环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测椰毒假单胞菌的方法.根据公布的椰毒假单胞菌16S～23SrRNA基因序列设计引物,建立了LAMP反应体系,在此基础上检测了蜡样芽孢杆菌菌液和人工污染蜡样芽孢杆菌的银耳样品,并将LAMP法与PCR法进行比较.结果表明,LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,椰毒假单胞菌的检出限为5.4CFU/mL,是PCR方法检测灵敏度的1000倍,人工污染银耳样品中的椰毒假单胞菌的检出限为76CFU/g,样品中椰毒假单胞菌的检测过程(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2h内完成,因此LAMP可以简便快速有效地检测食品中的椰毒假单胞菌.     

基于环介导等温扩增技术的产呕吐毒素 蜡样芽胞杆菌特异性检测

本研究旨在建立食品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的快速检测方法。基于产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌合成酶基因cesB靶基因,设计4条特异性引物(2条内引物、2条外引物),建立环介导等温扩增技术(LAMP)。然后采用2株产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌、19株蜡样芽胞杆菌和41株非蜡样芽胞杆菌验证了该LAMP具有很好的特异性。LAMP检测的灵敏度在DNA水平上达到1.49 pg/μL,纯菌的灵敏度为5×10~3 cfu/mL。人工污染米饭样品,当起始污染量为2 cfu/g时,37℃增菌培养6 h,用试剂盒法和煮沸法提取的DNA,都可以检出产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌。采用此LAMP方法进行了72份实际样品的检测,检出2份产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌阳性样品,与传统方法一致。因此,本研究建立的LAMP检测方法可应用于食品中产呕吐毒素蜡样芽胞杆菌的快速特异检测。     

实时荧光环介导等温扩增技术检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌

建立牛乳中蜡样芽孢杆菌便捷可靠的检测方法,根据已公布的蜡样芽孢杆菌hblA基因序列设计内外引物,并向反应体系中加入荧光染料SYBRGreen Ⅰ,利用实时荧光监测仪,建立实时荧光环介导等温扩增技术（real-timefluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp）检测蜡样芽孢杆菌的方法,扩增产物经电泳和酶切鉴定。通过21 株致病菌验证RealAmp特异性,并比较了RealAmp与普通环介导等温扩增技术的敏感性,对人工污染的检出限进行了测定。结果表明对21 株致病菌进行特异性实验,4 株蜡样芽胞杆菌呈阳性结果,17 株非蜡样芽胞杆菌均呈阴性结果。RealAmp检测纯菌的灵敏度为8.2 CFU/mL,比普通环介导等温扩增技术的灵敏度高10 倍,人工污染牛乳RealAmp的检出限为8.2 CFU/mL。并且在20 min左右即可判定结果。该方法快速、准确、灵敏度高、操作便捷、可实时监控检测蜡样芽孢杆菌,有望成为快速检测蜡样芽孢杆菌的有效方法。     

免疫磁珠——环介导等温扩增快速检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因tetL

建立了免疫磁珠分离（IMS）结合环介导等温扩增（LAMP）检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因tet L的方法。结果表明：经优化后,每微克链霉亲和素纳米磁珠与375 ng生物素标记的芽孢杆菌抗体偶联,在含有1×103 CFU/mL耐四环素蜡样芽孢杆菌的巴氏杀菌乳中,25μL免疫磁珠孵育1 h后,对蜡样芽孢杆菌BA117的捕获率为68.1%。该IMS-LAMP方法特异性高,2 h内对巴氏杀菌乳中耐四环素蜡样芽孢杆菌的检测灵敏度为24 CFU/mL。IMS-LAMP方法具有用时短,灵敏度高,操作简单等优点,可以有效检测巴氏杀菌乳中蜡样芽孢杆菌的四环素耐药基因。     

环介导等温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的研究

采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)。以小肠结肠炎耶尔森氏菌(AY004311.1)Ail基因序列作为靶序列,设计内、外引物,通过肉眼观察沉淀判断检测结果。结果表明:LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度为6.3cfu/mL,人工污染鸡肉的检出限为340cfu/g。PCR检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度为630cfu/mL,人工污染鸡肉的检出限为3.4×104cfu/g。采用试剂盒法提取DNA,从样品处理到报告结果,LAMP方法耗时2h,PCR方法耗时3h。因此,LAMP检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的灵敏度高,耗时短,特异性好,操作简便,无需特殊的仪器设备,适合在我国广大基层实验室开展应用,为快速检测食源性致病菌构建了一个新的技术平台。     

