鲢鱼骨胶原多肽的制备及其抗氧化活性研究

以鲢鱼骨为原料,经蛋白酶酶解、Sephadex G-25凝胶色谱分离纯化制备具有高抗氧化活性的胶原多肽。首先以胶原多肽得率和水解度为评价指标,从中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和复合蛋白酶中筛选最优酶,并采用单因素实验、响应面优化实验确定鲢鱼骨胶原多肽的最佳制备工艺;然后采用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离纯化,得到不同分子质量多肽组分并分析其氨基酸组成;以ABTS~+·清除能力和还原能力为指标,考察鲢鱼骨胶原多肽各组分的抗氧化活性。结果表明,酶解鲢鱼骨的最优酶为复合蛋白酶,制备胶原多肽的最佳工艺:酶添加量为8 220 U/g、酶解温度为51丈、酶解时间为4.5 h,此时胶原多肽得率为49.00%;经Sephadex G-25分离得到5个组分,其分子质量为14～9 788 Da,氨基酸组成符合胶原蛋白的特征;抗氧化实验表明组分Ⅳ具有最强的ABTS~+·清除能力和还原能力,其IC_(50)/OD_(1.0)分别0.02 mg/mL和19.16 mg/mL。该研究为鱼骨资源的开发利用提供了技术参考。     

赤魟鱼肉蛋白酶解产物的制备及抗氧化活性研究

目的:研究赤魟鱼肉酶解产物的制备工艺及抗氧化活性.方法:以DPPH清除率为指标,通过单因素和正交试验确定木瓜蛋白酶的最佳酶解条件;用葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)分离、提纯并检测各组分的抗氧化活性.结果:木瓜蛋白酶酶解赤虹鱼肉蛋白制备抗氧化肽的最佳酶解条件是:温度55℃、pH 7.0、酶解时间5h、加酶量0.6%;酶解产物的抗氧化活性大于酶解前粗蛋白的抗氧化活性;酶解产物经Sephadex G-25纯化后,得到组分F1、F2、F3,其中组分F2的抗氧化活性最高,当其质量浓度为5 mg/mL时DPPH清除率、还原力、羟自由基清除率分别为31.54%、0.274和17.91%;组分F2的相对分子质量小于307.结论:酶解并经Sephadex G-25纯化制备的赤魟鱼肉多肽具有较强的抗氧化能力.     

罗非鱼鳞胶原肽亚铁螯合物制备工艺优化及结构表征

以罗非鱼鳞胶原肽与氯化亚铁盐为原料制备多肽亚铁螯合物,并对其最佳螯合条件及螯合物结构进行探究。以螯合物得率为指标通过单因素和响应面法对螯合条件进行优化;通过扫描电镜、傅里叶红外光谱、X衍射和氨基酸分析等方法对螯合物结构及氨基酸组成进行分析。结果表明,制备螯合物的最佳反应条件为pH 5.30,多肽浓度3.00%,多肽与铁质量比3.2∶1.0,该条件下螯合率为82%,螯合物得率为65.43%;通过氨基酸组成分析表明,氨基酸组成符合胶原多肽的成分特征,螯合后天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸含量增加;扫描电镜、红外光谱以及X衍射等结果表明多肽与亚铁盐以配位键结合成多肽亚铁螯合物。     

白鲢鱼骨胶原多肽螯合钙的工艺优化

为减少淡水鱼加工过程中副产物对环境的污染和资源的浪费、提高淡水鱼的附加值,对白鲢鱼骨制备胶原多肽螯合钙的工艺进行研究。以白鲢鱼骨和氯化钙为原料,在一定条件下制备胶原多肽螯合钙,考察温度、鱼骨胶原多肽与氯化钙的质量比、时间、pH值对螯合率和螯合物中钙含量的影响。根据单因素试验结果,对胶原多肽螯合钙工艺进行四因子二次正交旋转设计优化,得到鱼骨胶原多肽螯合钙的最佳工艺参数为温度42 ℃、时间38 min、鱼骨胶原多肽与氯化钙的质量比2.1∶1、pH 6.8,此条件下的螯合率和螯合物中的钙含量分别为80.4%和12.1%。对螯合钙进行氨基酸组成成分分析,其总氨基酸含量为61.03%,且具备典型的胶原蛋白氨基酸组成特征。红外光谱扫描和电镜扫描观察表明：钙离子与胶原多肽发生了螯合反应,结合方式有离子结合、配位结合和吸附作用。     

