利用Illumina高通量测序技术筛选低温降解玉米秸秆真菌

玉米秸秆及根际土壤中纤维素降解菌资源丰富,本研究旨在分析其真菌群落结构及低温纤维素降解真菌的筛选。采集玉米秸秆及根际土壤,利用高通量测序方法对其中的真菌群落结构进行生物信息学分析,以羧甲基纤维素钠为唯一碳源,筛选低温纤维素降解真菌并通过ITS测序进行菌种鉴定。结果表明,对玉米秸秆及秸秆根部土壤测序共获得20715913 bp,共拼接成82250个基因片段,平均长度为249.29 bp,其中共发现5个真菌门,确定共有的优势菌属为Guehomyce;通过在15 ℃低温筛选、比较0、5、10、15 ℃低温下经刚果红染色产生的透明圈与菌落直径的比值得到3株产酶能力较强的纤维素降解真菌,分别为FB1、FB7、FB8。结合液态发酵测定其降解率分别是27.66%、21.53%、23.01%,最终确定菌株FB1分泌纤维素酶效果最好、降解效果最佳,经鉴定后确认为假枝孢菌(Cladosporium pseudocladosporioides)。     

基于高通量测序的冷冻南极磷虾中细菌菌群 结构分析

目的分析冷冻南极磷虾中总细菌菌群和可培养细菌菌群的结构特征。方法提取冷冻南极磷虾中宏基因组,通过高通量测序技术进行总细菌菌群分析;提取冷冻南极磷虾中可培养细菌菌落的总DNA,通过高通量测序技术进行可培养细菌菌群分析。结果冷冻南极磷虾中总细菌菌群多样性丰富,相对丰度大于1%的包括芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、嗜碱菌属(Alkaliphilus)、八叠球菌(Sarcina)、乳球菌属(Lactococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、土壤杆菌属(Sediminibacterium)、未分类菌(unclassified)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)以及苯基杆菌属(Phenylobacterium),占总量的85.04%。冷冻南极磷虾中可培养的细菌种类少,主要包括假交替单孢菌属(Pseudoalteromonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和嗜冷单胞菌属(Psychromonas),相对丰度分别为64.43%、33.47%和1.75%。可培养细菌中占优势的假交替单孢菌属、嗜冷杆菌属和嗜冷单胞菌属仅占总细菌菌群的1.10%。结论本研究初步揭示了南极磷虾细菌菌群的多样性和相对丰度,为进一步研究微生物与南极磷虾品质的相关性奠定基础。     

温度和培养基对雪莲菌菌群结构的影响

该实验分别在28℃和-80℃条件下用脱脂乳和MRS培养基培养雪莲菌粒，采用高通量测序和变性梯度凝胶电泳技术分别对上述不同处理的样品的细菌和真菌菌群结构进行分析。结果表明，经过低温处理的雪莲菌粒样品细菌菌群多样性下降，变形菌门(Proteobacteria)含量减少，厚壁菌门(Firmicutes)含量上升；优势菌属由醋酸杆菌属(Acetobacteria)变为乳杆菌属(Lactobacillus)，且脱脂乳培养基更有利于雪莲菌粒细菌菌群多样性的稳定。脱脂乳培养的雪莲菌粒真菌菌群结构在冻藏前后菌群结构相似，而在MRS培养基中雪莲菌粒冻藏后菌种丰度降低，特别是单孢酿酒酵母(Saccharomyces unisporus)。综上，低温处理会造成雪莲菌粒菌群多样性的下降，脱脂乳较MRS培养基更有助于雪莲菌菌群的稳定性。     

白酒酒醅纤维素降解菌的多样性分析及其分离筛选

为拓展纤维素降解菌资源,将浓香和清香型白酒酒醅样品富集培养于羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose,CMC-Na)液体培养基,利用变性梯度凝胶电泳技术(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)和平板培养法研究富集培养物的细菌多样性,筛选高效纤维素降解菌。DGGE结果显示,原始酒醅样品和富集培养物的细菌多样性无显著差异(p0.05),但群落结构相似性较低;富集培养物中的细菌分类于Acinetobacter、Bacillus、Klebsiella、Lactococcus、Paenibacillus。经刚果红水解圈、纤维素酶(carboxymethyl cellulase,CMCase)活力和滤纸条降解试验测定,获得3株纤维素降解力较强的细菌,分别为Paenibacillus sp.、Acinetobacter sp.和Gluconobacter sp.。由这3株细菌构建的复合菌系在液态发酵条件下对水稻秸秆和小麦秸秆均具有显著的降解作用,降解率分别为35.32%和28.89%。白酒酒醅蕴藏高效的纤维素降解菌,具有开发利用潜力。     

