鱼鳔类肝素的分离纯化与结构鉴定

本研究以鱼鳔为原料,采用酶法提取类肝素化合物,采用阴离子交换树脂吸附、氯化钠溶液梯度洗脱和醇沉法进行分离纯化;并进一步分析其结构特征,分别通过紫外光谱法、高效凝胶色谱分析其纯度和分子质量,醋酸纤维素薄膜电泳初步鉴定其种类,柱前衍生-高效液相色谱法分析其单糖组成,傅里叶变换红外光谱分析其官能团结构,酶裂解-质谱/质谱法测定其二糖组成,核磁共振鉴定其一级结构。结果显示：鱼鳔类肝素的得率为（2.21±0.03） mg/g,纯度较高,类肝素含量为（85.79±0.63）%,分子质量约为84 000 u;单糖组成为葡萄糖醛酸（glucuronic acid,GlcA）和N-乙酰基半乳糖胺（N-acetylgalactosamine,GalNAc）,同时含有少量的艾杜糖醛酸、半乳糖;电泳位移与硫酸软骨素相似,且具有羧基、乙酰氨基、硫酸基轴向伸缩等特征吸收峰。最终确定鱼鳔类肝素主要组成是由重复的二糖单位[→4GlcUA β1→3GalNAc(4S)β1→]构成的硫酸软骨素A。     

香椿籽多糖的分离纯化及其体外抗凝血活性

为研究香椿籽多糖(Polysaccharides of seeds of Toona sinensis,STSP)不同组分的体外抗凝血活性,以水提醇沉法得到的香椿籽粗多糖为实验材料,通过聚酰胺法脱蛋白、活性炭脱色,经离子交换柱DEAE Sepharose CL-6进行纯化。采用高效凝胶过滤色谱(HPGFC)和离子色谱分别对多糖的分子质量和其单糖组成进行分析,初步研究了纯化后的香椿籽多糖组分的体外抗凝血活性。结果表明:共得到4种纯化多糖组分即STSP-1、STSP-2、STSP-3、STSP-4;HPGFC法测定STSP-2、STSP-3皆为单峰,为均一多糖,其重均分子质量分别为13218 u和36080 u;单糖测定表明,香椿籽多糖主要由阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、氨基葡萄糖(GluN)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glu)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GluA)、半乳糖醛酸(GalA)组成。体外抗凝血实验表明,STSP-3能显著延长凝血酶原时间(Prothrombin time,PT)和凝血酶时间(Thrombin time,TT),表明其抗凝血活性是通过影响外源性途径、共同途径实现。实验结果为香椿籽多糖的纯化及资源利用奠定了基础。     

大蒜多糖的体外抗凝血作用及结构分析

采用碱提法和DEAE-52纤维素柱层析法,从大蒜中分离纯化出3种多糖组分(GPⅠ、GPⅡ和GPⅢ);采用体外抗凝血活性试验分析了大蒜粗多糖及其分离组分GPⅠ的抗凝血作用;采用SephadexG-100凝胶层析法和冻融分析法鉴定GPⅠ的纯度,采用气相色谱分析了GPⅠ的单糖组成,首次采用凝胶渗透色谱与多角度光散射仪及示差检测器连用系统测定了GPⅠ的分子结构。结果表明:GPⅠ、GPⅡ和GPⅢ分别为大蒜多糖总量的75.2%、15.5%、9.3%;大蒜粗多糖及其分离组分GPⅠ能显著延长人体血浆的APTT值,通过影响内源性凝血系统发挥抗凝血作用;GPⅠ由鼠李糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖及1种未知单糖组成,构成比例为1.5∶1.1∶3.3∶1∶5.1∶3.5,分子质量为5.2×104～5.6×104u,分子旋转半径为31.5～32.9nm,分布宽度指数为1.039和1.084,分子呈球形。     

鱼鳔类肝素提取工艺优化及抗凝血活性研究

以鱼鳔为原料,采用酶法提取类肝素,研究其提取工艺参数和体外抗凝血活性。在单因素试验基础上,以加酶量、酶解时间和温度为影响因子,类肝素得率为响应值,采用响应曲面法优化鱼鳔类肝素(HSB)提取工艺,并通过测定活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和血浆凝血酶时间(TT)评价其抗凝血活性。结果显示,最优提取条件为2709碱性蛋白酶添加量5.4 mg/mL,酶解温度50℃,时间20h,在该条件下类肝素得率为(1.79±0.05)%,与预测值相差3.24%;同时,所提取的类肝素具有一定的抗凝血活性,并通过外源性凝血途径和共同凝血途径发挥作用。     

