检测鲜草莓中GⅡ型诺如病毒的两种富集方法比较

目的建立鲜草莓中GⅡ型诺如病毒(No V GⅡ)的实时荧光RT-PCR检测方法,评价磁珠富集法和PEG(聚乙二醇)沉淀法对检测草莓中No V GⅡ的适用性,对北京地区采集的18份草莓样品进行检测。方法参照ISO/TS 15216-1《实时荧光RT-PCR方法测定食品中甲型肝炎病毒和诺如病毒水平方法》合成检测No V GⅡ的特异性引物和探针,分别采用磁珠富集法和PEG沉淀法富集病毒,然后提取RNA,建立实时荧光RT-PCR检测方法,并对提取条件进行优化。结果磁珠富集法的最高回收率为1.730%(PBS缓冲液),PEG沉淀法的最高回收率为1.682%(TGBE缓冲液),18份草莓样品均未检出No V GⅡ。结论通过磁珠富集法和PEG沉淀法建立的病毒检测的富集方法均适用于鲜草莓中No V GⅡ的检测。     

西生菜中低污染量GⅡ型诺如病毒的富集与定量检测研究

目的优化新鲜西生菜中低污染量的GⅡ型诺如病毒富集方法,比较实时荧光RT-PCR与微滴式数字RT-PCR检测方法,研究适用于新鲜西生菜中低污染量的GⅡ型诺如病毒的定量检测方法。方法选取洗脱液种类、沉淀剂种类、沉淀剂作用温度及沉淀剂作用时间4个因素进行研究,以确定较优的GⅡ型诺如病毒富集条件。结合较优的富集条件,分别采用实时荧光RT-PCR方法和微滴式数字RT-PCR方法进行定量检测。结果病毒富集方法研究表明:洗脱液为牛肉膏-甘氨酸洗脱液、沉淀剂为PEG6000+PEG8000、沉淀剂作用温度为4℃,沉淀剂作用时间为4 h为较优条件,此时富集后的平均病毒浓度最高,平均回收率可达53.43%。实时荧光RT-PCR的检测限为1.44×10~4 copies/g;而微滴式数字RT-PCR的检测限为7.86×10~2 copies/g。结论通过优化西生菜中低污染量的GⅡ诺如病毒富集方法,比较实时荧光RT-PCR方法与微滴式数字RT-PCR方法定量检测病毒的效果,建立了适用于西生菜样品中低污染量GⅡ诺如病毒的定量检测方法。     

GⅡ型诺如病毒微滴式数字RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立快速准确的GⅡ型诺如病毒定量检测方法,本研究将微滴式数字RT-PCR技术应用于GⅡ型诺如病毒检测中,并与实时荧光RT-PCR法进行了比对。微滴式数字RT-PCR反应退火温度的优化实验确定了其最佳退火温度为56℃,实时荧光RT-PCR和微滴式数字RT-PCR两种方法的灵敏度实验对比表明微滴式数字RT-PCR法检测GⅡ型诺如病毒的灵敏度为5.40 copies/μL,其灵敏度高于实时荧光RT-PCR法,重复性实验对比表明两种方法在检测中间浓度的GⅡ型诺如病毒时重复性均较好;人工污染西生菜实验中表明微滴式数字RT-PCR法最低检测限为54.00 copies/μL。本研究建立的GⅡ型诺如病毒的微滴式RT-PCR检测方法,灵敏度高,重复性良好,在人工污染西生菜GⅡ型诺如病毒的检测中表现理想,具有良好的应用前景。     

北京市市售扇贝中诺如病毒监测分析

目的监测北京市市售扇贝中诺如病毒和A组轮状病毒污染状况,分析其基因特征。方法 2014年11月至2015年10月,采集北京市3个水产品出售市场新鲜扇贝72份。取扇贝消化组织,用聚乙二醇(PEG)8000沉淀法进行病毒富集后提取核酸,用实时荧光逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测诺如病毒和A组轮状病毒核酸。用半巢式RT-PCR方法扩增诺如病毒GⅠ/GⅡ组衣壳蛋白区基因,对PCR产物进行测序,用BioEdit 7.0.9.0软件进行序列比对,用MEGA 6.06软件构建进化树。结果 72份扇贝样品均未检出A组轮状病毒;诺如病毒检出率为27.8%(20/72),其中GⅡ组16份,GⅠ组2份,GⅠ和GⅡ组混合2份。冬季检出率最高,为61.1%(11/18);夏季未检出。8份诺如病毒核酸阳性样品测序结果为GⅡ.17型,属于GⅡ.17型ClusterⅢb分枝。有6株GⅡ.17型毒株与2015年中国人源诺如病毒、2016和2017年日本人源诺如病毒、2017和2018年韩国水中诺如病毒以及2015年日本牡蛎中诺如病毒序列相似性为100.0%。结论北京市市售扇贝中存在诺如病毒污染,食用扇贝有引起病毒性急性胃肠炎的风险。     

