基于蔗糖代谢途径分析保加利亚乳杆菌的后酸化性能

弱后酸化能力是乳酸菌作为发酵剂使用时的重要特性。为研究保加利亚乳杆菌蔗糖代谢途径对发酵乳后酸化起到的作用，该研究比较了五株保加利亚乳杆菌的后酸化性能，分析了保加利亚乳杆菌的生长情况、糖代谢和产酸能力，探究了蔗糖代谢产酸相关基因的差异表达及关键酶活性，并研究了外源添加蔗糖代谢关键酶前后保加利亚乳杆菌的生长情况。结果表明，Lb. 1后酸化能力最弱，在以蔗糖为碳源的培养基中生长缓慢，KLDS 1.0207后酸化能力最强。发酵24 h后，二者蔗糖转化率分别为5.85%和85.39%，乳酸含量分别为1.13 g/L和11.81 g/L。在含双糖（乳糖:蔗糖=1:1.5）的MRS培养基中生长时，KLDS 1.0207蔗糖代谢途径中基因sacA、pgi、gap、pgk、ldh表达量极显著高于Lb. 1（P<0.01），KLDS 1.0207蔗糖酶活性显著高于Lb. 1（P<0.05），达到1.31 U/mg。在Lb. 1的蔗糖培养基中补充蔗糖酶后，OD600 nm增至原来的5倍。因此，蔗糖酶活性对保加利亚乳杆菌代谢蔗糖至关重要，编码蔗糖酶的sacA基因表达下调显著减弱蔗糖酶活性，菌株后酸化能力明显下降。     

风干肉中产脂肪酶瑞士乳杆菌TR13全基因组测序及序列分析

瑞士乳杆菌TR13是从自然风干羊肉中分离筛选到的1株产脂肪酶活性高的菌株,为能够更好地研究该菌株在羊肉发酵过程中的代谢机理和功能,采用PacBio Illumina HiSeq测序平台对细菌TR13进行完成图测序分析。结果表明,瑞士乳杆菌TR13基因组为1套环状无质粒分子,基因组序列总长度为2 172 224 bp,GC含量为36.82%。基因组中预测到2 536个编码基因,编码基因总长度为1 883 532 bp,平均长度为799.46 bp,平均密度为1.08个/kb,对应蛋白质平均序列长度为265 aa,占基因组百分比为86.71%。TR13菌株基因组中包含15个rRNA操纵子和63个tRNA。预测到可能的毒力基因75个,耐药基因150个。编码基因通过GO、COG和KEGG数据库的对比分析,完成了TR13菌株基因组基本功能注释和代谢通路基因信息注释,注释信息可为菌株应用研究提供一定理论依据。     

两株弱后酸化保加利亚乳杆菌发酵性能的研究

以实验室筛选出的后酸化能力最弱的两株保加利亚乳杆菌为出发菌,通过对产酸能力、后酸化特性、产香性能及发酵酸乳物性特性等发酵性能进行测定,以评估其是否具有发酵剂的潜能,旨在开发具有优良发酵特性且弱后酸化的酸奶发酵剂。结果表明:实验菌株KLDS1.1011和KLDS1.1006的产酸能力稍差,但在凝乳24h后酸度大于70°T,达到GB19302-2010对酸乳的要求。KLDS1.1011发酵的酸乳在4℃和20℃下储藏21d发生的后酸化程度仍很低,乳清排出少,酸乳质构最好,乙醛产量较高,具有极大的开发潜能。     

保加利亚乳杆菌产酸关键酶的研究

以四株德氏乳杆菌保加利亚亚种为出发菌株,详细比较了四株菌产酸关键酶酶活的差异,从而找出菌株KLDS 1.1006和KLDS 1.1011后酸化较弱的主要原因及控制其产酸的关键酶.结果表明,H+-ATPase可以控制菌株的能量代谢,是产酸关键酶;β-半乳糖苷酶对于分解乳糖产酸的贡献非常大,是乳糖代谢关键酶;乳酸脱氢酶和蛋白酶与后发酵产酸过程并没有必然联系;H+-ATPase和β-半乳糖苷酶酶活性较弱是引起菌株KLDS1.1006和KLDS1.1011后酸化程度弱的根本原因.     

