羊乳中掺入牛乳的间接ELISA定量检测

制备抗β- 酪蛋白多克隆血清,免疫吸收封闭与羊乳反应的抗体,获免疫吸收抗体用于乳样的间接ELISA检测中,建立羊乳中掺入牛乳成分的定量免疫学方法。实验表明,该间接ELISA 法用于原乳检测时,掺入牛乳的百分含量与A450nm 在4%～50% 呈线性关系,该方法的最低检出量为4%。所建立的ELISA 方法变异系数＜ 5%,回收率在94%～105% 之间,符合方法学要求,可用于牛乳掺假的定量检测。对灭菌乳的检测表明,热处理不改变β- 酪蛋白与抗体反应的特性,方法还可用于经热加工的乳品检测中。     

竞争ELISA 法对牛乳β - 酪蛋白的检测

通过确定包被抗体最佳稀释度(anti- β-CN IgY 1:160)、封闭液及封闭时间(含1% 明胶的PBST,封闭1h)、酶标抗原(1:20)和待测脱脂牛乳样品稀释液(1:80)抗体作用时间(60min)、底物最佳反应时间(20min)、温度(37℃)等对竞争ELISA 效果有重要影响的因素,建立检测牛乳β- 酪蛋白的竞争ELISA 法。经敏感性实验和重复性实验证明本实验建立的竞争ELISA 法最低检出量为5.1μg/mL,变异系数(CV)小于5%,可以开发应用于牛乳及其制品的蛋白质品质快速检测。     

3种特异性IgY与IgG相对亲和力特性的比较研究

采用硫氰酸铵和尿素洗脱ELISA法两种方法,分别对牛β-酪蛋白、κ-酪蛋白和大肠杆菌O157:H7与对应抗原的卵黄抗体(IgY)与免疫球蛋白(IgG)抗体相对亲和力特性进行比较研究。结果表明：3种特异性IgY与抗原的相对亲和力比IgG要高,对蛋白抗原,两种抗体的相对亲和力相差不大,而对大肠杆菌O157:H7,两种抗体的差别明显加大,IgY的相对亲和力较IgG强。两类乳源蛋白抗体亲和力比较,发现κ-酪蛋白抗体与抗原的亲和力高于β-酪蛋白抗体,前者用于乳品免疫检测中,可提高方法灵敏度。     

酶联免疫法快速测定原料乳中κ-酪蛋白含量

用牛κ-酪蛋白纯品免疫新西兰白兔,制得兔抗牛κ-酪蛋白的多克隆抗体。以牛κ-酪蛋白包被抗原,自制抗体为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,邻苯二胺(OPD)为底物,建立了牛乳中κ-酪蛋白的间接ELISA检测方法。检测的线性范围是25～1400ng/mL,相关系数是0．9831,回收率在95．83％～125．83％之间,证明可以用酶联免疫法简单快速地测定牛乳中的κ-酪蛋白,因为该蛋白在酪蛋白中含量稳定,所以可以计算出牛乳中酪蛋白的含量。显然该方法可以用于牛乳掺杂使假的鉴别和原料奶酪蛋白含量是否合格的快速检测。     

酪蛋白和乳球蛋白的抗体及酶标物制备研究

选用牛乳中的β-酪蛋白(β-CN)和β-乳球蛋白(β-Lg)为抗原对鸡体免疫,从鸡卵黄中用水稀释法及亲和色谱(HiTrapTM IgY Purification HP)纯化特异性鸡卵黄抗体(IgY)。PAGE电泳分析IgY纯度高达90%,ELISA效价为1:4096。用过碘酸钠氧化法进行抗原的过氧化物酶(HRP)标记,HRP与β-CN和β-Lg的分子个数比分别为1:1和1.5:1的标记效果最好,β-CN-HRP和β-Lg-HRP的效价高达1:640,其ELISA工作浓度分别为1:80和1:40。特异性IgY和酶标抗原为特异检测牛乳蛋白的酶联免疫吸附(ELISA)分析提供必要条件。     