猪皮胶原多肽螯合钙的制备及其结构表征

以猪皮明胶复合酶解胶原多肽和葡萄糖酸钙为原料,多肽钙螯合率为指标,在一定条件下制备多肽螯合钙。通过Plackett-Buiman(PB)和中心组合设计(CCD),考察胶原多肽/水料液比、多肽/葡萄糖酸钙质量比、p H、反应温度、反应时间、搅拌时间、搅拌速度等因素对多肽螯合率的影响。结果表明:通过PB设计筛选出多肽/葡萄糖酸钙质量比、p H和反应时间为多肽钙螯合主要影响因素,经CCD优化确定最佳螯合工艺为多肽/葡萄碳酸钙质量比5.5∶1,p H6.0,反应时间130 min,胶原多肽/水料液比1.5∶100,反应温度60℃,搅拌速度30 r/min,搅拌时间20 min。在此条件下,多肽螯合率达78.3%。采用紫外光谱、红外光谱、扫描电镜、X衍射等手段,研究了猪皮胶原多肽螯合钙的结构,结果表明猪皮胶原多肽与钙形成了螯合物,且胶原多肽的氨基和羧基均与Ca2+发生了螯合反应。     

鮟鱇鱼骨胶原多肽螯合钙的工艺优化

为减少水产品加工过程中副产物对环境的污染与资源的浪费、提高水产品的附加值,对鮟鱇鱼骨制备胶原多肽螯合钙的工艺进行优化。以鮟鱇鱼骨为原料,在适宜条件下制备小分子胶原多肽,并与鱼骨钙提取液进行螯合,制成胶原多肽螯合钙,分别考察螯合温度、鱼骨胶原多肽与鱼骨浸提液的质量比、时间、pH值对螯合率和螯合物中钙含量的影响。根据单因素试验结果,对胶原多肽螯合钙工艺进行四因素三水平正交试验,得到鮟鱇鱼骨胶原多肽螯合钙的最佳工艺参数为螯合温度30℃、时间50 min、鮟鱇鱼鱼骨胶原多肽与钙浸提液质量比2∶1、pH 6,此条件下的螯合率和螯合物中的钙含量分别为98.00%和21.29%。对螯合钙进行氨基酸组成成分分析,其中,具备典型的胶原多肽氨基酸的含量占总氨基酸含量的17.37%。     

鸿雁骨胶原多肽制备及其抗氧化活性研究

以鸿雁（Anser cygnoides）骨骼为原料,采用复合酶酶解制备雁骨胶原多肽,在单因素试验的基础上,采用响应面法优化酶解工艺。以水解度为指标,确定木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶为最佳酶组成复合酶,质量比为1∶2∶1,最佳酶解工艺为：酶解温度50℃、pH 7.1、加酶量6 100 U/g、酶解时间5 h,此时水解度为26.34%。通过超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除能力测定,发现雁骨胶原多肽的抗氧化活性与胶原多肽质量浓度成正相关,当底物浓度为6 mg/mL时,超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率分别为59.21%、51.82%。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和分子排阻色谱法测定复合酶酶解制备的雁骨胶原多肽分子量为851 Da～11 092 Da。氨基酸组成分析显示雁骨胶原多肽富含甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸及天冬氨酸等,这些特定的氨基酸与胶原多肽的抗氧化活性相关,为雁骨的开发利用提供参考。     