微波辅助合成半乳聚糖及其结构分析

目的：研究半乳聚糖的快速、高效制备方法,并对产物进行结构分析。方法：在微波辐照下,以半乳糖为底物,氯化钠溶液为引发剂,杂多酸为反应催化剂,催化底物脱水缩合生成半乳聚糖,并通过乙醇沉淀去除催化剂和引发剂,Sephadex G-25葡聚糖凝胶柱分级纯化,高效凝胶渗透色谱分析半乳聚糖的纯度及聚合度,高效阴离子交换色谱分析单糖组成,最后通过红外光谱分析半乳聚糖的构型。结果：半乳聚糖的最优合成条件为引发剂浓度0.25 mol/L、催化剂添加量1.1%、反应温度130 ℃、微波辐照4.5 min,半乳糖转化率为97.22%。半乳聚糖的平均分子质量为2.853 kD,平均聚合度为17。单糖组成为半乳糖及微量葡萄糖。红外光谱及氢核磁共振波谱（1H-nuclearmagnetic resonance,1H-NMR）分析表明半乳聚糖残基以β-构型为主。结论：可以通过微波辐照杂多酸催化的方法快速、高效制备半乳聚糖。     

鸡胸软骨硫酸软骨素的制备及结构分析

首先分析了鸡胸软骨中主要营养成分,再用酶法提取生物活性多糖硫酸软骨素,并用三氯乙酸除蛋白、乙醇沉淀和柱色谱进行分离纯化得到高纯度产品。反相高效液相色谱和原子吸收光谱分析表明鸡胸软骨富含呈味氨基酸和钙、镁和锌等矿物元素。高效凝胶过滤色谱和琼脂糖凝胶电泳证明该纯化后的硫酸软骨素产品均一,纯度达到99%,其分子量为21007D。其红外光谱呈现4-硫酸软骨素的典型特征,没有发现6-硫酸软骨素存在。气相色谱分析发现其中中性单糖主要为葡萄糖、木糖和半乳糖,与猪喉软骨存在明显差异。     

仿刺参肠道多糖的纯化及理化分析

目的：对仿刺参肠道多糖进行纯化,并对纯化产物进行理化分析。方法：使用葡聚糖凝胶(G-100)层析柱分离出两种仿刺参肠道多糖,选取其中多糖A进行研究。使用葡聚糖凝胶(G-100)柱层析法和琼脂糖凝胶电泳法进行纯度检测,葡聚糖凝胶(G-200)柱层析测定分子质量,高效液相色谱法确定其单糖组分,并结合红外吸收光谱法与核磁共振对其结构进行初步检测。结果：实验所得纯化产物多糖A为均一组分,主要含有氨基糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐和岩藻糖3种单糖,并含有少量的氨基葡萄糖、半乳糖。其中岩藻糖有α和β两种构型,以α-岩藻糖硫酸酯残基、β-岩藻糖硫酸酯残基形式存在。分子质量约为18.8×104D。结论：该纯化产物多糖A为一种酸性多糖,推测其为硫酸软骨素类。     

双歧杆菌RH胞外多糖提取纯化及体外抗凝血活性评价

为得到高纯度双歧杆菌RH胞外多糖,并探讨其抗凝血功效,采用正交试验优化酶解提取工艺。优化最佳酶解条件为：蛋白酶添加量2 g/L,中性蛋白酶与胰蛋白酶质量比例为1∶2,在pH 7.5的条件下酶解120 min。再经凝胶Sepharose CL-6B柱层析纯化,得到胞外多糖纯品。利用凝胶色谱结合多角度激光散射仪测得该胞外多糖分子质量为5.946×104 D。进一步对其抗凝血活性进行评价,不同质量浓度胞外多糖可以显著延长活化部分凝血活酶时间和凝血酶时间,且具有剂量依赖效应。纯化后胞外多糖纯度可以达到97%以上,纯多糖具有较好的体外抗凝血活性,主要参与内源凝血途径。     

阿魏菇多糖的相对分子质量及单糖组成的测定

测定了阿魏菇多糖(Pleurotus ferulae Lenzi polysaccharide,PFLP)的相对分子质量和单糖组成,在理论上为深入探究PFLP的结构以及构效活性奠定了基础。PFLP利用离子交换柱层析(DEAE-52Cellulose)和凝胶柱层析(Sephadex G-100)进行初步和进一步分离纯化,紫外、冻融、电泳实验对其进行纯度鉴定。利用Sephadex G-100柱层析法测定相对分子质量,气相色谱分析其单糖组成。经过分离纯化、纯度鉴定后得到两种纯PFLP组分,分别命名为PFLP1、PFLP2,其相对分子质量分别为5 582、7 963。PFLP1由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,摩尔比为1︰1.66︰19.6︰3.98;PFLP2由鼠李糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,摩尔比为1︰0.40︰0.66︰6.76︰4.27。     

