乳酸乳球菌乳亚种NCU036018细菌素的分离纯化及其抗菌机制

从自然发酵泡菜中筛选到1 株对金黄色葡萄球菌具有抑制作用的乳酸菌,经16S rDNA和生理生化实验鉴定其为乳酸乳球菌乳亚种（Lactococcus lactis subsp. lactis）并命名为NCU036018。NCU036018发酵上清液中的抑菌物质对胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、α-糜蛋白酶敏感,而对胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶以及过氧化氢酶不敏感,在pH 2.0～10.0、温度50～100 ℃的范围内分别保留了70%和90%以上的抑菌活性。随后通过硫酸铵盐析、超滤、阳离子交换层析对发酵上清液抑菌成分进行分离纯化,将得到的细菌素命名为乳球菌素036018,其分子质量在14.4～20 kDa之间,最小抑菌浓度为0.50 mg/mL。乳球菌素036018能有效降低金黄色葡萄球菌生物膜的形成率,损坏细胞表面形态、破坏细胞膜的通透性,从而抑制甚至杀死细胞。将乳球菌素036018添加至牛奶中,发现其具有显著抑制金黄色葡萄球菌生长的效果,具有良好的食品防腐保鲜的应用前景。     

乳酸链球菌素(Nisin)抑菌作用及其抑菌机理的研究

通过抑菌试验确定了乳酸链球菌素（Nisin）的高产菌株．乳酸乳球菌乳酸亚种T0625菌株的抑菌谱。结果显示,含有乳酸链球菌素的发酵液对革兰氏阳性细菌有抑制作用,但对革兰氏阴性细菌、酵母菌和霉菌无抑制作用。从T0625菌株发酵液中提取乳酸链球菌素加入金黄色葡萄球菌培养液中进行抑菌试验,结果培养液蛋白质含量提高、电导率增加,未出现对数生长期。透射电镜观察发现,加入乳酸链球菌素后,菌体变形,出现质壁分离现象,进而菌体细胞破裂,细胞内容物大量外泄,菌体成为不规则残片。SDS-PAGE凝胶电泳显示,乳酸链球菌素作用使金黄色葡萄球菌菌体内蛋白质减少,培养液中蛋白质增加。推测乳酸链球菌素的作用位点为细胞膜,具有破坏菌体细胞膜完整性的作用。试验结果支持了“孔道形成”理论的观点。     

凤窝酒曲酵母菌多样性及其分离株发酵红枣酒氨基酸组成分析

采用野生蓝靛果（Lonicera caerulea）纯化得到花青素，以生长曲线、抑菌圈直径、最小抑菌浓度为评价指标，研究其对嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）生长的影响，分析其抑菌效果、抑菌机理及保质期21 d内酸度、pH值、还原糖的变化。结果表明，添加花青素组能抑制菌株生长；花青素对两种乳酸菌及其混合菌有一定的抑制作用，对嗜热链球菌、混合菌（1∶1）及保加利亚乳杆菌的最小抑菌浓度分别为62.5 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL；加热预处理、培养基pH以及糖浓度对花青素的抑菌作用产生影响。花青素对乳酸菌的抑菌作用机理是其改变细胞膜通透性、损伤菌体蛋白引起菌体蛋白的泄露。0.32%花青素添加量可抑制酸奶后酸化作用。     