金枪鱼骨胶原多肽螯合钙的制备

以金枪鱼下脚料鱼骨为原料,对鱼骨进行酶解获得鱼骨胶原多肽,最终与氯化钙螯合制备螯合钙。以多肽浓度为指标探讨鱼骨粉酶解的酶解工艺,并以螯合率为指标探讨螯合工艺。最终确定的最佳酶解条件为:胰蛋白酶与风味蛋白酶2∶1复合、p H 7.0、60℃。此时酶解所得胶原多肽含量最高。最佳螯合条件为:pH 6.0、55℃、40min、质量比1∶1。此时螯合率最高。该条件下制备的金枪鱼骨胶原螯合肽呈均匀的颗粒状分布,粒径分布范围为0.5～0.7μm,赋予其良好的食品加工特性。     

冬枣多糖的分离纯化及抗氧化活性研究

目的：分离纯化冬枣多糖,并研究其组分、结构特征和抗氧化活性。方法：采用水提醇沉、脱蛋白脱色、DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-100凝胶色谱柱分离纯化冬枣多糖;利用Sephadex G-100凝胶色谱柱进行纯度鉴定和分子质量的测定;通过紫外光谱、红外光谱、气相色谱法进行了初步结构分析;采用邻二氮菲法和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）体系对纯化多糖进行抗氧化活性的研究。结果：冬枣多糖经DEAE-52分离和Sephadex G-100纯化得到2 个组分DPA和DPB,经Sephadex G-100鉴定均为均一组分,DPA和DPB分子质量分别为1.04×104、3.02×105 D,不含蛋白质和核酸,为吡喃型糖苷环骨架,DPA的单糖组成为阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖,其物质的量比为6.66∶1.00∶6.75∶2.09;DPB的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖,其物质的量比为4.33∶10.90∶1.00∶3.25∶4.78;DPA和DPB均具有一定的抗氧化活性,随着多糖质量浓度的增加,其抗氧化活性增强,在质量浓度为8 mg/mL时对羟自由基清除率分别为28.52%、78.79%,在质量浓度为0.4 mg/mL时对DPPH自由基清除率分别为9.97%、24.54%。结论：DPA和DPB均具有一定的抗氧化活性。     

明胶抗氧化肽的分离、纯化及其清除羟自由基活性的研究

为制备具有抗氧化活性的明胶肽,本实验采用不同的酶水解明胶,并对酶解产物采用超滤技术分离,利用分光光度法检测超滤后所得多肽组分对羟基自由基(·OH)的清除能力;进一步对抗氧化活性较强的组分利用葡聚糖Sephadex C-25阳离子交换色谱、Sephadex G-50凝胶过滤色谱和C18反向高效液相色谱进行分离、纯化,并对其各组分清除·OH活性进行了研究,最后对所得洗脱组分中具有最强清除自由基活性的多肽组分的分析氨基酸组成,结果显示:组分中甘氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含量较高的肽具有较好的抗氧化活性,·OH清除率达到55.37%。     

乳清蛋白钙螯合肽的分离及结构性质表征

目的:酶解乳清蛋白,通过连续色谱手段分离出强钙螯合活性的肽,再通过结构表征研究其钙螯合性质。方法:酶法水解制备乳清蛋白多肽,采用DEAE-650M阴离子交换色谱、Sephadex G-25凝胶过滤色谱、C18反向高效液相色谱(RP-HPLC)分离乳清蛋白酶解产物,得到特异性的钙螯合肽。采用核磁共振、X射线衍射、TGDSC、Zeta电位结构表征分析钙螯合性质。结果:乳清蛋白多肽经分离纯化得到具有强钙螯合力的肽,命名为WPH-13。其钙螯合活性为63.49μg/mg,结构鉴定发现钙离子可能被一个或多个WPH-13包裹在中央,主要结合位点是羰基氧和氨基氮。与钙结合后p H稳定性和热稳定性提高,抗氧化活性加强。结论:从乳清蛋白中分离得到的钙螯合肽具有较高的钙螯合活性。通过结构性质鉴定研究螯合物的作用机理,为第3代补钙剂的生产应用奠定基础。     