基于高通量测序的雪茄烟微生物群落结构和多样性分析

为探究雪茄烟产品细菌和真菌群落的结构和多样性,采用高通量测序技术对10个雪茄烟样品中细菌16S rRNA基因和真菌ITS基因进行测序检测,根据测序数据进行微生物物种丰度分析、α多样性分析、菌群结构分析和聚类分析。结果表明:(1)所分析的雪茄烟样品中细菌和真菌的多样性丰富,共检出360个细菌属和49个真菌属,其中细菌和真菌群落多样性最高的样品分别是HNL9和WG。(2)所分析的雪茄烟样品的优势菌门为厚壁菌门和子囊菌门,优势菌属为葡萄球菌属、不动杆菌属、假单胞菌属和曲霉属。(3)不同样品中细菌和真菌群落多样性和结构存在显著差异,聚类分析显示来自同一产地国的GXB和MT样品菌群分布比较相似。     

高通量测序分析混合菌群中的呕吐毒素降解菌

为筛选具有降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）能力的微生物,利用高通量测序方法分析混合菌群中的DON降解菌。从土壤中获得具有DON降解能力的混合菌群LG-6,并发现不同梯度稀释倍数的混合菌群之间DON降解效果具有明显差异。稀释至10－7时混合菌群LG-6-7能完全降解DON,而稀释至10－8时混合菌群LG-6-8不能降解DON。对这2?个混合菌群的微生物多样性进行分析,发现混合菌群LG-6-7包括假苍白杆菌属、节细菌属、假单胞菌属、代尔夫特菌属和德沃斯氏菌属,而混合菌群LG-6-8包括假苍白杆菌属和节细菌属。故推测假单胞菌属、德沃斯氏菌属和代尔夫特菌属在降解DON的过程中必不可少。此外,假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合培养时,48?h内完全降解DON。该混合菌群培养温度为37?℃、pH?7.0,培养基为MMT培养基,并发现该混合菌群是通过微生物代谢产生的酶对DON进行降解。本研究发现能完全降解DON的假单胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群,为呕吐毒素生物脱毒剂的研发提供一定理论依据。     

库车小白杏内生细菌多样性及其产酶特性

分析采后库车小白杏果实内生细菌多样性,挖掘潜在的微生物资源及功能。利用高通量测序法对采后库车小白杏内生细菌结构组成进行分析,同时,采用传统分离培养法对内生细菌进行分离筛选,并对所获得的菌株进行16S rRNA基因序列分子鉴定,进而对相关菌株的产酶特性进行分析。高通量测序结果显示,采后库车小白杏内生细菌共包括406个操作分类单元,涉及9个门,94个属。其中,拟杆菌属(Bacteroidetes)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)和未分类菌群等物种多样性最为丰富。通过分离筛选共获得99株菌,分别归属于放线菌门(Actinobacteria)、变形杆菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)4个菌门的28个属。同时,获得7个未在高通量测序结果中检出的属类群,发现潜在新种5个。实验获得了一批蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶和果胶酶产生菌。本研究的开展为深度挖掘库车小白杏果实中的潜在微生物资源及相关酶制剂的筛选和研制提供丰富的材料,同时,也为从微生物角度揭示小白杏腐败变质等研究提供新思路。     

基于高通量测序和可培养方法的勐海发酵普洱茶细菌多样性分析

以勐海地区百中堂茶厂发酵普洱茶为研究对象,采用高通量测序技术,并结合传统可培养方法,对普洱茶从晒青毛茶原料到发酵完成过程中9个时间节点的细菌多样性进行了研究。结果表明,普洱茶发酵过程中细菌多样性丰富。高通量测序数据分析到61个属,212个OTU,发酵前期以欧文氏菌属(Erwinia sp.)、泛菌属(Pantoea sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)为主,而发酵中、后期芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)及小短杆菌属(Brachybacterium sp.)为优势菌群稳定存在。通过可培养方法,从发酵过程中分离到细菌18个属,30个种,优势菌属包括微杆菌属(Microbacterium sp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)、小短杆菌属(Brachybacterium sp.)、考克氏菌属(Kocuria sp.)、泛菌属(Pantoea sp.)和芽胞杆菌属(Bacillus sp.)等。     

