啤酒麦芽真菌种类与酵母提前絮凝关系的研究

啤酒麦芽受到霉菌污染易引起酵母提前絮凝现象,为了研究引起酵母提前絮凝(PYF)现象的真菌种类,从PYF+麦芽(能够产生酵母提前絮凝现象的麦芽)上分离得到8种霉菌,分别用8种霉菌对麦芽皮壳进行处理,然后与去除皮壳的麦芽粉制备协定麦汁,煮沸,接种发酵,进行PYF值测定,最后进行数据分析.结果表明米根霉和黄曲霉为明显致PYF现象的菌种,镰刀菌为致PYF次级明显菌种,极细链格孢菌和白地霉为致PYF现象弱势菌种,芽枝孢菌和黑曲霉为轻微致PYF现象菌株,而青霉致PYF现象不稳定,这可能与菌种的量和酶活性有关,需要做进一步实验验证.     

啤酒酵母敲除fks1基因对啤酒风味稳定性的影响

以啤酒酵母工业菌株G-03为模板,扩增得到铜抗性基因cupl和β-葡聚糖合成酶基因fks1.fks1连接pMD-18T Vector得到重组质粒pTK,重组质粒pTK和cupl经BglⅡ、SalⅠ酶切后连接得到重组质粒pKC.以pKC为模板,PCR得到以fks1为整合位点包含cup1的基因片段fks1::cup1.片段转化啤酒酵母工业菌株G-03,通过硫酸铜抗性筛选得到一株啤酒酵母工程菌G-03/C.工程菌的生长速率、死灭温度和絮凝性发生改变.连续发酵3代工程菌常规发酵指标与原菌无较大差异,老化指标TBA降低65.6%,SI系数和RSV分别提高192.7%、26.6%.     

麦汁中与啤酒酵母提前絮凝有关的胶体物质测试

本文研究了对照麦汁和PYF麦汁发酵后的酵母胶体性质。分析了两种酵母菌株的细胞壁特性。采用PYF麦汁发酵的酵母絮凝性更强,在PYF麦汁中酵母的负电势比对照麦汁中酵母的负电势少(P<0.001)。两株酵母同时悬浮在经10kDa的过滤器过滤后的啤酒中,酵母表面电荷没有差异(P>0.05)。这表明,麦汁中的胶质或分子量大于10kDa的冷凝固物中才会使其表面电荷减少。以酵母絮凝体通过毛细管时的解体力量来评价细胞的分离力,结果,PYF酵母絮凝体明显的表现出更高的细胞分离力。对照酵母和PYF酵母在悬浮时和发酵开始的72hr之后,其同步捕获系数在数值上都具有显著性差异(P<0.05)。因此我们提出了一个涉及麦汁颗粒(发酵接近结束时呈正电势)和酵母(发酵过程中呈负电势)之间静电相互作用的PYF生理机制。     

麦芽对酵母絮凝的影响机理分析及评估方法比较

通常认为麦汁是酵母的营养源。从19世纪50年代开始,一些啤酒厂发现一些麦汁的组成物质会影响酵母的絮凝,特别是在发酵未完全时过早地造成絮凝的产生。其后的研究又发现远比原来认为的情况复杂,这些物质对细胞膜存在实际的损害,从而干扰了糖的吸收。后来很多文献称这种较正常絮凝更早的沉降现象为过早絮凝(PYF)。形成这种现象的主要原因是麦汁的影响,其因素又和麦芽有关。本文重点探讨麦芽对PYF的影响机理,以及国内外文献介绍的麦芽对PYF的影响,对评估方法进行了比较和分析。     

快速、灵敏测定麦芽的酵母超前絮凝活力新方法

本文提出了一种在无需糖化或发酵的条件下就可以实现快速、灵敏测定麦芽中酵母超前絮凝（PYF）活力水平的新方法，该法测定结果重现性好、分析时间仅需3h；采用该法测定的PYF活力水平与发酵验证试验结果有着良好的线性相关性；同时该法可用于大麦或绿麦芽中的PYF活力检测，且可作为评价大麦、麦芽或麦汁发酵力的一种有效工具。     

啤酒酵母超前絮凝现象的研究进展

啤酒发酵过程中,发酵液中麦汁等营养物质尚且充足时,酵母已经开始出现凝集沉降的现象,这种酵母过早沉降的现象称之为酵母超前絮凝(Premature Yeast Flocculation)。本文对酵母超前絮凝产生的原因,影响因素,检测方法及预防措施进行了一定的总结,并提出在预防PYF现象的微生物控制指标上有待进一步研究。     

