双抗夹心酶联免疫吸附快速检测冷鲜肉中的6 种血清型沙门氏菌

为快速检测冷鲜肉中的沙门氏菌,筛选出1 株产抗6 种沙门氏菌单克隆抗体的细胞株,运用产生的抗体建立酶联免疫吸附检测方法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。实验采用6 种血清型致病沙门氏菌制备出混合抗原,对BALB/c小鼠及新西兰大白兔进行免疫,运用杂交瘤技术进行细胞融合,制备出抗沙门氏菌单克隆抗体以及多克隆抗体,并建立双抗夹心ELISA体系检测冷鲜肉中沙门氏菌。结果表明,成功筛选出1 株能稳定分泌抗沙门氏菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株6E7,保藏编号为CGMCC 10313以及多克隆抗体,效价分别为1∶1.28×106和1∶8.0×105 ;将多抗作为包被抗体吸附于96 孔酶标板上,并用辣根过氧化物酶标记单抗,建立双抗夹心ELISA体系;检测模拟污染肉样中沙门氏菌,其检测限为800 CFU/g;并与其他血清型沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌均无交叉反应,特异性良好。     

水产品中志贺氏菌双抗夹心ELISA检测方法建立与应用

志贺氏菌（Shigella）通称痢疾杆菌,是一类具有传染性强和危害严重的革兰阴性食源性致病菌,广泛污染各类动物源性食品。该研究将志贺氏菌经0.5%福尔马林溶液灭活后,多次免疫雌性大耳兔获得抗志贺氏菌多克隆抗体,以抗志贺氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记抗志贺氏菌多克隆抗体作为检测抗体,建立快速检测志贺氏菌双抗夹心酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法。结果表明：建立的双抗夹心ELISA方法检测曲线的线性范围为4.12×104cfu/mL～3.4×106cfu/mL,检测限为4.12×104 cfu/mL;用此体系检测大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌及副溶血弧菌等无交叉反应;水产品实际样品志贺氏菌检出限（limit of detection,LOD）为105cfu/mg,具备较好的灵敏性和特异性。     

牛奶样品中志贺氏菌胶体金免疫试纸条检测方法的建立

通过用超声波破碎的宋内氏志贺氏菌和福氏志贺氏菌的菌体碎片为免疫原免疫BALB/c小鼠,获得4株能稳定分泌抗志贺氏菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选取其中一株制备单抗,并用胶体金标记。同时抗志贺氏菌的兔多抗和驴抗鼠抗体(二抗)分别喷涂于硝酸纤维素膜作为检测线(T线)和质控线(C线),研制了志贺氏菌胶体金快速检测试纸条。结果显示试纸条的灵敏度为105mL-1,并只与两株志贺氏菌有阳性反应外,而与其它23株常见的细菌无交叉反应。同时在检测添加有阪崎肠杆菌和长双歧杆菌的牛奶样品中,结果显示试纸条的灵敏度为106mL-1。志贺氏菌免疫胶体金试纸条的建立,为加强食品中志贺氏菌的检测工作,建立一种快速、简便的筛查方法具有重要的意义。     

一种快速筛查志贺氏菌的荧光纳米免疫层析方法的建立

本文以建立志贺氏菌荧光纳米颗粒免疫层析法为目的。首先,制成志贺氏菌单抗-荧光纳米颗粒偶联物,以双抗体夹心模式制备志贺氏菌免疫层析试纸条。利用微型手持荧光检测仪读出质控线和检测线上的荧光信号,并利用荧光强度来半定量检测志贺氏菌。结果显示:用本研究建立的荧光纳米颗粒试纸条检测30株菌,对宋内志贺氏菌和福氏志贺氏菌呈阳性结果,其余菌株的呈阴性结果,试纸条灵敏度为9.0×104 CFU/m L。用志贺氏菌免疫层析试纸条和标准法检测60份样品,两种方法的总符合率为88.3%。结论:本研究成功建立了志贺氏菌的荧光纳米免疫层析检测方法,能够快速检测志贺氏菌,具有良好的特异性和灵敏性,便于开展现场快速检测。     