基于高通量测序的湘派卤牛肉细菌多样性分析

目的:为湘派卤牛肉保鲜保味,延长货架期。方法:对不同贮藏时间(0,4,8,12,16 d)的湘派卤牛肉样品中细菌进行多样性测序。结果:高通量测序共获得有效基因序列1 116 813条,平均每个样品74 454条。Alpha多样性分析表明,LNR8d中细菌丰度最高,LNR4d中细菌丰度最低;细菌门水平结果表明,在贮藏期间,15个卤牛肉样品中的优势菌门主要有：厚壁菌门、变形菌门和蓝细菌门。细菌属水平结果表明,LNR0d的样品中优势菌属为芽孢杆菌属;LNR4d的样品中优势菌属为巨大球菌属;LNR8d的样品中优势菌属为肠杆菌属;在LNR12d的样品中优势菌属为芽孢杆菌属;在LNR16d的样品中优势菌属为unidentified＿Chloroplast。PCoA分析显示15个样品的组内样本之间距离较大,表明其菌群差异性较大。LEfSe分析表明,LNR4d～LNR16d样品中属水平下贡献最大的细菌菌群分别为巨大球菌属、微小杆菌属、乳杆菌属。结论:研究揭示了湘派卤牛肉贮藏过程中的细菌多样性,探索了湘派卤牛肉贮藏过程中的细菌变化情况及其优势菌属。     

采样方法对冷鲜鸡表面细菌DNA提取及高通量测序结果的影响

目的:比较涂抹法和冲洗法对冷鲜鸡表面细菌DNA提取及高通量测序结果的影响。方法:将4只冷鲜鸡对半分开,分别采用涂抹法和冲洗法采集其表面微生物,提取基因组DNA,对细菌16S rRNA基因V3~V4区进行聚合酶链式反应扩增,通过Illumina Hiseq测序平台对扩增产物进行高通量测序,使用QIIME等软件对测序序列进行分析统计。结果:两种方法采集的样品在细菌基因组DNA提取、菌群丰富度、多样性及菌群结构等方面均无显著差异(P0.05)。高通量测序结果表明,冷鲜鸡表面细菌菌群主要分布于7个门,10个属。变形菌门为优势菌门,占70%以上;希瓦氏菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、嗜冷杆菌属和环丝菌属为优势菌属,分别占10%~20%。结论:两种采样方法对冷鲜鸡表面细菌DNA提取及高通量测序没有明显影响,但冲洗法比涂抹法简单易行,且不易发生二次污染,因此更具有实用性。本实验同时也为冷鲜鸡表面细菌的研究提供了数据资料。     

秸秆纤维素降解菌的分离筛选、复合菌系构建及产酶条件优化

该研究采用刚果红染色法和滤纸条崩解法从山西老陈醋源中分离筛选纤维素降解菌,通过形态观察及分子生物学技术对其进行菌种鉴定。以滤纸酶活性为筛选指标构建复合菌系,采用单因素试验及响应面试验对其产酶发酵条件进行优化,并评价其对不同秸秆的降解效果。结果表明,筛选出3株纤维素降解菌,编号为J1、J2和J3,分别被鉴定为灿烂类芽胞杆菌（Paenibacillus lautus）、千叶类芽胞杆菌（Paenibacillus chibensis）和窖泥类芽胞杆菌（Paenibacillus vini）。3株菌等比例复配得到最佳复合菌系D,其最优产酶发酵条件为初始pH 7.4,接种量9%,发酵温度40℃。在此优化条件下,滤纸酶活性达到35.10 U/m L,是优化前的1.6倍。复合菌系D对不同秸秆均具有较好的降解效果,且对小麦秸秆的降解率最高,达27.63%。     

