黑曲霉糖化酶基因在荧光假单胞菌中的表达

黑曲霉糖化酶基因cDNA按正确的读码框架克隆到广宿主表达载体pBBR1MCS-2,构建出含黑曲霉糖化酶基因的表达载体pBBR1MCS-2GA,用三亲和接合转化法将重组质粒导入2-酮基-D-葡萄糖酸高产菌株荧光假单胞菌AR4。得到重组菌ARW4,经SDS-PAGE凝胶电泳和Westernblot分析显示,黑曲霉糖化酶基因在ARW4中得到表达,表达产物主要以不溶性包涵体形式存在。     

根癌农杆菌介导酸性蛋白酶在泡盛曲霉中表达的研究

利用Gateway克隆技术快速构建丝状真菌表达载体,以米曲霉α-淀粉酶A启动子(amyB)、α-糖苷酶终止子(agdA)及黑曲霉酸性蛋白酶基因(pepA)分别构建入门载体,以带有潮霉素抗性标记(hygB)的农杆菌双元载体pHGW为目的载体,通过LR连接反应,构建根癌农杆菌介导丝状真菌重组表达载体pHGW-apA。转化泡盛曲霉宿主菌,筛选的转化子经传代培养确定其遗传稳定性,PCR及测序分析表明,hygB和目的基因pepA整合到了泡盛曲霉基因组。转录水平上的RealTime-PCR定量分析、表达水平上的Western Blotting分析以及培养液酶活分析表明酸性蛋白酶基因pepA在泡盛曲霉中得到正确表达。为丝状真菌表达载体快速构建与外源基因在丝状真菌中快速表达提供了可行的方法。     

土壤杆菌重组合成透明质酸

透明质酸(hyaluronan,HA)是β1-3 D-N-乙酰氨基葡糖(GlcNAc)和β1-4 D-葡糖醛酸(GlcA)二糖重复单位组成的糖聚合物.HA在生物医学领域中具有广泛应用,如应用于眼科手术和骨关节炎治疗等.到目前为止,商品化HA仅来源于鸡冠提取或病原性链球菌发酵.本研究证实采用代谢工程技术可通过安全微生物重组合成HA.土壤杆菌(Agrobacterium sp.)ATCC 31749是一种食品聚合物凝胶多糖(curdlan)的商业化生产菌株.已成功开发出一种广谱宿主性表达载体,这种载体可表达多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的3 kb HA合酶基因和大肠杆菌(Escherichia coli)K5菌株的编码UDP-葡糖脱氢酶的kfiD基因.这两种异源酶的共表达使土壤杆菌合成HA成为可能.     

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素脱氢酶(Pds)是番茄红素合成的关键酶,本研究通过PCR 法获取pds 基因和E8 启动子序列,将目的基因和E8 启动子序列构建到植物表达载体pMD1 中,构建了含果实特异表达启动子的pds 基因的植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明：番茄果实特异性表达pds 的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105 中,为下一步pds 在番茄果实中特异表达奠定了基础。     

人甲胎蛋白 AFP 在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

枯草芽孢杆菌纤维素酶基因整合载体的构建

目的:以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为宿主,构建纤维素酶基因整合表达载体,获得能够表达纤维素酶并且降解纤维素的工程菌。方法:通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)从B.subtilis LN基因组中克隆同源片段M1、M2基因片段,以质粒pGEM-T为载体,将同源片段M1、M2、启动子P43和葡萄糖苷酶基因CelKg连接在一起构建整合载体pGEM-Kmpgmt,并采用双交换同源重组的方式将其转化进入B.subtilis LN基因组中。结果:通过PCR和双酶切验证整合载体构建完成,并成功整合到野生型B.subtilis LN中,获得重组菌B.subtilis Kpg。刚果红染色结果显示重组菌对羧甲基纤维素钠有降解作用。改良培养基37℃条件下摇瓶培养,重组菌B.subtilis Kpg生长至18 h时上清液中纤维素酶活力比野生型B.subtilis LN提高了115%。     