麦芽中超前絮凝因子多糖的提取与性质研究

啤酒发酵中的超前絮凝现象(PYF,premature yeast flocculation)主要由麦芽中的多糖引起.本文将麦芽汁进行醇沉、Sevag去蛋白、超滤、DEAE-Sephadex A-25及Sephadex G-100柱层析等一系列分离,提取得到一种分子量在10000Da以上的多糖物质PYF H,酵母超前絮凝活力测定及聚集沉淀后的酵母形态均能证实该多糖能显著促进酵母絮凝.对其性质进行研究发现,该多糖为糖蛋白,糖含量和蛋白质含量分别为58.3%、3.8%.这种多糖物质的发现为进一步研究啤酒发酵中的PYF现象奠定了基础.     

高浓高温对啤酒酵母发酵性能的影响

以啤酒酵母S-6为实验菌株,研究了主发酵温度和原麦汁浓度对啤酒发酵的残糖、酒精度、风味物质和絮凝性等性能指标的影响。结果表明,原麦汁浓度一定时,主发酵温度对高级醇和乙酸酯的含量影响较大,主发酵温度由10 ℃提高至16 ℃时,高级醇含量提高了10%～20%,乙酸酯含量提高了8%～16%,但CO2累积质量损失、残糖、酒精度和絮凝性基本不受温度的影响;主发酵温度一定时,原麦汁浓度对酵母絮凝性影响较大,原麦汁浓度越高,酵母絮凝性越低,将高浓（18 °Bx）发酵液稀释50%至常浓（12 °Bx）,残糖、酒精度和高级醇的含量与常浓发酵液基本相同。该研究为选育高温高浓发酵低产高级醇同时强絮凝性酵母菌株提供了重要依据。     

絮凝性适中优良啤酒酵母的选育

以啤酒酵母Hp34为出发菌株,此菌低产乙酸,降糖快,但在大生产中存在絮凝性差的问题.采用2种方法对其进行连续培养,并对连续培养中的第5代及第10代的菌株进行平板分离.在低温下发酵,以絮凝性作为指标进行初筛,再通过发酵栓实验复筛.结果显示,仅进行连续培养的方法没有筛选出絮凝性显著提高的菌株,絮凝性最高的仅为27.5％;第2种方法筛选出了12株絮凝性达到35％以上的突变株,其中突变株S16在乙酸、双乙酰、发酵力和风味物质等综合指标上保持了亲株的优良性状,同时絮凝性为39.6％,比原菌株提高了2.21倍;遗传10代,测其发酵性能,表明遗传性状稳定.     

高产L-乳酸干酪乳杆菌的选育及发酵条件研究

以一株产L-乳酸的干酪乳杆菌G-02为出发菌,采用硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)进行诱变,利用高温高糖培养基选育出一株L-乳酸发酵活力较强的菌株G-04。并且对该株菌7L发酵罐发酵条件进行了研究,探讨了溶氧、中和剂、补料方式对发酵过程的影响。实验结果表明:在适当的发酵条件下,该菌株可积累L-乳酸浓度达到188g/L,糖转化率大于90%,发酵周期小于44h。     

Mutagenizing brewing yeast strain for improving fermentation property of beer

A brewing yeast mutant with perfect sugar fermentation capacity was isolated by mutagenizing the Saccharomyces pastorianus transformant, which carries an integrated glucoamylase gene and has one copy of non-functional alpha-acetolactate synthase gene. The mutant was able to utilize maltotriose efficiently, and the maltotriose fermentability in YNB-2% maltotriose medium increased from 32.4% to 72.0% after 5 d in shaking culture. The wort fermentation test confirmed that the sugar fermentation property of the mutant was greatly improved, while its brewing performances were analogous to that of the wild-type strain and the characteristic trait of shortened beer maturation period was retained. Therefore, we believe that the brewing yeast mutant would benefit the beer industry and would be useful for low caloric beer production.     