弱后酸化保加利亚乳杆菌突变株与亲本菌株H+-ATPase基因的相似性比较

为了确定德氏乳杆菌保加利亚亚种H+-ATPase的调控机制,以H+-ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变菌株和亲本菌株KLDS1.9201作为研究对象.首先分别提取亲本和突变菌株的基因组DNA,随后利用PCR的方法扩增出H+-ATPase蛋白的全部编码基因并测序,最后利用DNAMAN软件比较亲本和突变菌株的H+-ATPase的相似性.结果表明亲本和突变菌株H+-ATPase编码基因的相似性为100％.H+-ATPase缺陷的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变菌株KLDS1.9201-11和亲本菌株KLDS1.9201的H+-ATPase活力之间的差异并不是由于编码基因发生了突变,可能是转录水平的降低导致H+-ATPase酶蛋白的表达量降低,进而影响酶活力.为进一步研究德氏乳杆菌保加利亚亚种H+-ATPase的调控机制奠定了基础.     

弱后酸化保加利亚乳杆菌突变菌株的遗传稳定性研究

对从传统乳制品中筛选得到的德氏乳杆菌保加利亚亚种自发突变株KLDS 1.9201-4的遗传稳定性进行研究。将突变菌株进行连续传代,观察形态学变化,利用HPLC分析葡萄糖和乳酸的代谢情况,RAPD分析基因组DNA的稳定性。结果表明,突变菌株KLDS1.9201-4能够稳定遗传至第8代,在传代过程中菌落和菌体特征没有发生明显变化,KLDS 1.9201-4对初始葡萄糖的代谢率逐渐升高,终产物中乳酸的浓度也逐渐升高。KLDS 1.9201-4的基因组DNA相对稳定,没有发生明显变异。弱后酸化德氏乳杆菌保加利亚亚种的自发突变株KLDS 1.9201-4具有适宜的遗传稳定性,可被用于制作弱后酸化的酸奶发酵剂。     

不同生长阶段保加利亚乳杆菌关键蛋白酶基因表达变化规律

乳酸菌自身不能直接利用外源蛋白质,必须通过蛋白水解体系水解外源蛋白质,生成供菌体正常生长需要的短肽和游离氨基酸。该研究选择6株保加利亚乳杆菌(KLDS1.0207、1.0501、1.1007、1.9201、1.9203、1.0208)进行脱脂乳发酵,在mRNA转录水平上,应用实时荧光定量PCR技术,探讨保加利亚乳杆菌的蛋白水解体系中关键蛋白酶基因(prtB、oppD、pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)在菌体不同生长阶段表达的动态变化。结果表明,所有菌株生长曲线均呈S型。随着菌体在脱脂乳中的不断生长,蛋白水解活力极显著增强(P<0.01),7个目的基因相对表达量呈现总体上调。6株菌的prtB和oppD基因在对数期的相对表达量极显著高于对照组(4h)(P<0.01)。对数期的胞内肽酶基因(pepC、pepF、pepQ、pepX、pepT)的表达量与对照组(4 h)相比,呈极显著上调(P<0.01),但菌株KLDS 1.0207的pepQ基因在对数期下调,而稳定期上调。由此可见,蛋白水解活力较高的菌株,其生长和产酸特性也较高;发现在脱脂乳中培养保加利亚乳杆菌,其关键蛋白酶基因的表达量呈时间依赖性,且菌株间各蛋白酶基因表达量有较大差异。     

基于基因组学分析嗜热链球菌KLDS SM的蛋白质水解系统和氨基酸合成途径

为从遗传水平上探究嗜热链球菌KLDS SM蛋白质水解和氨基酸合成的能力,首先基于Illumina Hiseq 2500与Pacbio RSII测序平台对嗜热链球菌KLDS SM进行全基因组测序并绘制基因组图谱;随后从胞外蛋白酶、转运系统、胞内肽酶以及氨基酸合成等方面所涉及的基因进行生物信息学分析;最后对15?株已完成全基因组测序的嗜热链球菌的氨基酸合成能力进行比较基因组学研究。结果表明：菌株KLDS?SM的基因组由一个1?856?787?bp环状染色体组成,GC含量为39.08%,含有1?732?个蛋白质编码基因;菌株KLDS?SM具有完整的蛋白水解系统和8?种氨基酸的合成能力;15?株嗜热链球菌在氨基酸合成方面上相对保守,仅在组氨酸合成途径存在较大的差异。本研究为该菌株氮代谢能力的挖掘提供了理论依据,并在将其开发为发酵剂方面上具有一定指导意义。     