乳酸链球菌素对肉食杆菌和腐生葡萄球菌的抑菌机制研究

目的 研究乳酸链球菌素(Nisin)对肉食杆菌和腐生葡萄球菌的抑菌作用机制。方法 采用肉汤稀释法测定乳酸链球菌素对肉食杆菌和腐生葡萄球菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),由细菌生长曲线、电导率、胞外核酸、胞外蛋白、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)活力,并采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)观察综合评价乳酸链球菌素对肉食杆菌和腐生葡萄球菌细胞结构的影响,通过测定细胞保护酶中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)活力来分析乳酸链球菌素对肉食杆菌和腐生葡萄球菌细胞酶活性影响。结果 乳酸链球菌素对肉食杆菌和腐生葡萄球菌的MIC分别为6.2500 mg/mL和10.000 mg/mL,菌体经MIC和2 MIC处理后,其正常生长受到抑制,其对肉食杆菌的抑菌作用明显强于腐生葡萄球菌被抑制的作用。SEM观察发现,经MIC乳酸链球菌素处理后的两种菌体细胞形态发生扭曲收缩、有褶皱,电导率、胞外核酸、胞外蛋白含量和AKP活力升高,而菌体的SOD与CAT活力均降低。结论 乳酸链球菌素能够改变肉食杆菌和腐生葡萄球菌细胞的形态、增加膜的通透性,造成了细胞内容物的泄露,降低菌体内细胞保护酶的作用,从而导致细菌的死亡,乳酸链球菌素对肉食杆菌的抑制作用强于对腐生葡萄球菌。     

植物乳杆菌JLA-9产细菌素的分离纯化

将来源于东北传统发酵酸菜中的植物乳杆菌JLA-9产的细菌素进行分离纯化,首先利用饱和度为80%的硫酸铵溶液对发酵上清液进行沉淀粗分离。复溶后利用Sephadex LH-20进行凝胶层析纯化,之后采用Hitrap QFF进一步进行离子交换层析纯化,利用反相高效液相色谱(Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography,RP-HPLC)C_(18)柱进行最终纯化,得到单一活性抑菌组分,说明细菌素得到基本纯化,经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF/MS)确定该细菌素的分子质量约为0.9 kDa左右。采用琼脂扩散法测定了细菌素对常见的食源性致病菌和腐败菌的抑菌效果,结果显示该细菌素具有较好的抑制作用。     

南美白对虾虾头内源酶的分离纯化

对南美白对虾虾头的内源酶进行分离纯化及酶学性质的研究。利用正交正交试验优化了硫酸铵粗提内源酶最佳工艺条件:缓冲溶液pH6.8,硫酸铵一级沉淀饱和度20%,硫酸铵二级沉淀饱和度80%。虾头内源酶经硫酸铵分级沉淀后,再经Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱层析纯化,得到组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3个酶活峰。对酶活最高的组分I进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分析,表明组分Ⅰ中主要活性酶分子质量约为41.0kDa。凝胶层析分离组分Ⅰ最适作用pH为7.0～9.0,最适作用温度为60～70℃。     

米酒乳杆菌素分离纯化条件研究

目的：对米酒乳杆菌产生的广谱细菌素进行分离纯化技术研究。方法和结果：采用活性炭脱色、冷乙醇沉淀、Sephadex G50 葡聚糖凝胶层析和高效液相色谱技术对米酒乳杆菌产生的细菌素进行分离纯化。结果表明,发酵浓缩液脱色的最佳工艺条件为活性炭加量3.5%、温度40℃、脱色时间20h,脱色率达64.5%。冷乙醇沉淀的最佳乙醇终浓度为80%,葡聚糖凝胶层析的洗脱液流速为0.5ml/min,上样量3ml,高效液相色谱纯化的流动相为90% 的甲醇水溶液,在此条件下可得到电泳纯的细菌素。结论：确定了米酒乳杆菌素的分离纯化条件,为细菌素的理化性质和抑菌机理的研究提供依据。     

枯草芽孢杆菌CF-3抑菌蛋白的分离与鉴定

本研究采用硫酸铵分级盐析、交联葡聚糖凝胶分子层析(Sephadex G-75)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等方法对生防菌枯草芽孢杆菌CF-3无菌发酵液对复端孢霉F中的主要抑菌蛋白进行了分离与鉴定。结果表明:CF-3无菌发酵液中抑菌蛋白的硫酸铵最佳沉淀饱和度为60%~70%,蛋白质沉淀量为149.03μg/mL,极显著高于其他浓度(p≤0.01);利用60%~70%饱和度的硫酸铵提取的粗蛋白质经Sephadex G-75凝胶柱层析后获得2个吸收峰,8管收集液,其中第2管峰收集液抑菌活性显著高于其他管(p≤0.05);将流分2收集液进一步分离纯化后,将抑菌效果最好的2.3号流分的两条蛋白条带割胶回收,利用生物质谱技术鉴定为γ-谷氨酰转肽酶和胞内丝氨酸蛋白酶,分子量分别约为42.5 ku和33.9 ku。以上结果可为该菌株及其抑菌蛋白的开发应用奠定基础。     