乙醇脱氢酶I基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究

本实验根据酿酒酵母乙醇代谢途径,构建一株低乙醇产量的酿酒酵母基因工程菌株,以满足人们对低醇啤酒的需要。利用抗性基因筛选基因敲除突变体的方法,通过引物L1和L2扩增潮霉素B基因(两翼与酿酒酵母同源),按常规醋酸锂法转化酵母细胞后,筛选标记与酵母adhI基因发生同源重组,得到一株ADHI酶活性降低的工程菌株。发酵实验结果表明,转化菌株乙醇含量平均值为1.8%(V/V),较原始菌株低了65%。说明转化菌株体内乙醇生成途径受到干扰。     

Construction of proteinase A deficient transformant of industrial brewing yeast

Yeast proteinase A is detrimental to beer foam. The proteinase A deficient transformant of industrial brewing yeast, WZ65/a, was constructed using PCR-mediated gene disruption, and the transformant was verified to be genetically stable. The PCR analysis showed that PEP4 gene coding for proteinase A in the WZ65/a was disrupted. No matter in the yeast cells or in the fermenting liquor of WZ65/a, proteinase A activity could not be detected. Analysis of the main charicteristics indexes of beer also showed that proteinase A activity and foam performance in the beer brewed with WZ65/a were better than that of the host strain, WZ65.     

肌苷高产菌的转化育种及均匀设计在发酵条件试验中的应用

应用感受态细胞转化法，以ＴＸ２为供体，以ＴＳＡ１９为受体，成功地选育出了具有目的遗传标记Ａｄｅ－＋Ｈｉｓ－＋Ｘａｎ－＋８－Ａｇｒ＋６－ＭＰｒ＋ＳＧｒ，产肌苷高的转化子ＴＳＸＢ２９，在发酵条件试验中，引进均匀设计理论，利用微机对试验数据进行统计处理，找出了最佳条件。在该条件下，转化子ＴＳＸＢ２９摇瓶发酵平均产肌苷２７．８５ｍｇ／ｍｌ，最高达２９．６７ｍｇ／ｍｌ，经斜面传代１５次及连续摇瓶传代１０次，发现该转化子是稳定的。经连续１０批稳产试验，发现其１０批平均产肌苷２７．３８ｍｇ／ｍｌ，完全可用于工业生产中。     

无花果内源酵母的筛选及鉴定

为了获得无花果酿酒酵母的优选菌株,从自然发酵的无花果汁中分离纯化,初步筛选出两株酵母菌SUYX-02和SUYX-03。对比研究其在不同温度、pH值、接种量条件下的生长特性并探究其二氧化硫和酒精的耐受性,最终选择了酵母菌SUYX-03作为发酵菌株并测试该菌株的发酵性能。结果表明,该酵母菌的适宜生长温度为30 ℃,适宜pH值为5.5,具有14%vol的酒精耐受性和300 mg/L的二氧化硫耐受性。对该酵母菌进行形态学和生理学特征鉴定以及内转录间隔区（ITS）序列分析,最终鉴定出菌株SUYX-03属于酵母属（Saccharomyces）中的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。     

菊粉酶基因克隆表达与油脂的组分分析

为了实现解脂亚罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）直接利用菊粉进行油脂生产,将外切菊粉酶基因INU1与表达质粒pINA1317连接,在解脂亚罗威亚酵母（Y. lipolytica）ACA-DC尿嘧啶缺陷突变菌株中表达。以尿嘧啶缺陷型筛选作为筛选标记获得转化子C37,经过培养菊粉酶酶活达到37.15 U/mL。在2 L发酵罐中,转化子C37以菊粉为底物进行发酵,油脂产量和细胞干质量分别为49%和14 g/L。脂肪酸分析结果显示棕榈酸、硬脂酸和油酸总和占总脂肪酸的92%以上,其中油酸含量高达59%,表明通过菊粉酶基因在解脂亚罗威亚酵母中的表达,实现了以菊粉为底物一步发酵产单细胞油脂。     

Molecular breeding of Aspergillus kawachii overproducing cellulase and its application to brewing barley shochu

