5种食源性致病菌PCR检测方法的建立

目的建立食品中的沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌的PCR快速检测方法。方法以缓冲蛋白胨水为增菌培养基,采用直接提取法提取DNA并测定其核酸浓度。对PCR的退火温度、模板浓度进行优化,把5种目标菌分为两组进行检测分析,并进行特异性和灵敏度实验。结果 5种目标菌培养后均表现出良好的生长趋势。PCR扩增最佳退火温度为59℃, 5种目标菌的引物特异性好,方法的检测灵敏度高。沙门氏菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌最低检出核酸浓度分别为0.0202、0.158、0.187、2.30和1.05μg/mL。结论该方法简便、快速、灵敏度高,能满足食品安全检测要求。     

食品分析能力评估计划能力验证样品中大肠埃希氏菌O157:H7的分离鉴定及质量控制

目的从食品分析能力评估计划能力验证样品沙拉中分离、鉴定大肠埃希氏菌O157:H7,判断2份样品是否有检出。方法参照GB 4789.36-2016《食品安全国家标准食品微生物学大肠埃希氏菌O157:H7/NM》进行检测,将VITEK 2 compact生化结果符合的菌株进行O157和H7抗原血清学鉴定。结果样品编号M221d11B检出大肠埃希氏菌O157:H7,样品编号M221d11A未检出大肠埃希氏菌O157:H7。测试样品的背景干扰菌是成团泛菌和铜绿假单胞菌。结论取得满意的能力验证结果需要注意以下因素:培养基试剂的质量、样品之间的交叉污染、样品的正确复苏和制备、菌落特征的识别以及干扰菌株的排查等。     

三重荧光PCR检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7

目的 建立一种检验沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7的Taqman探针三重荧光PCR方法。方法 针对沙门氏菌属特异性invA基因、金黄色葡萄球菌rpoB基因、大肠埃希氏菌O157：H7 的rfbE基因设计引物与探针,建立三重荧光PCR体系,对引物与探针浓度及退火温度优化,并进行特异性和敏感性研究。结果 引物与探针的最优浓度组合为：invA 0.2μL、ropB 0.4μL、rfbE 0.5μL;最优退火温度为60℃。16株非目标菌株扩增结果为阴性;目标菌株均出现显著扩增。敏感性试验显示,三种微生物对应的能检出的最低菌体数量依次为：460CFU、76CFU、660CFU。结论 该方法特异性好、灵敏度高,能够快速检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7     

云南部分地区熟肉制品中食源性致病菌的污染情况及耐药性分析

目的了解云南省部分地区熟肉制品中食源性致病菌的污染情况及致病菌的耐药情况。方法 在云南省部分地区采集熟肉制品共115件,按照国标法对熟肉中的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7和致泻大肠埃希氏菌进行分离鉴定,利用微量肉汤稀释法对金黄色葡萄球菌进行12种抗生素的药敏试验。结果 云南省此六地州的熟肉制品中存在不同程度的污染,金黄色葡萄球菌污染最严重（19/115,16.5%）,沙门氏菌（1/115,0.8%）,大肠埃希氏菌O157:H7和致泻大肠埃希氏菌未检出。19株金黄色葡萄球菌药敏实验分析得出多重耐药率为21.1%。所有菌株对达托霉素敏感,对其余的抗生素都有不同程度的耐药,主要以耐青霉素（100%）和红霉素（68.4%）为主,沙门氏菌SM-054对6种抗生素耐药,耐药情况较严重。结论根据熟肉样品来源的不同,检出率也存在差异,夏季的农贸市场和饭馆中金黄色葡萄球菌的污染情况较严重,应采取有效的监管措施,同时加强管理抗生素的使用,确保熟肉制品的质量和安全性。     

熔解曲线结合RT-PCR在餐饮食品中对5种致病菌的检测

建立快速检测餐饮食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7及副溶血性弧菌5种致病菌的实时聚合酶链式反应体系(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)。通过增菌时间的比较,调整RT-PCR反映体系中的退火温度,建立5种致病菌相同的检测体系。试验结果表明,5个目标菌达到检测灵敏度的最短增菌时间范围为2 h～8 h,5种致病菌的试验灵敏度范围为7.4×10 CFU/mL～2.4×103CFU/mL。5种目标菌的熔解温度Tm值分别为沙门氏菌87.32℃,金黄色葡萄球菌79.57℃,单核增生李斯特氏菌82.02℃,大肠埃希氏菌O157:H7 82.24℃,副溶血性弧菌87.15℃。试验建立的RT-PCR快速检测反应体系,与常规微生物检测方法相比,有效地缩短了检测时间,且灵敏度与特异性均能满足检测要求。     