黄杆菌肝素酶I基因的克隆与表达

目的克隆并表达黄杆菌肝素酶I(HepI)基因。方法通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增黄杆菌HepI基因,验证后插入到表达质粒pET-22b中构建表达载体,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白质表达,并用Azure A法测定酶活性。结果PCR扩增得到序列正确的HepI基因,并将该基因成功插入到pET-22b表达载体中。重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达的蛋白质经SDS-PAGE分析,与目的蛋白质的相对分子质量基本一致,其活性约为50 U/LA600。结论克隆并成功表达了黄杆菌HepI基因。     

重组牛凝乳酶基因在Bacillus megaterium WH320中的表达及其酶学性质研究

对牛凝乳酶基因进行密码子优化,并首次在高效表达宿主巨大芽孢杆菌中表达。通过克隆牛凝乳酶基因,将片段与穿梭质粒pHIS1525连接,连接产物转化大肠杆菌XL-10,筛选出阳性克隆子,所获重组质粒经酶切、测序鉴定,证实含目的片段。通过原生质体转化的方法转化到表达宿主巨大芽孢杆菌WH320。用木糖诱导表达,离心取上清经镍柱亲和层析(Ni-NTA)和聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离纯化并鉴定,测定重组牛凝乳酶的酶学性质,表明在巨大芽孢杆菌中得到有效表达。为我国利用生物工程技术的方法自主生产凝乳酶提供了基础。。     

葡萄糖氧化酶基因在黑曲霉中的分泌表达

通过PCR扩增从一株葡萄糖氧化酶生产菌黑曲霉中克隆得到1818bp葡萄糖氧化酶基因GOD,将GOD基因与糖化酶基因的5’同源臂、3’同源臂进行重叠延伸,构建葡萄糖氧化酶基因的表达框。将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-GOD。将载体pSZH-GOD通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉。经潮霉素筛选和PCR鉴定获得8株重组菌株。对8株重组菌株的发酵液上清液进行酶活测定,结果表明葡萄糖氧化酶基因在高产糖化酶的黑曲霉中得到了分泌表达,静置培养6d后其分泌表达的葡萄糖氧化酶酶活最高可达1.166U/mL,而在出发菌株中检测不到葡萄糖氧化酶的分泌表达。同时,重组菌株胞内表达的葡萄糖氧化酶最高酶活可达11.45U/mL,是出发菌株的266倍。此研究结果为简化葡萄糖氧化酶发酵生产工艺、提高酶产量提供了新的途径。     

人甲胎蛋白AFP在大肠杆菌中表达和鉴定

本研究通过应用基因工程技术,重组构建编码人全长甲胎蛋白AFP基因的原核表达载体pET22b-AFP,并将其转化到大肠杆菌宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达目的蛋白AFP。采用PCR法扩增编码AFP蛋白的cDNA序列片段,并将其克隆到含有His-tag的pET22b原核表达载体上;重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达;对诱导过程中不同浓度的IPTG和不同的温度进行优化;选定最佳的优化条件进行诱导表达目的蛋白;SDS-PAGE电泳和Western Blot法鉴定表达产物。结果表明,通过PCR扩增技术获得了编码AFP蛋白的基因片段;重组质粒经双酶切和基因测序等方法鉴定后,确认了重组质粒已经构建成功;表达产物通过利用SDS-PAGE和Western Blot法检测到在66 kDa附近出现条带,与预期值相符,表明重组AFP蛋白已成功表达。     

利用TAIL-PCR克隆Gluconobacter suboxydans葡萄糖脱氢酶基因及其生物信息学分析

以Gluconobacter suboxydans J菌株基因组DNA为模板,基于吡咯喹啉醌附着位点的保守区域设计引物,通过交错式热不对称PCR获得编码葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase,GDH）的全长基因（gdh）,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：gdh基因全长2 268 bp,编码755个氨基酸,其蛋白序列与Gluconobacter属的GDH具有较高的同源性。GDH的分子质量约为81.72 ku,pI值约为5.14;GDH蛋白的二级结构由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的无规则卷曲3种结构模块组成;GDH N末端的AA 1～140区域有5个跨膜结构域。     