酶联免疫法快速测定原料乳中αs-酪蛋白质量浓度

用牛αs-酪蛋白纯品免疫新西兰白兔，制得兔抗牛αs-酪蛋白的多克隆抗体。以αs-酪蛋白包被抗原，自制抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗，邻苯二胺（OPD）为底物，建立了牛乳中αs-酪蛋白的间接ELISA检测方法。检测的线性范围是25～1200ng／mL，相关系数是0．9825，回收率在91．97％‖115．61％之间，证明可以用酶联免疫法简单快速地测定牛乳中的αs-酪蛋白，因为该蛋白在酪蛋白中质量浓度稳定，所以可以计算出牛乳中酪蛋白的质量浓度。显然该方法可以用于牛乳掺杂使假的鉴别和原料奶酪蛋白质量浓度是否合格的快速检测。     

牛乳β-酪蛋白检测的间接ELISA方法

将从干酪素中提取的牛β-酪蛋白对新西兰白兔进行多次皮下免疫注射.采集血清并用硫酸铵沉淀法进行抗体纯化,以制备兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体.最后将纯化的抗体用于间接ELISA法检测牛乳β-酪蛋白的含量.     

冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法的建立及应用

本文研究了冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)的双抗体夹心酶联免疫检测方法(sandwich-ELISA法),以抗MTG兔多抗为包被抗体,抗MTG鼠单抗为检测抗体,再结合HRP标记的抗IgG1二抗,构成sandwich-ELISA检测方法,对冷冻鱼糜中是否添加MTG进行定量检测,防止冷冻鱼糜原料掺假。实验结果表明,包被抗体的最佳工作浓度是2.00μg/mL,检测抗体的最佳工作浓度为0.10μg/mL,酶标二抗的最佳稀释倍数为1:5000。方法的检测限为20 ng/mL,该检测方法在0.6 mg/mL~10 mg/mL范围内OD450值与MTG浓度的log值呈线性关系。建立掺假冷冻鱼糜样品模拟体系,测定其中MTG的添加量:MTG的添加回收率为94%以上,测定过程中回收率结果的板内变异系数为1.12%~4.02%,板间变异系数为5.43%~6.87%。经试验证明该方法灵敏度高,样品前处理简便,适用于冷冻鱼糜中MTG的定量检测。     

低聚半乳糖糖基化法降低牛乳αs1-酪蛋白抗原性和免疫原性

用等电点沉淀法从牛乳中提取酪蛋白,根据αs-酪蛋白对尿素溶液溶解特性从酪蛋白中提取αs-酪蛋白,并用阴离子交换层析使αs1-酪蛋白与αs2-酪蛋白分离。用低聚半乳糖通过在一定条件下的美拉德反应对αs1-酪蛋白进行糖基化处理,通过竞争ELISA实验检测αs1-酪蛋白糖基化产物的抗原性。结果表明,该糖基化产物的抗原抗体结合常数Kd较αs1-酪蛋白上升3.7倍,即低聚半乳糖糖基化处理使αs1-酪蛋白的抗原性得到显著降低。用动物实验和非竞争ELISA实验检测αs1-酪蛋白糖基化产物的免疫原性,结果显示免疫原性降低19%,该实验证实对降低牛乳αs1-CN抗原性和免疫原性具有显著效果,为开发较理想的、切实可行的新脱敏奶粉生产技术提供了科学依据。     