不同来源植物乳杆菌基因组的比较分析

目的 对分离自母乳、婴儿肠道的植物乳杆菌进行全基因组测序,分析菌株间亲缘关系和细菌素合成相关基因。方法 本研究采用Illumina高通量测序平台对不同来源的植物乳杆菌进行全基因组测序,质控过滤后的数据经Unicycler组装获得基因组精细图,通过比对COG、CAZy数据库对功能基因进注释,并借助BAGEL4等生物信息学分析工具鉴别植物乳杆菌素合成相关的基因簇,分析不同来源植物乳杆菌的益生潜力。结果 本研究5株植物乳杆菌基因组平均GC含量为44 %,母乳源植物乳杆菌基因数量多于婴儿肠道源菌株。进化树和ANI分析结果显示,分离所得菌株具有较高的同源性,相同来源的菌株更倾向于聚类到一个分支。功能注释结果显示,母乳源菌株与肠道源菌株相比拥有更多编码碳水化合物代谢的基因,且拥有完整的产植物乳杆菌素基因簇。结论 植物乳杆菌基因组GC含量、功能基因数目及产细菌素基因簇结构等与分离源有一定的关联,母乳源植物乳杆菌更适于作为潜在益生菌的候选菌株,本研究为益生菌的益生潜力研究提供了遗传学基础。     

酸冷胁迫下保加利亚乳杆菌定量PCR内参基因的筛选

实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确等优点,被广泛应用于目的基因表达的定量分析,而筛选表达水平稳定的内参基因是提高qRT-PCR结果准确性的重要前提。保加利亚乳杆菌既是酸奶发酵剂的常用菌种,又是引起酸奶后酸化的主要菌种。为了筛选保加利亚乳杆菌后酸化相关功能基因表达分析的qRT-PCR内参基因,以保加利亚乳杆菌的模式菌株ATCC 11842为试验菌株,根据前期ATCC11842菌株在后酸化不同条件下转录组学测序结果,选择5个候选内参基因（16SrRNA、rpoB、ldh、rodA、recA）,通过qRT-PCR技术研究候选内参基因在酸胁迫和酸冷胁迫下的表达量水平,即Ct值变化。采用3款软件geNorm、NormFinder和Bestkeeper分析比较候选内参基因在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的表达稳定性,并筛选获得qRT-PCR的最适内参基因。运用筛选到的最适内参基因,分析ATCC 11842菌株的3个目的基因（poxI、Ldb1301、dnaJ）在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的相对表达量,验证筛选的内参基因的可靠性。结果表明：同一候选内参基因Ct值在酸胁迫和酸冷胁迫下,rpoB和recA表达量变化最小。比较3个软件分析结果,一致得出：rpoB和recA是在酸胁迫和酸冷胁迫下表达最稳定的2个基因,即筛选出的qRT-PCR最适内参基因为rpoB和recA;3个目的基因（poxI、Ldb1301、dnaJ）在酸胁迫和酸冷胁迫下qRT-PCR的相对表达量的分析结果与前期转录组学测序结果一致,进一步证实本研究筛选的2个内参基因rpoB和recA的可靠性。本文为利用qRT-PCR技术研究保加利亚乳杆菌后酸化功能基因表达以及揭示后酸化机制及定向选育弱后酸化菌株提供了依据;也为采用qRT-PCR技术研究其它益生乳酸菌引起酸奶后酸化或不同条件下功能基因表达提供借鉴。     