基于噬菌体特异性的新型荧光酶联方法检测食品中大肠埃希菌O157∶H7

目的对一种基于噬菌体特异性的检测食品中大肠埃希菌O157∶H7的新型荧光酶联方法(VIDASECPT)进行了评价。方法利用VIDASECPT、VIDASECO、BAXO157三种快速方法检测不同浓度大肠埃希菌O157∶H7标准菌株的生理盐水悬浮液,并对VIDASECPT和常规培养法检测食品中大肠埃希菌O157∶H7进行了比对。结果 VIDASECPT检测大肠埃希菌O157∶H7的检出限为104 CFU/ml,并且不受大肠埃希菌背景菌的干扰,其他两种快速方法的检出限均为105 CFU/ml,其中VIDASECO易受到背景菌的干扰;检测不同食品基质中大肠埃希菌O157∶H7,当大肠埃希菌O157∶H7的浓度为104 CFU/ml时,VIDASECPT与常规培养法无统计学差异。结论 VIDASECPT方法检测大肠埃希菌O157∶H7具有快速、灵敏、抗干扰性强的特点。     

3种食品致病菌实时荧光核酸恒温扩增试剂盒方法验证比对研究

目的以传统国标培养法作为参考比对方法,考察实时荧光核酸恒温扩增(simultaneous amplification and testing,SAT)食品检测试剂盒,在食品中检测食源性致病菌如志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7/NM、阪崎肠杆菌的一致性。方法以食品中志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157∶H7/NM和阪崎肠杆菌国标培养法为参考方法,以基因测序法作为确认法,考量SAT食品检测试剂盒方法的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率、准确度,同时进行2种方法的显著差异检验。结果 3种SAT食品检测试剂盒灵敏度均为100%,假阴性为0;特异性:志贺氏菌100%,阪崎肠杆菌100%,大肠埃希氏菌O157∶H7/NM 98.4%。大肠埃希氏菌O157∶H7/NM假阳性率为1.2%。结论 SAT试剂盒检测方法具有灵敏度高、特异性强、准确度高的优点,无一例漏检。     

ATP＋IMS 实现大肠埃希菌O157：H7快速检测

大肠埃希菌O157：H7属于大肠杆菌中的埃希菌属（Escherichia）,是一种致病菌。自1982年,美国发生首次由大肠埃希菌O157：H7引起的出血性肠炎以来,该菌在世界范围内曾多次暴发食源性疾病。目前,大肠埃希菌O157：H7已被认定为20世纪七十年代以来新发现的8种传染病病原体之一。近年来,其感染呈全球流行趋势,并已经成为人类健康的重要微生物威胁。     

3种食品致病菌实时荧光核酸恒温扩增试剂盒

目的 以传统国标培养法作为参考比对方法,考察实时荧光核酸恒温扩增(simultaneous amplification and testing, SAT)食品检测试剂盒,在食品中检测致病菌志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7/NM,以及阪崎肠杆菌的一致性。方法 以食品中志贺氏菌、大肠埃希氏菌O157：H7/NM和阪崎肠杆菌国标培养法为参考方法,以基因测序法作为确认法。,考量SAT食品检测试剂盒方法的灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率、准确度,同时进行2种方法的显著差检验。结果 3种SAT食品检测试剂盒灵敏度均为100%,假阴性为0;特异性志贺氏菌100%,阪崎肠杆菌100%,大肠埃希氏菌O157：H7/NM 98.4%。大肠埃希氏菌O157：H7/NM假阳性率为1.2%。结论 SAT试剂盒检测方法具有高灵敏度、特异性强、准确度高,无一例漏检。     

致病菌快速检测管联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法鉴定即食食品中的大肠埃希氏菌O157:H7

目的 建立基于致病菌快速检测管技术联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)快速、高效、准确鉴定即时食品中大肠埃希氏菌(Escherichia coli, E. coli) O157:H7的方法。方法 选取改良胰蛋白胨大豆肉汤(modified tryptone soya broth, mTSB)为初筛培养基, 制作出针对即时食品中E. coli O157:H7的致病菌快速检测管, 初筛阳性结果采用MALDI-TOF MS技术鉴定。结果 5株常见E. coli O157:H7菌株均能特异检出, 而其他非E. coli O157:H7均未检出, 灵敏度可达51 CFU/mL; 通过对人工污染样品和自然样品检测, 鉴定结果和GB 4789.36—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》方法完全一致, 且检测效率提高了30%。结论 两种技术联合应用建立的鉴定即时食品中E. coli O157:H7的新方法, 操作简便、成本低廉, 适合推广, 为快速、准确鉴定即时食品中E. coli O157:H7打开了新思路。     