金针菇子实体多糖均一组分FVP60-C2制备及单糖组成分析

金针菇子实体经水提醇沉得水溶性粗多糖,再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱和凝胶柱层析纯化,得到均一多糖FVP60-C2;采用高效液相色谱、紫外-可见光光谱全扫描和傅里叶变换红外光谱研究其理化性质;样品经三氟乙酸水解,乙酰衍生化后,用单糖标准品作对照,用气相色谱分析其单糖组成。结果表明:FVP60-C2为均一多糖,平均分子质量为1.429×104D;其是由岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成的杂多糖,各单糖的物质的量比为0.74:0.21:1.36:1.00:1.31。     

黄皮疣柄牛肝菌多糖结构鉴定及对小鼠盲肠与粪便中短链脂肪酸的影响

本实验采用水提醇沉法从黄皮疣柄牛肝菌中提取粗多糖，经脱色、脱蛋白后得到黄皮疣柄牛肝菌多糖（polysaccharides from Leccinum crocipodium (Letellier.) Watliag，LCP），凝胶渗透色谱法测定LCP分子质量，高效液相色谱法测定LCP单糖组成，紫外光谱鉴定LCP纯度，红外光谱分析LCP结构，动物实验研究LCP对小鼠盲肠内容物及粪便中短链脂肪酸的影响。结果表明，该多糖单糖组成为甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖，其物质的量之比为4.34∶0.35∶0.08∶13.39∶3.35∶0.75∶1.80；重均分子质量为1.540×105 Da；红外光谱分析表明LCP是含有α-(1→6)糖苷键以及β-型糖苷键的吡喃型多糖；动物实验表明LCP对小鼠盲肠及粪便中乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸的产生都有较大影响，不同的灌胃剂量对小鼠产生短链脂肪酸的影响有较大差异，以高剂量LCP对短链脂肪酸的产生影响最大。     

驼乳和牛乳乳清蛋白抑菌肽的分离纯化及抑菌活性的比较

本文以驼乳和牛乳的乳清蛋白为原料,经胃蛋白酶水解后,通过超滤及葡聚糖凝胶层析对其水解物进行分离纯化,其后对获得的蛋白肽进行抑菌活性、二喹啉甲酸法(BCA)蛋白浓度、相对分子质量及氨基酸组成的测定。结果表明:经超滤获得的驼乳和牛乳分子量<3 kDa的多肽片段-F3具有最强的抑菌活性,将F3(<3 kDa)组分通过层析处理得到的驼乳G-25-2和牛乳G-25-2抑菌肽纯度较高(BCA蛋白浓度分别为95.60%和95.32%);驼乳G-25-2和牛乳G-25-2组分对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌作用,最小抑菌质量浓度分别均为32.50和65.00 mg/mL;氨基酸分析结果显示,高活性抗菌肽中的总碱性氨基酸和总疏水性氨基酸含量最高,驼乳G-25-2中分别为32.80%和65.76%,牛乳G-25-2中分别为31.77%和58.70%。本研究结果表明,驼乳与牛乳均具有抑菌效果,且其抑菌能力高于牛乳,为今后研究驼乳抑菌肽的深入研究提供理论参考。     

非肝素类天然抗凝血多糖的研究进展

血液凝固和血小板凝集是局部缺血性疾病发病的最重要的原因,诱发心血管和脑血管甚至全身各处的相关疾病。肝素类物质已被广泛应用于相关疾病的治疗,作用效果显著但副作用较大。本文介绍了非肝素类具有抗凝血功能的天然多糖类物质,其单糖组成主要是葡萄糖(醛酸)、半乳糖(醛酸)、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等,其中源于海洋的多糖均含有硫酸根,与多糖形成多糖硫酸酯类物质;而源于陆地的,一般不含硫酸根,含己糖醛酸或尿酸等酸性成分。不同来源的多糖其分子组成和结构差异较大,抗凝作用机理也不尽相同。本文着重阐述了海藻类、海洋无脊椎动物、植物及其果实、可食用菌等来源的抗凝血多糖结构特点、抗凝作用机理,希望能为高抗凝活性、低毒副作用的天然多糖类药物的进一步研究提供一定的参考。     