小麦球蛋白单克隆和多克隆抗体制备及建立酶联免疫吸附法快速检测技术

目的建立小麦球蛋白的ELISA检测技术,用于蛋白质掺假以及过敏原成分的快速检测。方法从麦胚粉中提取球蛋白,抗原免疫Balb/c小鼠进行4次免疫后,通过脾脏细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备单克隆抗体,同时制备兔抗小麦球蛋白的多克隆抗体。通过棋盘滴定法,初步确定单克隆抗体和多克隆抗体的最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA。结果通过免疫和杂交瘤技术获得了抗小麦球蛋白的单克隆抗体,纯化后抗体的效价均达到1:107,通过免疫兔制备的多克隆抗体经纯化后效价在1:2.4×105左右,所建立的双抗体夹心ELISA方法最低检测限为10 ng/m L,与其他物种的蛋白不发生交叉反应。结论本文建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性和灵敏度,为建立乳品中小麦成分掺假及过敏原成分快速检测提供理论依据。     

抗志贺氏菌IgY的提纯及建立间接ELISA检测志贺氏菌

采用水稀释法提纯抗志贺氏菌IgY,检测10mg/mL纯化抗志贺氏菌IgY的效价为1∶320,并以此IgY为基础建立间接ELISA检测志贺氏菌,测定志贺氏菌纯培养液的检出限为105～106cfu/mL。对蜡样芽孢杆菌等10株不同菌株的检测结果表明,该方法对志贺氏菌有明显的检测特异性,对所测定的其它菌株无交叉反应。     

双抗夹心ELISA方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

采用0.5% 福尔马林灭活的单核细胞增生李斯特氏菌作为免疫原免疫日本大耳兔,获得抗单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体,并以此多克隆抗体作为捕获抗体,以抗单核细胞增生李斯特氏菌Internalin A(InlA)单克隆抗体作为检测抗体,建立快速、特异的检测该菌的双抗夹心ELISA 方法。结果表明：该方法对单核细胞增生李斯特氏菌纯培养液的最低检测量为1.7 × 105CFU/mL。在检测食品样品的实验中,食品样本对本方法干扰较小,运用选择性增菌液进行前增菌可提高该方法的准确性。     

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipa H基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44 min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16 fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3 CFU/m L;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8 CFU/m L。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。     

牛奶过敏原β-乳球蛋白的单克隆抗体制备及其双抗体夹心法的建立

目的制备与鉴定牛奶主要过敏原β-乳球蛋白(β-LG)的单克隆抗体,并建立双抗体夹心检测法。方法以β-LG为抗原免疫BALB/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1。半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体。利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。间接ELISA方法和Western Blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏原的交叉反应性。建立双单克隆抗体夹心法,检测β-LG。结果共获得抗β-LG细胞株6株,分别命名为1H8,4A7,4C3,1F9,1G5,3D11,效价均高于20万。经抗体亚型鉴定,6株抗体均为Ig G1型。Western Blot的结果表明6株抗体能识别β-LG。在特异性检测实验中,6株抗体与其他种类食物过敏原无交叉反应,而1G5和3D11与牛奶酪蛋白过敏原有交叉反应性。通过建立双单克隆抗体夹心ELISA法,发现牛奶β-LG蛋白的检出低限为:15.625 ng/m L,标准曲线在15.625~250 ng/m L范围内线性良好。结论获得高效价抗体6株,建立了高效、高特异性的牛奶过敏原β-LG的检测方法,为食品中牛奶过敏原的检测提供了依据。     

单增李斯特菌单克隆抗体的研制及特性分析

运用辐照法和热灭菌法自制单增李斯特菌的免疫原、检测原,运用尾静脉免疫方法免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术进行细胞融合,制备得到抗单增李斯特菌的单克隆抗体,并对其进行免疫学特性分析。结果表明,成功筛选4株能稳定分泌抗单增李斯特菌的单克隆杂交瘤细胞株,腹水抗体效价为1∶102 400~1∶409 600,免疫球蛋白亚型为Ig G1、Ig2a、Ig2b,亲和力常数在1×107~1×1010L/mol;经测定分析出最佳配对抗体;并与绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌及大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等菌属无明显交叉反应;进行双抗体夹心ELISA方法对模拟单增李斯特菌污染肉样检测其灵敏度达1×103 CFU/m L。获得高效价、特异性强、灵敏度高的单克隆抗体,为食品中致病菌单增李斯特菌残留的免疫学检测方法奠定了基础。     