克氏担孢酵母脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

以克氏担孢酵母V3脂肪酶基因为研究对象,构建毕赤酵母稳定的高效表达系统。采用同源克隆法从克氏担孢酵母V3中获得一个脂肪酶基因,并将其构建到表达载体pPICZαA,转入毕赤酵母X33中,成功实现了克氏担孢酵母V3脂肪酶基因在毕赤酵母X33中的表达。重组工程菌摇瓶培养120 h后,酶活力可达18 U/mL。重组酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为5.0。1 mmol/L的Mg2+、K+和Na+以及质量浓度为1 g/100 mL的曲通-100、吐温-80、吐温-20对重组KLIP具有激活作用。重组酶的最适底物为三硬脂酸甘油酯（C18）。     

酿酒酵母APA1的定点突变以及与增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的共表达

应用基因突变技术向酿酒酵母APA1基因中引入同义突变,为进一步研究APA1表达量与酿酒酵母硫化氢产量的关系提供实验基础。从酿酒酵母S288c中利用聚合酶链式反应扩增APA1基因,与EGFP基因融合构建表达载体。以该载体为模板,通过一步法点突变技术向APA1基因中分别引入APA1-1/2/3/4 4 个突变。测序结果表明突变位点与预期结果一致。成功获得了APA1的4 个同义突变。一步法点突变技术是一种高效的定点突变方法。分别转化酿酒酵母YS59,荧光显微镜下可见绿色激发荧光,表明APA1-1/2/3/4与EGFP基因共表达。     

杂合抗菌肽MgJ基因在毕赤酵母中表达条件的优化

为确定杂合抗菌肽MgJ基因的最佳诱导表达条件,将构建好的重组表达载体pPICZαA-MgJ经SacⅠ线性化处理,电转入巴斯德毕赤酵母GS115,利用抗生素Zeocin筛选阳性克隆,聚合酶链式反应（polymerase chainreaction,PCR）扩增验证,甲醇诱导表达。优化杂合抗菌肽MgJ诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、初始菌体浓度表达条件。结果表明杂合抗菌肽MgJ的最佳表达条件为：28 ℃、250 r/min诱导培养,每24 h添加体积分数0.5%的甲醇,诱导时间120 h,MgJ表达量可达11.9 mg/L。纯化后获得的表达产物MgJ对S. aureus ATCC 29213有较好的抑菌活性,最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）为10 μg/mL。     

乳酸片球菌素PA-1在大肠杆菌中的表达与纯化

为了实现该细菌素的外源表达,本实验首先利用聚合酶链式反应从乳酸片球菌PAF中扩增出乳酸片球菌素PA-1的结构和免疫基因,然后克隆到表达载体pGEX-6p-1,构建了N端含有GST-His-DDDDK标签的重组质粒pGEX/his-pedAB,然后转化进入大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷诱导,重组乳酸片球菌素PA-1在大肠杆菌胞内成功表达。表达的融合蛋白先经过镍亲合层析柱纯化,然后注入谷胱甘肽S-转移酶亲和色谱柱用肠激酶处理,释放出成熟的乳酸片球菌素PA-1。利用高效液相色谱和质谱技术检测乳酸片球菌素PA-1纯度。以单核细胞增生李斯特氏菌CMCC54004为指示菌,利用琼脂扩散法检验乳酸片球菌素PA-1活性。结果表明,携带GST-His-DDDDK标签的融合蛋白无活性,标签切除后其抑菌活性恢复,且其纯度达90%以上。     

α-淀粉酶在不同地衣芽孢杆菌宿主菌中分泌表达的对比分析

研究不同地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主菌对α-淀粉酶分泌表达的影响。以Bacillus subtilis的P43启动子,B.licheniformis WX-02α-淀粉酶基因的信号肽、编码区和终止子序列为表达原件,构建了α-淀粉酶分泌表达载体pP43SAT。将pP43SAT分别转入3株B.licheniformis宿主菌:WX-02(ΔamyL)、BL9和BL10,获得3株α-淀粉酶基因工程菌WX-02(ΔamyL,pP43SAT)、BL9(pP43SAT)和BL10(pP43SAT),并将构建的3株工程菌进行发酵对比分析。BL9(pP43SAT)和BL10(pP43SAT)的淀粉酶发酵活力分别达到94.01 U/mL和101.94 U/mL,比原始宿主菌WX-02(ΔamyL,pP43SAT)分别提高了21%和31%,这说明BL9和BL10新型宿主菌有利于淀粉酶的分泌表达。本研究证明多蛋白酶基因缺失可显著提高α-淀粉酶的表达,为α-淀粉酶的高效表达提供了新型宿主菌和新策略。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7变种Q蛋白对志贺毒素表达的影响