远志多糖的分离纯化、结构特征及生物活性

目的:分离纯化远志多糖(polysaccharide of Polygala tenuifolia,PTP),并对其理化性质、抗氧化和降血糖活性进行研究。方法:采用超声波辅助提取、分级醇沉、DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱色谱分离纯化远志多糖;紫外-可见光谱扫描法、比旋光度法、凝胶渗透色谱法3种方法验证纯度;高效凝胶渗透色谱法测定相对分子质量,高效阴离子交换色谱测定单糖组成;清除1,1-二苯基-2-苦味基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和羟自由基评价体外抗氧化活性;测定对α-葡萄糖苷酶抑制能力以研究其降血糖活性。结果:远志多糖经分离纯化后获得组分PTP-1,经3种方法验证PTP-1为均一性良好的多糖,相对分子质量为4.62×10~4,由半乳糖、葡萄糖、甘露糖组成,物质的量比为3.92∶1.00∶2.08。抗氧化活性研究结果表明,PTP-1对清除DPPH自由基和羟自由基呈良好的量效关系,半数清除率浓度IC_(50)分别为0.35 mg/m L和0.51 mg/m L。降血糖活性结果表明,PTP-1对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制能力,IC_(50)值为0.52 mg/m L。结论:远志多糖PTP-1为具有抗氧化和降血糖活性的均一多糖。     

Anticoagulant activities of goby muscle protein hydrolysates

The anticoagulant activities of protein hydrolysates prepared from goby muscle by treatment with various bacterial alkaline proteases were investigated. All proteases exhibited varying degrees of hydrolysis (DH) and all goby protein hydrolysates (GPHs) caused a significant prolongation of both the thrombin time (TT) and the activated partial thromboplastin time (APTT). The hydrolysate generated by the crude protease from Bacillus licheniformis NH1 displayed the highest anticoagulant activity, and the higher TT (about 32 s) at a concentration of 5 mg/mL was obtained with hydrolysate having a DH of 8.86%. This hydrolysate was then fractionated by size exclusion chromatography on a Sephadex G-25 column into five major fractions (F1–F5). Fraction F2, which exhibited the highest anticoagulant activity, was then fractionated by reversed-phase high-performance liquid chromatography. The molecular masses and amino acid sequences of four peptides in peptide sub-fraction F2–6, which exhibited the highest anticoagulant activity, were determined using ESI-MS and ESI-MS/MS, respectively. The structures of these peptides were identified as Leu-Cys-Arg, His-Cys-Phe, Cys-Leu-Cys-Arg and Leu-Cys-Arg-Arg.     

罗非鱼肌浆蛋白源抗氧化肽的制备、分离纯化及其体外抗氧化活性

采用木瓜蛋白酶对罗非鱼肌肉蛋白组分（肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白）进行酶解,研究罗非鱼不同蛋白组分酶解产物的抗氧化活性,并通过超滤、凝胶过滤色谱、反相高效液相色谱对高活性肌浆蛋白组分抗氧化肽进行分离纯化,同时对纯化后的抗氧化肽氨基酸组成予以分析。结果表明：罗非鱼肌浆蛋白酶解物（tilapia sarcoplasmic protein hydrolysates,TSPH）抗氧化活性高于肌质与肌原纤维蛋白酶解物,当肌浆蛋白酶解4 h时,TSPH（6 mg/mL）对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基、羟自由基清除率及其还原力均达到最高,分别为84.61%、50.01%和0.629;经超滤分离后,其分子质量小于5 kDa的组分具有较高的抗氧化活性;该组分经凝胶色谱分离后,富集得到E1～E4共4 个组分,其中E3组分（0.8～0.3 kDa）的抗氧化活性最高, 3 mg/mL E3组分对DPPH自由基清除率达83.61%,还原力为0.953;E3组分再经反相高效液相色谱分离纯化后,富集得到F1～F9共9 个组分,其中F4组分的抗氧化活性最高,其DPPH自由基的半清除质量浓度为0.78 mg/mL,且经氨基酸组成分析发现色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）为其含量较高的氨基酸,相对含量分别高达31.20%、27.25%和8.97%。     

高纯度诊断用乳酸脱氢酶的制备和酶促反应

设计并优化了植物乳杆茵发酵制备高纯度诊断用乳酸脱氢酶的技术路线．从培育的厌氧型植物乳杆茵中粗提乳酸脱氢酶制备液，经过DEAE Sepharose F．F．离子交换层析、Phenyl Sepharose6 F．F．疏水层析及Sephadex G-25 Fine凝胶过滤等方法进行分离纯化，比酶活达1096．8U／mg，纯度达88％，纯化倍数达到21．4倍，酶活力回收率为53．9％；高效液相色谱和SDS-PAGE电泳结果显示制得乳酸脱氢酶相对分子质量约为80000，含有两个亚基，每个亚基分子量约为39000．