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H7

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针, 合成基因片段绘制标准曲线, 在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后, 对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%; 基因组DNA检测敏感性为7.11×102 fg/μL; 纯培养物水平检测敏感性为1.0×102 CFU/mL; 重复性变异系数在0.10%~1.00%之间; 标准曲线相关系数r2为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法, 该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短, 仅为35 min的特点, 可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。     

2005-2007年我国食品中大肠埃希菌O157分离株tccP1基因的分布研究

目的 了解我国2005-2007年食源性疾病监测网分离的大肠埃希菌O157分离株中tccP1基因的分布情况及特点.方法 对89株食源性大肠埃希菌O157分离株运用PCR方法进行检测.结果 tccP1基因的阳性率为55.1%.结论 tccP1基因广泛存在于O157:H7大肠埃希菌中,在O157:非H7中检出率很低.其分布...     

侧向流动型重组酶聚合酶扩增技术检测食品中大肠埃希氏菌O157

研究内容基于侧向流动型重组酶聚合酶扩增(Lateral flow-based recombinase polymerase amplification,LF-RPA)技术原理,建立大肠埃希氏菌O157(Escherichia coli O157)的LF-RPA快速检测方法。应用该方法对3株大肠埃希氏菌O157和27株非大肠埃希氏菌O157进行检测,结果表明该方法具有良好的特异性。分别以10倍浓度梯度稀释插入靶基因序列的质粒pUC57-rfbE和大肠埃希氏菌O157菌液DNA作为模板进行LF-RPA检测。结果表明LF-RPA方法可检出1.0×10²拷贝/μL的pUC57-rfbE质粒和1.2×10⁴ cfu/mL的大肠埃希氏菌O157菌液。以大肠埃希氏菌O157污染食品样品,增菌4 h后,大肠埃希氏菌O157初始浓度为1.2×10¹ cfu/mL的食品增菌液可以被LF-RPA检出阳性信号。该研究建立的方法可快速、准确、灵敏地检测食品中大肠埃希氏菌O157,无需专业设备,在食品生产企业和基层检测机构具有一定的应用前景。     

出血性大肠埃希菌O157:H7可视化和实时荧光RPA检测方法的比较

目的 以检测出血性大肠埃希菌（EHEC）O157:H7为目的,基于重组酶聚合酶扩增（RPA）技术,分别建立可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法。方法 根据出血性大肠埃希菌O157:H7的rfbE基因设计引物和探针,进行特异性、灵敏度检测,建立实时荧光RPA检测方法。结合SYBR Green I在核酸反应中的颜色变化特征,设计可视化RPA检测方法。结果 建立的实时荧光RPA检测方法和可视化RPA检测方法,分别在35℃时反应不超过25 min即可检测EHEC O157:H7。设计的引物和探针仅对EHEC O157:H7出现特异性结果。两种检测方法的检测限低于10-5 ng/μL。结论 EHEC O157:H7的可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法操作简便,且特异性强、敏感性高,可为EHEC O157:H7的现场快速检测和实验室检测提供新方法。     

Taqman探针荧光PCR法检测食品中的大肠埃希氏菌O145

针对大肠埃希氏菌O145的O抗原基因簇的wck D基因的特异性序列设计引物和Taqman探针,建立检测大肠埃希氏菌O145的荧光PCR方法,对其灵敏度、特异性进行验证,并将其用于食品样品的检测。结果表明,本研究中的方法可实现对大肠埃希氏菌O145的特异性扩增,其它27株非O145大肠埃希氏菌和20株非大肠埃希氏菌细菌的菌株均无扩增;检测的灵敏度可达165拷贝/反应;339份食品样品EC肉汤增菌后用本荧光PCR法进行检测,检出大肠埃希氏菌O145阳性31份,阳性率为9.1%。实验结果表明,本研究成功建立了可用于食品中大肠埃希氏菌O145的Taqman探针荧光PCR方法,食品样品采用EC肉汤增菌24 h、热裂解法提取核酸,增菌后检测所需时间由至少3 d~7 d缩短为仅需2 h~3 h,食品检测全过程仅需约28 h,经证实本方法特异性强、操作简便,为食品中大肠埃希氏菌O145提供了一种的快速检测手段。     

