活细胞定量标准曲线,建立肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PMA-PCR检测方法。结果表明：使插入死细胞DNA中的PMA活化并且光解溶液中游离PMA的最佳曝光时间为15min;不抑制沙门氏菌活细胞DNA扩增的最大PMA质量浓度为10μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小PMA质量浓度为4μg/mL。经PMA处理,含有不同比例的沙门氏菌热致死细胞和活细胞的混合液中活的沙门氏菌能够通过PCR被选择性的检测,最小检测限为20CFU/PCR。而且,经研究发现在20～2×105CFU/PCR范围内,电泳条带相对荧光强度与活细胞数的对数具有线性关系。采集30份肉及肉制品样品,利用PMA-PCR方法检测出两份生肉样品中存在沙门氏菌,经过6h的富集培养后的活菌浓度分别为2.5×103CFU/mL和3.4×103CFU/mL。     

牛肉粉末中猪源性成分定性检测FAPAS能力验证结果与分析

目的 通过参加牛肉粉末中猪源性成分定性检测FAPAS能力验证, 提高实验人员的专业水平, 扩大实验室影响力以及增强竞争力。方法 根据FAPAS组织方提供的能力验证作业指导书及SB/T 10923-2012《肉及肉制品中猪牛羊马驴鸡鸭鹅兔源性成分的快速鉴定实时PCR法》, 对2个牛肉粉末样品3108A-47、3108B-19进行猪源性成分检测检测。结果 2个样品均检出牛源性成分, 3108A-47未检出猪源性成分, 3108B-19检出猪源性成分。结论 本次能力验证结果为满意。     

A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay

The polymerase chain reaction (PCR) was applied to identify six meats (cattle, pig, chicken, sheep, goat and horse) as raw materials for products. By mixing seven primers in appropriate ratios, species-specific DNA fragments could be identified by only one multiplex PCR. A forward primer was designed on a conserved DNA sequence in the mitochondrial cytochrome b gene, and reverse primers on species-specific DNA sequences for each species. PCR primers were designed to give different length fragments from the six meats. The products showed species-specific DNA fragments of 157, 227, 274, 331, 398 and 439 bp from goat, chicken, cattle, sheep, pig and horse meats, respectively. Identification is possible by electrophoresis of PCR products. Cattle, pig, chicken, sheep and goat fragments were amplified from cooked meat heated at 100 or 120°C for 30 min, but horse DNA fragments could not be detected from the 120°C sample. Detection limits of the DNA samples were 0.25 ng for all meats.     

基于双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术的核酸杂交试纸条快速检测驴肉中的马源性成分

目的：建立快速、操作简单、价格相对低廉的驴肉中马源性成分快速可视化检测技术。方法：采用双拖尾重组聚合酶恒温扩增技术(RPA)与核酸杂交试纸条相结合。针对马线粒体细胞色素b(cytb)基因设计RPA引物,引物包含3个功能区域,特异性绑定区域用于RPA扩增反应,spacer 9用于终止聚合酶的扩增,单链拖尾区域用于与试纸条上的探针杂交。这对特殊引物使RPA扩增子带有两个单链拖尾序列,这两个单链拖尾序列可以特异性地被金纳米探针和试纸条上的检测探针识别并捕获,形成一条肉眼可见的红色条带。整个扩增(15 min)和检测(5 min)过程在20 min即可完成,无需复杂的设备,仅需要一台数字化水浴锅。为进一步验证该方法的实际应用性能,对市面上的20份驴肉产品进行测定,并采用PCR(Polymerase Chain Reaction,PCR)结合琼脂糖凝胶电泳的方法进行验证。结果：该方法对马肉的检测限达到0.01%,且仅对马肉核酸有特异性扩增,与其他8个物种的核酸均无交叉反应,20份驴肉样品中有2份存在马源性成分。结论：该方法特异性强、灵敏度高,可实现驴肉中马源性成分的可视化快速检测。     

实时荧光P C R 法检测食品中芝麻过敏原成分

本实验探讨采用实时荧光定量PCR 方法检测食品中的芝麻成分,结果表明：采用芝麻的引物和探针进行扩增时;22 种样品经实时PCR 扩增,只有白芝麻和黑芝麻产生荧光信号,其余样品均不产生荧光信号。灵敏度实验结果表明能检测到10-5 稀释度的4.4 ×10-12g DNA的量,定量关系式为：y=－ 3.472018x+18.851009,R2=0.993088。这两对引物和探针具有极高的灵敏度和扩增效率,符合痕量检测要求。     

基于COI序列的DNA微条形码技术鉴别熟肉制品中11种肉掺假的研究

建立并优化了基于COI序列的DNA微条形码技术（mini-barcoding）检测熟肉制品中11种常见肉类掺假的方法。样品经超声与真空冷冻干燥处理,提取DNA模板和PCR扩增后,目标扩增物经切胶纯化后进行克隆测序,并将测序结果提交GenBank数据库Blast比对。筛选出适合猪、牛、羊、鸡、鸭、鸽子、马、驴、鹅、兔、鼠11种肉类的扩增的通用引物COI-A,对PCR扩增条件进行优化,并建立18个掺假模式,对低经济价值肉类（猪、鸡、鸭、马、驴、鼠）的掺入的最低比例进行考察。结果表明:11种熟肉的DNA经通用引物COI-A扩增后,其扩增效率均为100%,18个掺假模式中,牛肉和羊肉中掺入6种低经济价值肉类的最低检出比例为5%,而掺入鸡肉的最低检出比例为10%,而鹅肉、鸽子肉和兔肉的掺假模式中最低检出比例为10%;利用本方法检测30批次市售样品,发现有18批次的熟肉制品存在掺假情况。该方法前处理简单,灵敏度合适,重现性好,可作为高经济价值熟肉制品中掺假低经济价值肉类的有效检测方法。     

可视化LAMP检测常见肉制品中猪肉成分

根据GenBank中公布的猪线粒体色素细胞b基因序列设计6 条特异性环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）引物,通过简化线粒体DNA提取步骤,优化反应体系,以常见的牛、羊、鸡、鸭、马、驴肉为阴性对照验证该方法的特异性,掺假率梯度稀释以验证该LAMP法的最低检测限,建立常见肉制品中猪肉成分的可视化LAMP检测方法。结果表明：该方法提取目的基因操作简单、稳定,该可视化LAMP检测法以4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚钠盐为指示剂,能准确检测出常见肉类中猪肉是否掺杂,检测结果肉眼可见,灵敏度为10 pg/μL。