贵州不同地区“生花”糟辣椒中微生物多样性研究

采用Miseq高通量测序技术、传统培养分离法对贵州不同地区的“生花”糟辣椒中微生物进行多样性分析和菌种分离，获得引起糟辣椒“生花”现象的主要微生物。结果表明，4个样品微生物菌相丰度和多样性及传统分离的菌种差异较大，获得细菌和真菌的有效序列分别为97 306条、288 570条。在门水平上，共检测出4个主要细菌门和1个真菌门；在属水平上，共检测出13个主要细菌属及3个主要真菌属。通过基于16S rDNA、ITS测序鉴定并结合菌株发酵特性试验和回接验证试验，获得可引起糟辣椒出现“生花”现象的4株酵母菌分别为库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevi）、膜璞毕赤酵母（Pichia membranifaciens）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。该研究结果为糟辣椒的保质技术奠定了基础。     

应用MiSeq测序分析自然发酵豆酱酱块中微生物的多样性

为探究传统自然发酵豆酱酱块中微生物多样性,本文首次应用Miseq测序对采自沈阳胡台的6家传统自然发酵成熟酱块样品进行微生物测序分析。结果表明,在门水平上,细菌的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes),真菌为子囊菌门(Ascomycota);在属水平上,主要细菌为乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc),主要真菌为青霉菌属(Penicillium)、毛霉菌属(Mucor)。主成分分析(Principal component analysis,PCA)结果显示,同一地区不同农家制作的酱块,绝大多数样品的微生物细菌菌群之间都存在紧密联系。     

丹江镇辣椒红酸汤细菌菌群多样性分析及抗食源性致病菌乳酸菌筛选

以贵州丹江镇传统辣椒红酸汤为研究对象,采用Illumina MiSeq高通量测序技术进行细菌菌群多样性分析,结合微生物纯培养技术和双层平板法从中分离优势乳酸菌,通过分子生物学技术对其进行菌种鉴定,并筛选抗食源性致病菌乳酸菌。结果表明,辣椒红酸汤样品中的优势细菌门为厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）;优势细菌属为乳杆菌属（Lactobacillus）。从辣椒红酸汤样品中共分离得到17株乳酸菌,经鉴定,11株为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、3株为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、1株为副干酪乳杆菌亚种（Lactobacillus paracasei subsp.）、1株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、1株为乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）,其中4株乳酸菌具有较好的产酸和抑菌性能,且干酪乳杆菌ST7-14的抑菌能力最好,对蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）ST2-1和阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）ST2-6的抑菌圈直径分别为37.0 mm和31.5 mm。     

传统自然发酵黏豆包关键酵母的筛选鉴定

目的 筛选适宜谷物黏豆包发酵的酵母菌菌株。方法 以采集自黑龙江省不同地区的传统自然发酵黏豆包谷物发酵液为研究对象, 通过高通量测序技术, 分析发酵液中微生物多样性, 再利用传统培养法对发酵液中的酵母菌进行分离, 筛选出耐低温、耐低pH、起酵时间快和酵香风味好的酵母菌株。结果 通过高通量测序结果显示, 在真菌菌属水平上, 3个地区样品共包含5个门、30个属、30个种, 微生物群落为酿酒酵母属(Saccharomyces)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、毕赤酵母属(Pichia)等, 其中酿酒酵母属为首要优势菌属, 次级优势菌皆为威克汉姆酵母属。在此基础上, 利用平板划线分离出21株酵母菌, 通过分子生物学鉴定, TY5、TY9和AC6为酿酒酵母, TY8和SC4为威克汉姆酵母, AC3为热带假丝酵母, SC3为季也蒙毕赤酵母, SC5为胶红酵母; TY5、TY8、TY9、AC6、SC6在pH为3、15℃条件下具有较好的生长性能, 其中菌株TY9和AC6具有较强的耐酸性及耐低温性, 且起酵时间快, 菌株TY9发酵风味最好, 呈现较强的谷物发酵风味。结论 筛选出一株耐低温、耐低pH、起酵时间快和酵香风味好的菌株, 经鉴定为酿酒酵母。本研究为东北黏豆包酸面团发酵菌剂的开发提供了理论基础。     