牛骨肽钙螯合物制备、表征及其促MC3T3-E1细胞成骨活性

目的：为制备人体高效吸收利用的补钙剂并探究其对MC3T3-E1细胞成骨活性的影响。方法：对牛骨多肽进行钙螯合处理，以钙螯合能力为考察指标，通过响应面方法确定最佳制备条件；利用红外光谱、X射线衍射和原子吸收等方法探究肽钙螯合物的结构特性及其稳定性；通过细胞实验探究牛骨肽钙螯合物对MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性的影响。结果：制备牛骨肽钙螯合物的最佳条件为肽钙质量比2.97∶1、温度62.54℃、pH 9.06。在该条件下，钙螯合能力达到55.65 μg/mg。光谱结构分析结果表明氨基氮、羟基氧和羧基氧是钙主要螯合位点，二者之间主要通过配位键结合，且肽螯合钙后分子质量增加；此外，牛骨肽钙螯合物稳定性受温度影响较小，但对pH值较敏感。MC3T3-E1细胞实验结果表明肽钙螯合物具有明显促MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化活性的作用。结论：制备的牛骨肽钙螯合物具有潜在的促MC3T3-E1细胞成骨活性功效。     

枸杞多肽的制备及其抗氧化活性研究

研究了中性蛋白酶和木瓜蛋白酶复合水解制备枸杞活性肽的工艺条件,并采用离子交换层析和凝胶柱层析对酶解产物进行纯化,以制备具有较高抗氧化活力的枸杞多肽.以DPPH·清除率为指标,通过响应面优化得到最佳酶解工艺条件:酶解温度51℃,中性蛋白酶与木瓜蛋白酶质量比1∶2.65,酶解时间4.3 h,p H=7.0.此条件下得到的枸杞多肽对DPPH·清除率为(23.32±0.47)%.分别采用DEAE阴离子交换层析和Sephadex G-25凝胶柱层析对枸杞多肽进行分离,最终获得DPPH·和OH·清除率分别为(72.65±1.84)%和(58.72±1.88)%的A-1组分,该组分的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力和OH·清除能力均随浓度的增大而提高.     

三斑海马蛋白ACE抑制肽的制备及其二级结构的研究

以三斑海马为原料,经碱性蛋白酶酶解,获得富含血管紧张素转化酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制肽的酶解液。酶解液经透析、Sephadex G-25凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱得到进一步分离纯化。结果表明,透析产物的IC50值为(0.44±0.26)mg/mL,相比酶解液(0.81±0.12)mg/mL,其ACE抑制活性更强。透析产物经Sephadex G-25凝胶柱分离纯化后,得到3种组分,其中组分F2的ACE抑制活性最强,IC50值为(0.11±0.08)mg/mL。F2经反相高效液相色谱进一步分离后,得到6个具有ACE抑制活性的组分峰,其中组分F2-4的ACE抑制活性最强,IC50值为(0.005 7±0.000 9)mg/mL。经过3步分离纯化后,成功从三斑海马蛋白中分离得到一种活性较强ACE抑制肽:ProAla-Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ala(PAGPRGPA),多肽分子量为721.39 Da。圆二色谱分析多肽二级结构表明其主要含无规则卷曲。因此,从三斑海马蛋白中分离得到的多肽可能成为营养保健品和抗高血压药品及相关疾病的一种有益成分,且对海马蛋白资源的开发利用具有重要意义。     

小分子苦瓜多糖MCPⅡa的纯化及结构分析

利用酶解结合水溶醇沉提取水溶性的苦瓜多糖（Momordica charantia polysaccharide,MCP）,经Sevag法除蛋白、DEAE-纤维素离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤获得活性多糖MCPⅡa。由高效凝胶渗透色谱检测可知MCPⅡa为均一多糖,平均分子质量为13.0 kD,单糖组分分析显示其单糖组成为鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖和阿拉伯糖（各组分物质的量比为12∶3.05∶19.89∶5.95∶56）。傅里叶红外光谱、核磁共振及刚果红实验发现其存在C1、C2、C3、C5连接,在水溶液中具有稳定的β-三股螺旋构象,扫描电镜下显示其为菱形晶体颗粒。     