检测阪崎肠杆菌间接ELISA方法的建立

建立阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii,ES)特异性抗体间接ELISA检测方法,以期作为融合后杂交瘤细胞株的筛选体系。应用灭活的阪崎肠杆菌菌体为抗原,筛选最佳反应条件,建立检测该病原菌的酶联免疫吸附检测方法。通过对ELISA反应条件优化,确定菌体抗原包被的最适工作浓度为2×105mL-1,4℃包被过夜;5%脱脂奶粉进行封闭;血清最佳稀释比为1∶2 000;酶标抗体最适稀释度为1∶1 000倍;最后确定37℃显色10 min,检测灵敏度达到103mL-1。该方法的建立为阪崎肠杆菌单克隆抗体制备过程中阳性杂交瘤细胞株的筛选提供有效手段和奠定实验基础。     

抗赭曲霉素A单克隆杂交瘤细胞系的建立及特性

为快速检测食物中的赭曲霉素A ,建立了抗OchratoxinA的单克隆杂交瘤细胞株。用OA -匙孔嘁血蓝素 (OA KLH)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性Balb c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 3个稳定分泌抗赭曲霉素A抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 10G7、10G10和 5G11。将上述 3株杂交瘤细胞分别注入Balb c小鼠腹腔 ,获得含抗赭曲霉素A单克隆抗体的腹水。将腹水用饱和硫酸铵法纯化 ,得到 10G7、10G10和 5G11单克隆抗体。其中10G10、5G11单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,10G7单克隆抗体的Ig亚类为IgG2a。抗体腹水的稀释度为 1∶6 4× 10 6～ 1∶1 3× 10 8,参考工作浓度为 1∶1 0× 10 6～ 1∶3 2× 10 7。纯化后 10G7抗体的IgG含量为 16 4g L ,亲和常数为 9× 10 -8mol L。 10G7抗体与其它结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。     

不同杂交瘤细胞株单链抗体的构建及性质比较

不同的杂交瘤细胞株,分泌的抗黄曲霉毒素单克隆抗体的灵敏度也大不相同,通过筛选获得三株杂交瘤细胞,分别命名为2C10、2E6和2H1,其中2C10分泌的单克隆抗体在酶联免疫吸附(ELISA)试验中具有最高的灵敏度,2E6次之,2H1再次之。为了能够更好的展现和理解抗体和抗原之间的反应关系,以及最大程度的提高重组抗体的灵敏度,实验通过构建3株细胞株的单链抗体,并在E. coli BL21(DE3)中表达纯化单链抗体蛋白质,采用竞争ELISA法展现了不同的单克隆抗体与所对应的单链抗体灵敏度之间的关系。结果表明,灵敏度最好的单克隆抗体2C10所对应的单链抗体,其灵敏度也是最好的,2E6的次之,2H1的再次之。同时实验也表明,人工合成的单链抗体的灵敏度较其所对应的单克隆抗体的灵敏度要下降许多。     

抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体细胞株的筛选

研究筛选到抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体细胞株,用AFM1-oxim e-BSA偶联物免疫Balb/C小鼠后,取小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经过3次克隆和亚克隆得到两株稳定分泌抗黄曲霉毒素M1抗体的杂交瘤细胞株,经过检测两株均为IgG1亚类,并且经过鉴定其各项性质均符合标准。     

动物源性食品中抗司帕沙星单克隆抗体的研制与鉴定

为了制备高灵敏、高特异性的司帕沙星(SPFX)单克隆抗体,鉴定免疫学特性。采用蛋白质偶联技术DCC法制备免疫抗原SPFX-BSA和包被抗原SPFX-OVA,免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA和阻断ELISA选出产生优质多克隆抗体的的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗SPFX单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗SPFX的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明,间接ELISA检测显示免疫的6只小鼠效价均达1.28:10~4以上,融合后筛选出四株杂交瘤细胞株4H4-C8,4H4-C4,4H4-B1和4H4-E9;其细胞上清效价分别为1:1.4×10~3,1:8.0×10~2,1:5.0×10~2,1:6.7×10~2;4H4-C8株腹水效价为1:2.6×10~6,抗SPFX的单克隆抗体对SPFX的IC_(50)为31μg/L,且具有较好的特异性。本研究成功合成SPFX人工抗原,制备出优质的单克隆抗体,为SPFX免疫学快速检测方法的建立奠定坚实的基础。     

分泌猪PD-L1杂交瘤细胞株的稳定性研究概述

杂交瘤细胞分泌单克隆抗体,在制备单克隆抗体的过程中,尤为重要的环节是筛选分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。脾细胞和骨髓瘤细胞2个细胞融合而成的细胞是杂交瘤细胞,基因表达不稳定,培养传代或冻存过程中,轻易会缺失或大幅度使分泌单克隆抗体的能力下降,所以在筛选出特异性杂交瘤细胞株后的一段时间内,要多次检测其分泌抗体的能力。一般实验室研究通过杂交瘤细胞技术,前期筛选出一株能分泌猪PD-L1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3B5,利用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunodeficient assay,ELISA)来测定杂交瘤细胞3B5分泌单克隆抗体的上清效价,来研究杂交瘤细胞的稳定性,杂交瘤细胞株3B5在冻存后30天、60天和90天复苏,ELISA检测细胞培养上清的抗体效价。     