基于基因水平研究乳酸乳球菌的有氧呼吸代谢

本研究旨在对能和不能有氧呼吸代谢的乳酸乳球菌呼吸链基因同源性和细胞色素氧化酶活力进行分析,为确定乳酸乳球菌的有氧呼吸必要条件奠定基础。首先,分别测定已筛选到的菌株KLDS4.0325和KLDS4.1102在发酵和有氧呼吸代谢时的生长曲线;其次,提取KLDS4.1102的基因组DNA,随后利用PCR扩增其呼吸链编码基因并进行DNA测序;最后,从Gen Bank数据库下载KLDS4.0325的呼吸链编码基因序列,利用DNAMAN软件比较这两株菌呼吸链编码基因的同源性,并测定这两株菌的细胞色素氧化酶活性。结果表明在有氧呼吸条件下KLDS4.0325的生物量和p H都显著增大,而KLDS4.1102在两种条件下呈现一致的生长趋势,呼吸链编码基因的同源性分析显示KLDS4.1102具备完整的呼吸链,而酶活测定结果却显示KLDS4.1102无细胞色素氧化酶活性,这表明KLDS4.1102不能进行有氧呼吸代谢不是由于编码基因缺陷造成的,可能是某些编码基因不能正常表达,导致其细胞色素氧化酶不能正常发挥作用。     

优选保加利亚乳杆菌发酵特性的测定

对实验室研究较为成熟的4株保加利亚乳杆菌进行发酵产酸、后酸化测定,同时对单菌株发酵、与嗜热链球菌组合发酵制备的酸奶进行质构测定和感官评价,旨为菌株开发成直投式酸奶发酵提供基础。     

低能N+注入诱变选育弱后酸化保加利亚乳杆菌

为获得弱后酸化保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）,采用低能N+注入技术对保加利亚乳杆菌DL1进行诱变,经中间培养后用青霉素进行筛选。结果表明,在注入能量为25 keV、注入剂量为1.5×1015 ions/cm2的条件下进行诱变,并用2.0 mg/mL青霉素处理2 h后,通过筛选最终得到一株后酸化较弱的突变菌株DL1-3。与出发菌株DL1相比,突变菌株DL1-3在25 ℃条件下贮藏后,后酸化程度降低18.8%,且在42 ℃条件下发酵脱脂乳的产酸能力差异较小,并可稳定遗传。     

发酵乳中乳酸菌的分离鉴定及优良菌株的筛选

从市售发酵乳中分离鉴定出保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌,对其进行凝乳情况的考察和产酸能力、后酸化能力、产香能力、产黏能力、分解蛋白质能力及保健功能的测试,各筛出一株优良菌株,拟定在后续试验中按一定比例作进一步的应用研究,以期制备高效复合菌株发酵剂。本试验可为实际生产中发酵乳优良菌株的筛选提供理论依据。     

发酵剂的筛选及其对搅拌型酸奶理化特性的影响

通过调查单菌株发酵特性、球菌/杆菌比例的选择、菌株复配后的性能,得到了4组优化的发酵剂配方。在不添加任何增稠剂的条件下,其发酵的酸奶在28d货架期内质构、后酸化程度表现优异且稳定。此外,为了预测酸奶货架期后酸化程度的强弱,比较了15组28d储存期实验与加速实验中所得的pH值及其变化趋势。结果表明,加速试验中趋于定值时的pH值可以作为判断后酸化程度强弱的先行指标。     

酸奶菌株分批发酵放大研究-从2.5L 到15L 发酵罐

2.5L发酵罐实验数据基础上,利用经验放大法将德氏乳杆菌保加利亚亚种KLDS 1.9201和唾液链球菌嗜热亚种KLDS 3.021 分批发酵结果从小试放大中试。结果表明,如果确定若干优化发酵参数,包括搅拌转速50～100r/min和溶氧浓度不高于5% 等,可将酸奶菌株发酵结果较成功地从2.5L 罐放大到15L 罐规模。KLDS 1.9201 在15L 罐中对数生长期间的初糖转化率达到了80.3%,乳酸浓度为49g/L,确定其发酵终点为12h,此时活菌数为2.2 × 109CFU/ml;KLDS 3.0201 在15L 罐中的初糖转化率达到了80.2%,乳酸浓度为39g/L,确定其最佳收获期为发酵8h,活菌数达到4.9 × 109CFU/ml。