水牛乳中蛋白质基于RP-HPLC指纹图谱的建立及在乳源分析中的应用

以水牛的乳蛋白多态性规律,κ-CN/A、α_(s2)-CN、κ-CN/B、α_(s1)-CN、β-CN、β-LgB、α-La在液相色谱中的分离特征和峰面积作为评价指标,对不同来源的水牛乳和荷斯坦牛乳建立指纹图谱快速区分鉴别水牛乳掺假。选择ZORBAX 300SB-C8(4.6 mm×150 mm,3.5μm)色谱柱;检测波长为215 nm;柱温:45℃;流速:0.5 mL/min;流动相:0.1%TFA水溶液:0.1%TFA乙腈进行梯度洗脱。结果:在精密度、重复性和稳定性实验中,分离出的κ-CN/A、α_(s2)-CN、κ-CN/B、α_(s1)-CN、β-CN、β-LgB、α-La峰面积相对标准偏差(RSD%)5%;根据水牛与荷斯坦蛋白多态性的差异,对乳蛋白进行分离后建立指纹图谱,通过相似性计算水牛乳和荷斯坦牛乳样品间的相似性均大于0.95,相关性高。通过指纹图谱对比发现特征峰,作为掺假标记,当荷斯坦牛乳掺入2%时可被检测到,在掺入5%～40%荷斯坦牛乳的范围内,相关系数大于0.99。该方法具有良好的重现性和专属性,能够得到样品间具有代表性的指纹图谱,能快速稳定地分析水牛乳中是否掺入荷斯坦奶源。     

测定三种乳蛋白抗原性间接竞争ELISA法的建立

为检测牛乳中主要致敏蛋白的抗原性,以商业兔抗αs-酪蛋白、兔抗β-乳球蛋白、兔抗牛血清白蛋白(BSA)多克隆抗体为一抗,标记HRP的羊抗兔Ig G为二抗,TMB为底物,对牛乳中主要致敏蛋白:αs-酪蛋白、β-乳球蛋白、BSA建立间接竞争ELISA(ic ELISA)。结果表明,αs-酪蛋白、β-乳球蛋白及BSA抗原包被质量浓度分别为5,2和2μg/m L。一抗最佳稀释倍数分别为1∶800,1∶400和1∶300。建立的三种蛋白的ic ELISA的线性检测范围分别为15.625~1 000 ng/m L、31.25~1 000 ng/m L和62.5~2 000 ng/m L。三种乳蛋白包被条件均为4℃,12 h,酶标二抗的最佳稀释倍数为1∶1 200,以1%的明胶作为封闭液。三种乳蛋白ic ELISA的3个浓度添加试验的批内及批间最大变异率分别为5.16%,7.46%,6.6%和6.78%,6.81%,6.06%,三种蛋白建立的ic ELISA回收率在94.34%~109.92%。表明所建立的方法重复性好,灵敏度高,可用于牛乳中此三种蛋白致敏性的测定。     

不同品种原料乳理化特性分析

主要分析荷斯坦牛、牦牛、娟珊牛、摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、Ⅰ代杂交水牛、高代杂交水牛等7个品种的原料乳的常规营养成分,并对原料乳中蛋白质和氨基酸组成及牛乳缓冲能力进行测定。结果显示：摩拉水牛、尼里-拉菲水牛、Ⅰ代杂交水牛和高代杂交水牛的乳脂肪含量分别为6.86%、7.99%、8.34%、8.69%,蛋白质含量分别为5.75%、5.14%、5.78%、5.58%,干物质含量分别为17.07%、18.79%、19.73%、19.88%,显著高于其他3种牛乳;牦牛和娟珊牛乳中乳糖含量分别为5.09%、5.17%,显著高于其他5种牛乳。SDS-PAGE显示：水牛乳中除含有牛乳血清蛋白(BSA)、α-酪蛋白(α-CN)、β-酪蛋白(β-CN)、κ-酪蛋白(κ-CN)、β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La)主要蛋白外,还含有一些未定性蛋白;且水牛乳具有最好的缓冲性能,其次是牦牛乳和娟珊牛乳,荷斯坦牛乳缓冲性能最差。     