鲫鱼鱼鳞抗菌多肽的制备纯化及其抑菌活性

以鲫鱼鱼鳞为原料,对其预处理后采用柠檬酸浸提酶解等工艺得到鱼鳞抗菌多肽粗酶解液,经透析后,再依次经Sephadex G-15、Sephadex G-50凝胶过滤层析和纤维素DEAE-52阴离子交换层析对其进行分离纯化,最后得到具有较强抑菌活性的鲫鱼鱼鳞抗菌多肽,并对其进行分子质量分析以及对多种细菌、霉菌的抑菌活性和最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）测定。结果表明：经分离纯化后得到的具有抑菌活性的蛋白组分AcIII,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示为单一条带,表明其已达到电泳级纯,其分子质量约为20.1 kDa,抑菌活性测定结果表明鲫鱼鱼鳞抗菌多肽具有很好的广谱抗菌活性,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、副溶血性弧菌、假单胞菌和希瓦氏菌的MIC为16 μg/mL,对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC为32 μg/mL。     

林蛙皮胶原多肽螯合钙的制备及表征

为了有效利用林蛙资源,以林蛙皮胶原多肽和氯化钙为原料,多肽螯合率为指标,在一定条件下制备胶原多肽螯合钙。首先通过正交试验,中性蛋白酶进行酶解,以水解度为指标,确定最佳水解条件为:温度45℃、pH7、水解时间2 h、加酶量1.7%,该条件下水解度为18.21%。得到的林蛙皮胶原多肽与CaCl_2进行螯合,通过单因素响应面试验,以螯合率为指标,确定螯合的最优条件为:螯合时间40 min、温度40℃、钙肽比1.5:1、无水乙醇添加倍数为8,该条件下螯合率为79.43%。采用傅里叶红外光谱仪、扫描电镜和X射线衍射等手段,研究了胶原多肽和多肽螯合钙的结构,结果表明林蛙皮胶原多肽与钙形成了新的螯合物。     

纳豆菌蛋白酶水解玉米醇溶蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽

利用纳豆菌固态发酵产酶酶解玉米醇溶蛋白,酶解物经Sephadex G-259离纯化,对产物及其组分血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性进行检测.结果表明,酶解血管紧张素转化酶的抑制活性为77.83%,经分离后组分3的抑制效果最好,可达89.4%.     

牛骨酶解产物中咸味肽组分的分离纯化及成分研究

采用Sephadex G-15和G-50凝胶色谱柱分离牛骨酶解产物,结合感官分析,得到Sephadex G-15的峰Ⅱ和G-50的峰Ⅲ两个咸味组分;用反向高效液相色谱和基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪分析咸味组分：Sephadex G-15得到的咸味组分中主要有两种成分,相对分子质量在800～1000之间;Sephadex G-50得到的咸味组分中主要有3种组分,相对分子质量在800～2000之间。两种咸味肽组分的极性较强,且均有相对分子质量为849.38的多肽。     

罗非鱼骨胶原钙螯合肽的酶解制备

本研究以罗非鱼骨胶原蛋白为原料酶解制备具有良好钙螯能力性的活性肽。以钙螯合活性为指标,将罗非鱼骨架经过脱肉、脱钙等前处理获得的罗非鱼骨胶原蛋白通过木瓜蛋白酶酶解制备得到罗非鱼骨胶原蛋白肽,通过单因素及正交试验对制备罗非鱼骨胶原螯合肽的酶解工艺进行优化。同时对最优条件下酶解获得的罗非鱼骨胶原钙螯合肽的分子量及氨基酸组成进行分析。结果表明,最优酶解工艺条件为:酶解时间4.5 h,pH 6.5,酶解温度62℃,酶底比0.6%。罗非鱼骨胶原钙螯合肽是一类小分子功能活性肽。同时通过对比罗非鱼骨胶原钙螯合肽及其钙-肽螯合物氨基酸组成,发现胱氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸和赖氨酸等氨基酸对活性肽的钙螯合能力起到重要作用。