乳酸菌对果蔬中霉菌拮抗作用的研究

应用保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)4种乳酸菌对从梨、黄瓜、葡萄等果蔬中分离的6种霉菌进行拮抗作用研究.短横线软琼脂拮抗孢子法结果表明,保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌对6种霉菌生长平均抑制率分别为67.59％、69.37％和70.18％.菌饼法研究表明,保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌对根霉A和D以及曲霉E都具有较强的拮抗作用,其中嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌对霉菌D的抑制率分别为63.16％和57.17％,保加利亚乳杆菌对霉菌E抑制率为72.20％.保加利亚乳杆菌对霉菌E拮抗作用最强,嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌对霉菌D的生长也具有较强的抑制作用,且在7d内拮抗作用稳定,乳酸乳球菌对所有霉菌没有拮抗作用.     

高原酸奶中乳酸链球菌产生的乳酸链球菌素纯化鉴定研究

目的:对从高原酸奶中提取的乳酸链球菌产生的乳酸链球菌素进行纯化及鉴定。方法:采用分离、凝胶层析、抑菌实验、高效液相色谱法来纯化乳酸链球菌素,用凝胶电泳来鉴定其纯度,确定其分子量。结果:生产的乳酸链球菌素具有抑菌性,将该抑菌成分与乳酸链球菌素标准品进行SDS-PAGE凝胶电泳,通过比较电泳图谱一致。结论:本实验得到的抑菌成分即为乳酸链球菌素,且纯度高,分子量大约为3300u。     

Production, purification, and characterization of micrococcin GO5, a bacteriocin produced by Micrococcus sp. GO5 isolated from kimchi

Strain GO5, a bacteriocin-producing bacterium, was isolated from green onion kimchi and identified as Micrococcus sp. The bacteriocin, micrococcin GO5, displayed a broad spectrum of inhibitory activity against a variety of pathogenic and nonpathogenic microorganisms, as tested by the spot-on-lawn method; its activity spectrum was almost identical to that of nisin. Micrococcin GO5 was inactivated by trypsin (whereas nisin was not) and was completely stable at 100 degrees C for 30 min and in the pH range of 2.0 to 7.0. Micrococcin GO5 exhibited a typical mode of bactericidal activity against Micrococcus flavus ATCC 10240. It was purified to homogeneity through ammonium sulfate precipitation, ultrafiltration, and CM-Sepharose column chromatography. The molecular mass of micrococcin GO5 was estimated to be about 5.0 kDa by tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and in situ activity assay with the indicator organism. The amino acid sequence of micrococcin GO5 lacks lanthionine and beta-methyllanthionine and is rich in hydrophobic amino acids and glycine, providing the basis for the high heat stability of this bacteriocin. The N-terminal amino acid sequence of micrococcin GO5 is Lys-Lys-Ser-Phe-Cys-Gln-Lys, and no homology to bacteriocins reported previously was observed in the amino acid composition or N-terminal amino acid sequence. Based on the physicochemical properties, small molecular size, and inhibition of Listeria monocytogenes, micrococcin GO5 has been placed with the class II bacteriocins, but its broad spectrum of activity differs from that of other bacteriocins in this class.     