三代全长高通量测序分析新稻草和陈稻草的微生物特征

通过传统培养法和三代全长高通量测序技术分析高温大曲培菌发酵过程中使用的新、陈稻草的微生物组成和代谢通路的差异。结果表明，陈稻草样品中菌落总数、耐热菌和真菌数量显著高于新稻草（P＜0.05）。两种稻草的群落结构存在差异，主要体现在细菌群落，新稻草中主要优势细菌属为泛菌属（Pantoea）和伯克霍尔德菌属（Burkholderia），而陈稻草为芽孢杆菌属（Bacillus）和糖多孢菌（Saccharopolyspora）。四折叠球菌属（Quadrisphaera）、微杆菌属（Microbacterium）、曲霉属（Aspergillus）、孢堆黑粉菌属（Sporisorium）等是新稻草中的标志菌属，而糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、变形闭囊鞘属（Chromocleista）和节担菌属（Wallemia）等是陈稻草中的标志菌属。新稻草中的细菌在L-色氨酸生物合成、L-精氨酸/腐胺/4-氨基丁酸降解和甲基乙二醛降解所占功能丰度更高，而陈稻草中的真菌在辛烷氧化、L-色氨酸降解和硝酸盐还原途径中的功能丰度更高。     

应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析巴东地区豆瓣酱中微生物多样性

为了解湖北省恩施市巴东地区豆瓣酱中微生物的多样性,采用Illumina MiSeq高通量测序技术,分析豆瓣酱中细菌16S r RNA及真菌18S rRNAV4区基因序列,进而比较豆瓣酱微生物的群落结构组成及多样性差异。结果 3个样品共获得117644条有效序列,867个OTUs数目。多样性分析表明,豆瓣酱中具有高度的微生物群落多样性。微生物群落组成分析表明,样品中子囊菌门(Ascomycota,95.84%)、变形菌门(Proteobacteria,47.13%)、厚壁菌门(Firmicutes,32.37%)、放线菌(Actinobacteria,12.87%)为优势菌门,所占比例都超过了10.0%。在豆瓣酱样品中分别鉴定出311个细菌属和16个真菌属,优势细菌和真菌属平均相对含量分别为8.09%和24.74%,细菌及真菌多样性在属的水平上差异显著(p0.05)。研究结果加深了对豆瓣酱微生物群落组成和多样性的认识,以期为巴东地区豆瓣酱中微生物菌种资源的发掘与保护提供理论依据。     

基于高通量测序技术分析汉中地区泡菜水细菌多样性

该研究采用Illumina MiSeq高通量测序技术对陕西省汉中地区泡菜水中的细菌构成进行解析,并采用生物信息学方法对其多样性进行分析,同时结合多元统计学等手段探讨汉中泡菜水中微生物结构的差异。结果表明,泡菜水样品中的细菌菌群主要隶属于24个门的553属,优势细菌门为硬壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）,其平均相对含量分别为89.12%和7.89%;优势细菌属为片球菌属（Pediococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和明串珠菌属（Leuconostoc）,其平均相对含量分别为52.06%、31.40%、4.89%和1.83%。汉中地区的泡菜水样品可以划分为两个聚类,隶属于不同聚类泡菜水样品的α多样性指数无显著性差异（P＞0.05）,但细菌菌群结构存在较大差异（P＜0.05）,且片球菌属和乳杆菌属的相对含量存在显著性差异（P＜0.05）。同时,不同聚类的泡菜水中均存在一些低丰度物种,且均为一些较为独特的细菌类群。     

秭归地区鲊广椒中乳酸菌及细菌多样性研究

该研究在采用纯培养方式对秭归地区鲊广椒中乳酸菌进行分离鉴定的基础上，进一步采用MiSeq高通量测序技术对其细菌多样性进行解析。结果表明，从14个鲊广椒中分离出的43株疑似乳酸菌被鉴定为乳酸杆菌属（Lactobacillus）和屎肠球菌属（Enterococcus），鉴定到的种主要有植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、敏捷乳杆菌（Lactobacillus alimentarius）和屎肠球菌（Enterococcus faecium），占所有分离株的86.05%，其中L. plantarum占所有分离株的60.74%，为优势菌种。测序结果显示，鲊广椒中主要的细菌类群为隶属于硬壁菌门（Firmicutes）的Lactobacillus和戊糖片球菌属（Pediococcus）以及隶属于变形菌门（Proteobacteria）的假单胞菌属（Pseudomonas），其平均相对含量分别为47.85%、13.29%和21.31%，其中乳酸菌含量累计达61.14%。由此可见，秭归地区鲊广椒中蕴含了较为丰富的乳酸菌资源，但同时也存在Pseudomonas等具有致病性的菌属。