3种常见食源性致病菌多重重组酶聚合酶扩增检测方法研究

目的建立了食品中沙门菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽胞杆菌多重重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification,RPA）快速检测方法。方法选择沙门菌invA基因、单增李斯特菌hlyA基因和蜡样芽孢杆菌16S RNA序列为目标基因进行扩增,建立并优化多重RPA扩增体系和扩增条件;评价反应体系的特异性和灵敏度,并对人工污染食品样品和实际样品进行检测。结果多重RPA反应体系能够在20 min完成三种目标基因的扩增,特异性强;对沙门菌、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的灵敏度分别为2.70×105、1.30×105、1.44×104 CFU/mL;能够用于人工污染样品和实际样品的检测。结论本研究建立的多重RPA等温扩增方法特异性强,操作快速、简单,为食源性致病菌的快速检测提供新方向     

环介导等温扩增技术快速检测产气荚膜梭菌的研究

目的:建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测产气荚膜梭菌的方法。方法:以产气荚膜梭菌(ATCC13124)的α毒素全基因序列为保守序列,设计内、外、环引物,肉眼观察白色沉淀并判断检测结果。结果:LAMP检测产气荚膜梭菌的灵敏度为2.92×102CFU/mL,人工污染产气荚膜梭菌的全脂乳的检测限为15.7CFU/mL,耗时仅1h。对照PCR检测产气荚膜梭菌的灵敏度为2.92×105CFU/mL,人工污染产气荚膜梭菌的全脂乳的检出限1.57×105CFU/mL。采用同样的方法提取DNA,耗时3h。结论:建立LAMP快速、特异检测产气荚膜梭菌的方法,该方法灵敏度是PCR的1000倍,为食品中产气荚膜梭菌的检测构建了一个技术平台。     

多重PCR快速检测婴幼儿奶粉中的病原菌

为了建立同时检测婴幼儿奶粉中阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌的多重PCR方法,根据阪崎肠杆菌ompA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡样芽孢杆菌hblA基因分别设计3对引物进行多重PCR扩增,并对反应条件进行优化。结果多重PCR扩增出长度为514、156、235bp的特异性目的条带。不增菌的情况下,多重PCR同时检测3种病原菌的灵敏度是103cfu/mL,3种病原菌在奶粉中的检出限是104cfu/g。建立的多重PCR反应准确、快速、高效,为同时检测婴幼儿奶粉中的阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌提供了新方法。     

传统发酵豆制品中3种致病菌的三重荧光PCR快速检测方法的建立

为了建立传统发酵豆制品中单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的三重荧光PCR快速检测方法。以单增李斯特菌hly A基因、蜡样芽孢杆菌Cereolysin AB基因和金黄色葡萄球菌nuc基因为靶基因设计引物与TaqMan探针,通过优化PCR反应体系,建立了可同时检测单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的三重荧光定量PCR体系,并进行了特异性和敏感性试验。结果显示,该方法灵敏度高,特异性强,重复性好。对26株非目标菌进行检测,结果均为阴性,而定量检测批内和批间的变异系数均小于2%。单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌敏感性试验结果表明,这三种细菌的最低检测浓度分别为3×103cfu/mL、2×104cfu/mL、2×104cfu/mL。应用该方法可在8h内完成对样品中单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的同步检测。     

环介导等温扩增法快速检测乳中阪崎肠杆菌

利用环介导等温扩增方法的快速、简便等优点,建立一种检测乳中阪崎肠杆菌的方法.以阪崎肠杆菌的OmpA序列为靶基因,设计特异性引物.优化并建立LAMP检测乳中阪崎肠杆菌的方法.结果表明,LAMP检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度为3.7×101cfu/mL,其灵敏度是PCR方法的10倍.人工污染阪崎肠杆菌灭菌乳的检测限为4.3×101 cfu/mL.对23株致病菌进行特异性实验,特异性良好.该方法具有特异性强、灵敏度高、设备简便、耗时短等优点,在食品检测中具有良好的应用前景.