Purification of Polyphenoloxidase from the Purple‐fleshed Potato (Solanum tuberosum Jasim) and its Secondary Structure

ABSTRACT: Polyphenoloxidase (PPO) was purified from purple‐fleshed potatoes (Solanum tuberosum Jasim) using membrane concentration, ammonium sulfate fractionation, Resource Q ion exchange chromatography, and Sephacryl S‐200 HR gel permeation chromatography. PPO was purified 78‐fold from a crude extract. Sodium dodecyl sulfate‐polyacrylamide gel electrophoresis results showed that the purified enzyme has a major subunit molecular weight of 40 kDa. To elucidate the secondary structure of the purified PPO, circular dichroism (CD) was performed. The CD spectrum of the purified enzyme showed that PPO contains 35% α‐helix, 30% β‐turn, and 35% random coil structure.     

Tween80诱导下米曲霉3．5232产胞内脂肪酶的研究

米曲霉3．5232在Tween80诱导下,相比于葡萄糖作为碳源的培养条件,米曲霉在细胞壁、细胞膜及细胞质中均可以诱导产生分子质量为27kDa的脂肪酶,而在细胞质中又有分子质量为36kDa的脂肪酶表达。利用硫酸铵沉淀,DEAE Sepahrose FastFlow离子色谱交换及SephadexG．75凝胶色谱的分离方法,从米曲霉细胞质中分离纯化了分子质量为36kDa的脂肪酶。最终纯化倍数为42．45,产率为0．12％。     

解淀粉芽孢杆菌素Amylocyclicin W5的纯化及其抑菌机理

为研究解淀粉芽孢杆菌素Amylocyclicin W5的抑菌机理，本实验通过硫酸铵沉淀、离子交换以及?KTA蛋白纯化系统对Amylocyclicin W5进行分离纯化，并对Amylocyclicin W5进行三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；此外，以蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus LMGT2805）为指示菌对Amylocyclicin W5进行抑菌实验，同时通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察细胞形态变化以及细胞内部结构变化。结果表明，最适宜沉淀细菌素的硫酸铵饱和度为70%，0.5 mol/L NaCl可以明显洗脱吸附在HiPrep SP XL 16/10柱上的Amylocyclicin W5，将洗脱液通过?KTA蛋白纯化系统得到2 个对应的收集峰（F1和F2）；对不同收集峰对应的洗脱液进行抑菌实验，结果发现只有F2对应的组分液对B. cereus LMGT2805有抑菌效果。三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示Amylocyclicin W5组分F2的分子质量约为12.3 kDa。高浓度（4 倍最低半抑菌浓度）条件下的Amylocyclicin W5可以完全抑制B. cereus LMGT2805，其主要抑菌机制是破坏其细胞壁，使其形成孔洞，导致其内容物外泄，细菌（营养或芽孢细菌）无法正常进行代谢，从而造成细菌的死亡。实验结论为新型广谱细菌素的开发利用及其在食品安全领域的应用研究提供了数据支持。     

指状青霉DSM62840生物转化柠檬烯生产α-松油醇过程中关键酶的分离纯化及质谱鉴定

以指状青霉DSM62840为研究对象，通过高压法破碎细胞，采用超高速离心、硫酸铵沉淀、羟基磷灰石层析和凝胶过滤层析等方法对指状青霉DSM62840生物转化柠檬烯生产α-松油醇过程中的关键酶进行分离纯化。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果显示在分子质量约为50 kDa处有一条明显的蛋白条带，并通过液相色谱-串联质谱分析初步确定该条带中的蛋白可能是二氢硫辛酰胺脱氢酶（PDIDSM_08010）。本研究为α-松油醇类香料的合成提供理论依据和参考。     

Purification and characterization of an extracellular beta-agarase from Bacillus sp. MK03

A new beta-agarase was purified from an agarolytic bacterium, Bacillus sp. MK03. The enzyme was purified 129-fold from the culture supernatant by ammonium sulfate precipitation, anion exchange and gel filtration column chromatographic methods. The purified enzyme appeared as a single band on sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Estimation of the molecular mass by SDS-PAGE and gel filtration gave values of 92 kDa and 113 kDa, respectively. The N-terminal amino acid sequence of the enzyme showed no homology to those of other known agarases. The optimum pH and temperature for this enzyme were 7.6 and 40 degrees C, respectively. The predominant hydrolysis product of agarose by this enzyme was neoagarotetraose, indicating the cleavage of beta-1,4 linkage. This enzyme could hydrolyze neoagarohexaose to produce neoagarotetraose and neoagarobiose; it could not hydrolyze these products. The enzyme digested agarose by endo-type hydrolysis.     