1株肠出血性大肠杆菌O157∶H7变种EC169菌株,携带stx基因但不表达志贺毒素。通过高效热不对称交错聚合酶链式反应（high-efficiency thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction,hiTAIL-PCR）hiTAILPCR扩增得到EC169 stx1及其上游核苷酸片段并克隆测序,结果表明：EC169 q基因与标准株sakai q基因相比存在6个SNP位点。通过PCR扩增O157∶H7高毒株EC150 q基因全长,并构建表达载体pkk223-q分别转化EC169和低毒株EC157。反转录荧光定量PCR实验结果表明,外源q基因在EC169和EC157重组菌中可高效表达,并引起EC157stx转录水平上调,但EC169重组菌stx转录水平不变。反向乳胶凝集实验结果亦证实EC157重组菌志贺毒素表达量提高,而EC169重组菌志贺毒素表达量不变。Q蛋白变异可能并非EC169志贺毒素不表达的主要原因。     

花生过敏原蛋白Ara h 6基因克隆和原核表达

本实验首先从花生中提取总RNA,利用反转录聚合酶链式反应技术克隆了花生过敏原蛋白Ara h 6全cDNA,并以此为模板扩增出Ara h 6目的基因。将目的基因与pMD19-T Simple质粒进行重组后转入BL21（DE3）宿主表达菌中,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导产物表达,并利用镍离子亲和层析纯化表达产物。DNA测序结果显示Ara h 6基因片段全长为438 bp,编码145 个氨基酸,与已知该蛋白DNA序列97%相同;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示表达产物分子质量为24 kD,与融合组氨酸标签的重组Ara h 6蛋白理论分子质量相符;质谱鉴定结果表明重组蛋白的一级结构与天然Ara h 6匹配度为100%;Western blotting结果显示融合蛋白能够为抗Ara h 6多克隆抗体所识别,具有免疫原性。     

地皮菜中一种新型水应激蛋白基因的克隆表达及其抗人结肠癌细胞SW480的作用

利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增出地皮菜（Nostoc commune Vauch.）一种新型水应激蛋白（water stress protein,WSP）的基因（GenBank 序列号：KF003026）,连接到原核表达载体pET28a上,测序鉴定后转化入大肠杆菌BL21,获得一种新型水应激蛋白表达工程菌;经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达及镍离子亲和层析柱（Ni-NTA）纯化后,得到了带6×His标签、分子质量大小为40 kD的可溶性目的蛋白,称其为重组水应激蛋白1（recombinant water stress protein 1,Re-WSP1）。细胞增殖抑制实验结果表明,Re-WSP1蛋白可以抑制结肠癌细胞SW480的增殖,而对正常结肠上皮FHC细胞无明显作用;DAPI细胞核染色结果表明,该蛋白能够诱导SW480细胞凋亡小体的形成;Western blotting结果显示,Re-WSP1蛋白能够促进Procaspase-3和Procaspase-8的活化剪切。以上结果表明：Re-WSP1蛋白能够明显的抑制结肠癌SW480细胞的增殖,并可能通过Caspase依赖途径诱导SW480细胞凋亡。     

利用柿子皮混菌发酵制备果醋及品质分析

以柿子加工副产物柿子皮为主要原料,采用氧化葡萄糖酸杆菌、植物乳杆菌、明串珠菌发酵酿造果醋。通过单一菌种、多菌组合的发酵实验,以发酵时间和产品质量为指标,确定混合菌种发酵的最佳组合。采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术鉴定了最佳醋品的挥发性香气成分,采用反相高效液相色谱法测定了主要有机酸含量。结果表明：当V（氧化葡萄糖酸杆菌）∶V（植物乳杆菌）＝1∶1时,醋品品质最佳,发酵时间6 d,感官品评94.90 分,共鉴定出51 种挥发性香气成分,主要为醇类和酯类,有机酸中乳酸和乙酸为主要有机酸,柿香味和醋香浓郁、协调,口感佳,品质优。