In order to improve fermentation of barley without addition of commercial cellulase, a white koji mold, Aspergillus kawachii IFO4308, was transformed with the egl1 gene encoding endoglucanase I (EGI) of Trichoderma viride and the endogenous cekA gene encoding endoglucanase (CekA). Transformants with egl1 under the control of the strong glaA promoter produced EGI in both submerged and solid-state cultures. However, the EGI produced in solid-state culture was unstable due to the acidic condition of this culture. A transformant N10 with two additional copies of the cekA gene exhibited endoglucanase activities against carboxymethyl-cellulose, which are 21- and 1.8-fold higher than that of the wild-type (wt) strain when the cells were cultivated in submerged and solid-state cultures, respectively. Cultivation of strain N10 in steamed barley for preparing koji followed by fermentation with Saccharomyces cerevisiae resulted in improved fermentation assessed based on higher productions of ethanol, amino acids, and organic acids, the reduction of residual sugar, and the low viscosity of barley mash. The overall fermentation result for the transformant carrying cekA was comparable with that for the wt strain using commercial cellulase. These results demonstrate that acquisition of only two-fold CekA activity by A. kawachii in the solid-state culture allows us to improve the brewing of barley shochu.     

海洋源纤溶酶高产菌株的诱变育种及液体培养基优化

为获得纤溶酶高产菌株及其最优发酵条件,以海洋环境来源的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H-A-03为出发菌株,经过60Co辐射诱变获得了一株遗传稳定性好的纤溶酶高产菌株F8-C,其酶活力较出发菌株提高28.78%。采用统计学优化方法获得了组分更简单、用量更少、更利于菌株产酶的培养基：可溶性淀粉41.6 g/L、黄豆粕粉26.2 g/L、CaCl2 1.0 g/L,KH2PO4 2.0 g/L。在此基础上,3 L摇瓶放大试验结果显示,菌株F8-C的产酶量达到（3 231±21） U/mL,较出发菌株H-A-3提高44.8%。结果表明利用60Co辐射诱变育种,并采用统计学方法优化培养基,对于提高枯草芽孢杆菌纤溶酶的产酶量是一种有效策略。该研究结果也将为下一步发酵罐扩大试验奠定基础。     

PROPERTIES OF A GENETICALLY-ENGINEERED DEXTRIN-FERMENTING STRAIN OF BREWERS' YEAST

A dextrin-fermenting strain of brewer's yeast was obtained by transformation with a recombinant plasmid (pLHCD6) containing a DEX gene. The transformant produced five-fold more extracellular amyloglucosidase (AMG) than the strain of Saccharomyces diastaticus from which DEX was cloned. The growth rate, however, was adversely affected and, consequently, the transformant fermented wort more slowly than the parental (untransformed) strain. A mixed culture was therefore used at pilot-scale, to maintain a rate of fermentation similar to that of the parental strain. The transformant by itself was capable of superattenuating wort (original gravity 1.040) to a specific gravity of 1.0023 (compared with 1.0046 for the parental strain). This represents the expected degree of dextrin breakdown by an AMG with no “debranching” activity which can only hydrolyse alpha-1,4 linkages. A high copy number for the plasmid pLHCD6 was maintained throughout fermentation. The beers produced using the Dex+ transformants were judged to be of sound quality.     

传统自然发酵黏豆包关键酵母的筛选鉴定

目的 筛选适宜谷物黏豆包发酵的酵母菌菌株。方法 以采集自黑龙江省不同地区的传统自然发酵黏豆包谷物发酵液为研究对象, 通过高通量测序技术, 分析发酵液中微生物多样性, 再利用传统培养法对发酵液中的酵母菌进行分离, 筛选出耐低温、耐低pH、起酵时间快和酵香风味好的酵母菌株。结果 通过高通量测序结果显示, 在真菌菌属水平上, 3个地区样品共包含5个门、30个属、30个种, 微生物群落为酿酒酵母属(Saccharomyces)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、毕赤酵母属(Pichia)等, 其中酿酒酵母属为首要优势菌属, 次级优势菌皆为威克汉姆酵母属。在此基础上, 利用平板划线分离出21株酵母菌, 通过分子生物学鉴定, TY5、TY9和AC6为酿酒酵母, TY8和SC4为威克汉姆酵母, AC3为热带假丝酵母, SC3为季也蒙毕赤酵母, SC5为胶红酵母; TY5、TY8、TY9、AC6、SC6在pH为3、15℃条件下具有较好的生长性能, 其中菌株TY9和AC6具有较强的耐酸性及耐低温性, 且起酵时间快, 菌株TY9发酵风味最好, 呈现较强的谷物发酵风味。结论 筛选出一株耐低温、耐低pH、起酵时间快和酵香风味好的菌株, 经鉴定为酿酒酵母。本研究为东北黏豆包酸面团发酵菌剂的开发提供了理论基础。