水牛乳蛋白质的组成

分析了摩拉水牛（M）、尼里-拉菲水牛（N）、一代杂交水牛（F1）、二代杂交水牛（F2）和高代杂交水牛（Fh）5个品代水牛的乳蛋白主要组分的相对百分比含量．同时分析了总氨基酸组成及钙、磷含量。结果表明，水牛乳蛋白的主要组分有：α-乳清蛋白（α-LA）、β-乳球蛋白（β-LG）、免疫球蛋白轻链（IgG—L）和重链（IgG—H）、αs1-酪蛋白（αs1-CN）、αs2-酪蛋白（αs2-CN），β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ—CN）、血清白蛋白（SA）和乳铁蛋白（LF）等；CN在水牛乳蛋白中占优势，与荷斯坦牛乳相比，水牛乳中CN的质量分数稍低，而且各品代水牛乳中的CN有显著性差异（P〈0．05）；乳清蛋白中β-LG含量最高；杂交水牛乳蛋白高于纯种摩拉水牛和尼里一拉菲水牛，差异显著（P〈0．05）：各品代水牛乳的氨基酸比例比较接近；不同品代水牛乳中钙、磷含量没有显著性差异。     

乳蛋白多态性和盐分布对牛乳凝乳性能的影响

研究不同基因型乳蛋白对牛乳凝乳特性的影响规律。采集1 071 头荷斯坦奶牛血样,分析κ-酪蛋白（κ-casein,κ-CN）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-LG）的基因型,在明确基因型的基础上,采集样品开展牛乳凝乳能力评价。在初步筛选的基础上,选择凝乳性能好、凝乳性能差和不凝乳样品各至少30 份,重复3 次,开展凝乳流变学特性、蛋白多态性及矿物离子分布分析。通过动态流变仪、电感应耦合等离子体质谱仪、毛细管电泳、高效液相色谱技术分析不同凝乳等级牛乳的凝乳时间,胶体钙、镁、磷含量差异,不同基因型导致蛋白多态性及含量对牛乳凝乳能力的影响。结果显示,在所有奶牛组中,β-LG的AB基因型（占比48.48%）最常见,但AA型基因（30.97%）的原料乳凝乳效果较好;κ-CN的BB基因型（12.00%）凝乳效果较好,较AA、AB等其凝乳时间更短和凝胶强度更强。凝乳性能好的样品中CN含量及胶体钙含量较高,pH值较凝乳性能差和不凝乳样品低,凝乳时间与κ-CN含量呈反比,酪蛋白和乳清蛋白组成和基因频率的变化会影响牛乳凝乳性能的变化。     

Κ-酪蛋白基因多态性与牛乳加工性能的关联

为比较不同κ-酪蛋白基因型牛乳在加工特性上的差异,采用流变仪等仪器检测不同基因型牛乳的流变性能、热稳定性、表面疏水性、抗氧化性及乳化性。研究结果表明这几种κ-酪蛋白基因型牛乳之间热稳定性、表面疏水性和抗氧化性没有显著差异,而κ-酪蛋白基因型AB和AA牛乳的流变性能显著好于AE和BE,且AE的乳化性能显著强于其它3种基因型的牛乳,这表明κ-酪蛋白基因多态性与乳品加工之间存在关联。     

纳米胶体金的制备及其抗体标记研究

研究通过光谱扫描,确定了柠檬酸钠还原法制备纳米胶体金的最佳条件:100mL0.01%四氯金酸溶液中添加1%柠檬酸钠2mL,反应10min,制备的胶体金粒径为15～20nm,并将其与抗牛β-酪蛋白IgG连接制得了胶体金标记抗体,通过考马斯亮蓝法测得蛋白标记率为74.5%,采用间接ELISA方法测得金标抗体的效价在1∶4000以上,抗体金标后活性良好,可以满足免疫检测的需要。     

检测赭曲霉毒素A(OTA)的酶联免疫吸附法(ELISA)体系的建立

本文分别以自制抗-OTA兔血清抗体(IgG)及鸡卵黄抗体(IgY)就影响检测OTA的ELISA(酶联免疫吸附法)体系因素进行了探讨,建立了检测OTA的ELISA方法。鸡卵黄抗体的最佳ELISA操作参数为:包被抗原浓度为7.5μg/ml,封阻剂浓度为2.5%,抗体稀释倍数为1000,酶标二抗稀释倍数为14000;兔血清抗体的最佳ELISA操作参数为:包被抗原浓度为2.5μg/ml,封阻剂浓度为2.5%,抗体稀释倍数为8000,酶标二抗稀释倍数为10000。IgG和IgY的检测灵敏度分别为10ng/ml和1ng/ml。     