基于免疫磁分离的7种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的评价

目的 研究基于免疫磁分离的七种产志贺毒素大肠埃希氏菌快速检测方法的灵敏度与特异性。方法 将大肠埃希氏菌O157：H7和大肠埃希氏菌O103不同稀释度的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及O157:H7和O103的抗原基因。同时,对菌悬液进行活菌计数,进行灵敏度研究。对8株携带stx1、stx2、eae基因的目标菌菌悬液,以及25株非目标菌的标准菌株及分离菌株的菌悬液,用免疫磁珠富集后,检测其携带毒力基因stx1、stx2 和黏附基因eae以及抗原基因,进行特异性研究。结果 本方法检测大肠埃希氏菌O157：H7的stx1、stx2、eae以及抗原基因的灵敏度为10_²CFU/mL,检测大肠埃希氏菌O103抗原基因的灵敏度为10_³CFU/mL. 8株目标菌检测结果与其携带的基因一致,没有假阴性,包容性达到100%。25株目标菌检测结果与其携带的基因一致,未发现有假阳性,排他性达到100%。结论 方法具有良好的灵敏性及特异性,适用于食品中七种产志贺毒素大肠埃希氏菌的快速检测。     

2002-2005年北京市顺义区食品致病菌监测分析

目的了解北京市顺义区食品致病菌的污染状况。方法按照GB/T4789─2003食品微生物检验标准方法进行检验。结果2002-2005年共监测了6类食品（590份）中的4种致病菌（沙门菌、金黄色葡萄球菌、肠出血性大肠埃希菌O157：H7、单核细胞增生性李斯特菌）。检出致病菌57株,阳性率为9.7%,其中检出沙门菌2株,金黄色葡萄球菌26株,单核细胞增生性李斯特菌29株,未检出肠出血性大肠埃希菌O157：H7。6类食品中生牛奶、生畜（禽）肉类产品致病菌阳性率较高,分别为15.5%、14.5%;冰淇淋、水产品、散装熟食中也有检出,分别为5.0%、4.4%、1.9%;生食蔬菜中没有检出致病菌。结论生牛奶、生畜（禽）肉类产品是致病菌污染的主要食品,由此造成的二次污染是引起食物中毒的隐患,应该引起足够重视。     

荧光型重组酶聚合酶扩增技术检测食品中大肠埃希氏菌O157

研究基于荧光型重组酶聚合酶扩增(exo-RPA)技术原理,建立了一种大肠埃希氏菌O157的快速检测方法。应用该方法对多种大肠埃希氏菌O157菌株和非大肠埃希氏菌O157菌株的检测结果表明,该方法的荧光探针和引物具有良好的特异性。对于梯度稀释的插入靶基因序列的质粒pUC57-rfbE和大肠埃希氏菌0157的检测,大肠埃希氏菌O157 exo-RPA检测灵敏度分别可以达到10~2 copies/μL和2.1×10~4 cfu/mL。对食品样品中大肠埃希氏菌0157的检测,exo-RPA方法显示出了良好的稳定性。并且食品样品中目标菌经4 h增菌后,该方法的灵敏性可以满足对食品样品中初始浓度为2.1×10~1 cfu/mL的目标菌的检测。因为大肠埃希氏菌exo-RPA方法配套设备简便、廉价,所以该方法可以在各级检测机构中推广,并适用于食品生产到消费各环节中大肠埃希氏菌0157的即时检测。     

培养基反浇法和贴膜法计数结果差异

<正>仪器和材料:菌种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉、缺陷假单胞菌试剂和培养基胰酪胨大豆肉汤培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、生理盐水仪器HTY-601集菌仪、FPY330泵管、FC50B反复使用薄膜过滤器、1002无     

适配体结合量子点技术同时检测金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7方法

目的：基于适配体结合量子点技术,建立一种同时针对金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌O157:H7两种食源性致病菌快速高效、灵敏的检测方法。方法：利用表面增强拉曼光谱技术筛选出与目标菌结合特异性较好的2?种适配体;利用免疫磁珠与适配体偶联技术特异性捕获2?种目标菌;选取不同发光原理的2?种量子点,并结合量子点荧光标记技术构建“磁珠＋目标菌＋量子点”的“三明治结构”,通过对结构条件优化确定2?种目标菌的检出限,并应用到市售无菌牛乳实际样品中进行加标回收率实验。结果：本研究证明所选取的2?条适配体与目标菌的结合具有高特异性,可实现对2?种目标菌的同时检测。对“三明治结构”优化结果表明：2?种目标菌的最佳捕获条件为免疫捕获时间45?min、磁分离时间2?min;适配体最适浓度为400?nmol/L;金黄色葡萄球菌检出限为101?CFU/mL,线性方程为Y=28.51X＋126.67（R2=0.973）;大肠埃希氏菌O157:H7检出限均为102?CFU/mL,线性方程为Y=92.86X－64.67（R2=0.987）,其中,Y为荧光强度,X为细菌菌落数的对数值,拟合度良好。且在牛乳样品中金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌O157:H7回收率分别为94.6%～102.8%和93.4%～100.4%。结论：本研究所建立的方法能够实现同时对2?种食源性致病菌快速、高效检测,该方法易操作且灵敏度高,在食品加工生产安全检测方面具有良好的应用前景。