Partial characterization of dextran-degrading enzyme obtained from blue cheese

Degradation of dextran beads was observed when the water-soluble fraction of a blue cheese extract was applied to the top of a Sephadex G-150 or G-200 column. This phenomenon suggests the presence of a specific enzyme that can hydrolyze dextran. After removal of casein components from the blue cheese fraction, ammonium sulfate treatment and gel filtration chromatography were performed to isolate the enzyme fraction. The enzymatic products were analyzed by thin-layer chromatography and gel filtration chromatography and identified as isomaltooligosaccharides. The isoelectric point of this enzyme fraction was approximately 4.9, as determined by isoelectric focusing using Rotofor, and the molecular weight of the fraction was 65 kDa, as estimated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-PAGE. Optimum pH for enzymatic activity was 5.0 to 5.3. A partial N-terminal amino acid sequence of 20 residues was determined to be ATPDEWRSRSIYFMLTDRGA from an enzyme fraction further purified by ion-exchange chromatography and native PAGE. This sequence showed a maximum homology of 80% with alpha-amylase or Taka amylase that originated from various microorganisms.     

洋葱伯克氏菌Burkholderia contaminans抗菌蛋白分离纯化及生物学特性分析

洋葱伯克氏菌（Burkholderia contaminans）从杏果实表面分离,实验证明其对果蔬采后多种病原真菌具有较强的抑制作用。为了进一步揭示其抑菌机理,通过菌体裂解、硫酸铵分级盐析、纤维素DE-52阴离子交换柱层析及Sephadex G-100凝胶过滤柱层析,得到一种具有抗菌活性的蛋白。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）检测结果表明,该蛋白呈单一条带,其分子质量约为17.6?kDa。粗提蛋白溶液具有一定热稳定性,在不同pH值条件下稳定,对有机试剂、紫外照射、蛋白酶不敏感。50?mg/mL的Tween-80处理粗提液,活性比对照增加了12.5%,对还原剂SDS和二硫苏糖醇敏感。     

酸橙内生菌Bacillus thuringiensis Bt028几丁质酶的分离纯化及其酶学性质

为揭示酸橙内生菌Bacillus thuringiensis Bt028几丁质酶的基本酶学性质,采用离心、硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶G-100层析及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法对菌株Bt028发酵液中的几丁质酶进行分离纯化鉴定,并考察该几丁质酶的最适温度、最适pH、催化动力学参数等性质。结果表明,Bt028菌株发酵液经离心、硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶G-100层析分离纯化后获得电泳纯几丁质酶比活力为681.78 U/mg,纯化倍数为3.21,回收率15.52%。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,几丁质酶的分子质量为65 kDa。酶学性质研究结果表明,该酶的最适反应温度为60 ℃,最适反应pH为6.5,在温度低于60 ℃、pH5.5~7.5时有较好的稳定性;Mg2+、Ca2+、Hg2+、Co2+对该酶活力有抑制作用,而Cu2+和Fe3+有一定的促进作用;低浓度的甲醇、乙醇、正丙醇和二甲亚砜使酶的活性增加,但当浓度继续增大,反而会抑制酶的活性;丙酮对几丁质酶有激活作用,而甲醛对几丁质酶有抑制作用。在最适催化条件下,几丁质酶催化反应的米氏常数Km、最大反应速率Vmax、酶的转换数Kcat分别为29.533 mg/mL、108.696 μmoL/(L·min)和0.527/min。研究结果可为该酶的实际应用提供必要的工艺参数。