牛羊乳酪蛋白制备及电泳分析比较

采采用新鲜和复原的牛羊乳为原料,等电点沉淀,通过洗涤、干燥等步骤分别制得牛乳和羊乳酪蛋白,用凯氏定氮法对其进行定量检测,应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析比较牛羊乳酪蛋白组分差异。结果表明：牛乳酪蛋白得率为86．75％,羊乳酪蛋白得率为90．55％,高含量的酪蛋白主要集中在电泳图谱的中分子量组,可分为ds,CN、as2-CN、β-CN和K—CN,牛羊乳as2-CN分子量羊乳大于牛乳,牛乳a-CN含量比较多,羊乳β—CN含量比较多,鲜乳与复原乳全蛋白主要组分在电泳图谱中除酪蛋白差别外,上端的高分子量组清蛋白区羊乳IgG重链的分子量比牛乳小。应用蛋白质电泳分析技术可以区分羊乳和牛乳的蛋白质组分,等电点沉淀法制备酪蛋白的方法简单,易于操作。     

德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵对牛乳中β-酪蛋白抗原性的影响

复原脱脂牛乳经德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵至凝乳,然后在4℃下冷藏5 d。用间接竞争ELISA法测定了其中β-酪蛋白(β-CN)的抗原残留量,并且对发酵样品的蛋白水解程度与滴定酸度进行了分析。结果表明,复原脱脂乳经90～95℃处理5 min后,β-CN的抗原残留量为60.25%,发酵过程中其抗原残留量持续下降,凝乳时下降到55.46%,而冷藏1 d后降到了最低值54.03%,随后又缓慢上升,冷藏3 d后为55.87%,继续冷藏至5 d,β-CN的抗原残留量基本没有变化,维持在55.5%与55.9%之间。因此采用德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵能够在一定程度上降低牛乳中β-CN的抗原性,但是在冷藏5 d的过程中其抗原性又有一定程度的升高。     

同位素稀释质谱法测定乳及含乳饮料中的酪蛋白含量

目的建立同位素稀释质谱法对以牛乳、乳粉为原料的饮料中4种不同亚型的酪蛋白进行含量测定。方法样品溶解后,经等电点沉淀法提取其中的酪蛋白,将样品复溶液稀释至适当浓度,取适量稀释液同时混入多肽同位素内标,加入胰蛋白酶酶解16 h,使用甲酸停止酶解反应,定容后离心,取上清液分析;以WATERS ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×50 mm,1.8μm)作分析柱,用0.3%(V:V)甲酸-水和乙腈作为流动相,梯度洗脱分离。质谱采用ESI正离子模式检测,多反应监测模式进行采集,内标法定量分析。结果 4种不同亚型的酪蛋白特征肽段在4 min内达到基线分离,αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白在0.05~8μmol/L浓度范围内线性良好,αs2-酪蛋白在0.01~5μmol/L浓度范围内线性良好,相关系数均在0.9990以上。αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白的方法检出限均为3 nmol/L,定量限均为10 nmol/L,αs2-酪蛋白的方法检出限为1.6 nmol/L,定量限为5 nmol/L。阴性基质加标的复溶液中,β-酪蛋白浓度在0.5、2.0、5.0μmol/L 3个水平下的平均回收率为62.21%~84.36%,相对标准偏差为3.37%~5.50%。采用该方法分别测定了豆奶粉、白咖啡饮品和液体乳饮料中的酪蛋白含量,结果表明3种样品中均含有4种不同亚型的酪蛋白,且含量各不相同。结论该方法灵敏度高、特异性强,可以准确快速地测定乳及含乳饮料中酪蛋白含量。