黄曲霉毒素M_1酶联免疫吸附检测方法的建立

建立单抗-多抗夹心酶联免疫吸附(ELISA)检测方法,为黄曲霉毒素M_1(AFM_1)的快速检测及研究奠定基础。采用有机合成法将AFM_1转化成半抗原AFM1肟化物(AFM1O),进一步与载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)和卵清蛋白(OVA)偶联合成完全抗原AFM_1-KLH和AFM_1-OVA;以AFM_1-KLH为免疫抗原、AFM_1-OVA为筛选抗原,采用杂交瘤技术制备AFM1单克隆抗体,以AFM_1-KLH免疫新西兰大白兔制备兔多克隆抗体;以AFM_1-OVA为标准蛋白,制备的单克隆抗体为捕获抗体,纯化的兔多克隆抗体为检测抗体,商品化HRP标记的山羊抗兔Ig G作为检测二抗,采用方阵滴定法优化各步检测条件,得到最佳试验条件,建立AFM1夹心ELISA检测方法。标准曲线方程为y=0.004 4x+0.002 1(R2=0.992 2),检测范围0.5 ng/m L~128 ng/m L;最低检测限为0.5 ng/m L,批内和批间差均小于10%,重复性良好。     

抗微囊藻毒素单克隆抗体的研制

为研制抗微囊藻毒素(Microcystins,简称MC)的特异性单克隆抗体,用MC-KLH偶联物免疫6～8周龄雌性BalB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经过3～4次亚克隆建立稳定分泌抗MC的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞注射入BalB/c小鼠腹腔,生产出抗MC的单克隆抗体。得到了抗微囊藻毒素单克隆抗体细胞株,命名为G5,抗体亚类为IgG2a,亲和力常数2.9×10-11mol/L,分子量150KD,加标回收率在81.5%～125.0%之间,与其他结构类似物的交叉反应率<1%。筛选出的抗微囊藻毒素单克隆抗体具有较好的特异性。     

沙丁胺醇单克隆抗体的制备及间接ELISA方法的建立

制备抗沙丁胺醇单克隆抗体,鉴定其特异性并建立间接竞争ELISA检测方法.以合成的沙丁胺醇完全抗原免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合,筛选克隆得到稳定分泌抗沙丁胺醇抗体的单克隆杂交瘤细胞,命名为4E4和3A2.经鉴定,两个抗体亚类都为IgG,,其腹水纯化后效价分别达到2.56 ×105和1.28 ×105.以效价高且特异性较好的4E4细胞株获得的抗体建立间接竞争ELISA方法,经条件优化后得到标准曲线,检测范围为4.76～84.99ng/mL,IC50为20.12ng/mL,检测限为3.25ng/mL,与克伦特罗交叉反应率为253.62%,与其它结构类似物没有明显交叉反应.本研究制备的单克隆抗体和建立的间接ELISA方法,可用于开发同时检测沙丁胺醇和克伦特罗的试剂盒.     

检测食品中志贺氏菌的双抗夹心ELISA方法的研究

研究获得纯化抗志贺氏菌IgY,经检测10mg/mL纯化抗志贺氏菌IgY的效价为1∶320;以志贺氏菌免疫新西兰大耳白兔,获得抗志贺氏菌的兔抗体,效价可达1∶12800。以此两种抗体建立双抗夹心ELISA,正交试验分析表明,兔抗体包被条件为4℃过夜,采用不封闭,抗原与包被抗体结合条件为37℃、1h;加入检测抗体(IgY)的浓度为0.25mg/mL,其结合条件为37℃、1h。该方法对纯培养菌液检出限为105cfu/mL,具有良好的敏感性;10株其他菌株的检测结果表明,该方法只与志贺氏菌发生特异性反应,不与其他菌株的抗原发生交叉反应。染菌的食品样品经选择性增菌后进行双抗夹心ELISA检测,含0.1～1cfu/mL志贺氏菌的样品在增菌13h后可检出阳性反应,含1～10cfu/mL志贺氏菌的样品在增菌11h后可检出阳性反应。