实时荧光RT-PCR检测冷冻草莓中诺如病毒

目的：建立冷冻草莓中的GI、GII型诺如病毒实时荧光RT-PCR检测方法,并应用于实际样品的检测。方法：对草莓样品进行前处理、病毒富集、病毒RNA的提取和纯化,然后采用实时荧光RT-PCR进行检测。结果：核酸提取方法能够有效地去除抑制因子,同时对104份送检样品进行检测,结果均为阴性。结论：所建立的核酸提取与实时荧光RT-PCR结合的检测体系适合于草莓样品中诺如病毒GI、GII型的检测。     

草莓中诺如病毒和甲肝病毒的多重实时荧光逆转录PCR检测方法的建立

目的建立草莓中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒等3种食源性病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法,并应用于实际样品检测。方法对草莓样品进行前处理、病毒富集、病毒RNA提取和纯化后,先采用单重实时荧光RT-PCR进行检测,随后进行多重实时荧光RT-PCR反应条件优化,建立多重实时荧光RT-PCR检测方法并分析其特异性和灵敏度。结果所采用的病毒富集和核酸提取方法可以实现病毒的有效富集和抑制剂的去除,建立的多重实时荧光RT-PCR方法特异性强(100%),对草莓样品中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒的检测灵敏度分别为56.2 RT-PCR50/20 g、31.6 RT-PCR50/20 g和31.4 CCID50/20 g。同时对50份样品进行检测,结果均为阴性。结论所建立的检测方法快速、灵敏、特异性强,适用于草莓产品中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒的同时检测。     

秦皇岛市售生菜、草莓中诺如病毒监测分析

目的 调查秦皇岛市诺如病毒污染的高风险食品生菜和草莓中诺如病毒的污染状况。方法 2015年9月至2016年6月采集市售的生菜201份、草莓136份, 利用实时荧光RT-PCR法检测诺如病毒, 在样品中添加Mengo病毒进行过程控制, 并根据Mengo病毒标准曲线计算 诺如病毒回收率。结果 Mengo病毒回收率均达到了ISO/TS 15216-2-2013对 病毒回收率＞1%的要求。同时对201份生菜样品进行检测, 检出诺如病毒阳性标本9份, 总检出率为4.5%, 其中GⅠ型检出率为0.5%(1/201); GⅡ型检出率为3.5%(7/201); GⅠ型和GⅡ型同时检出率为0.5%(1/201)。136份草莓样品中检出阳性标本4份, 总检出率为2.9%, 其中GⅠ型检出率为0.7%(1/136); GⅡ型检出率为2.2%(3/136)。结论 秦皇岛市售蔬菜、浆果中部分存在诺如病毒污染, 诺如病毒检出率在不同采样环节以及时间分布比较差异无统计学意义, 需要进一步加强日常监测。     

秦皇岛市部分腹泻患者粪便样本中诺如病毒监测

目的监测秦皇岛市部分诺如病毒引起病毒性腹泻情况,并对阳性样本进行分型。方法收集哨点医院病腹泻患者粪便标本共200份,采用实时荧光定量PCR方法 (real-timeRT-PCR)检测病毒核酸,Mengo病毒作为过程控制和扩增控制,检测诺如病毒回收率和抑制率。结果 Mengo病毒回收率均1%,PCR抑制率≤2%,符合检测要求。检测出病毒阳性15例,其中诺如病毒GⅠ型2例, GⅡ型13例。结论本次采集的样本中诺如病毒流行型分别为GⅠ和GⅡ型,其中以GⅡ组毒株流行为主,诺如病毒阳性率与性别、年龄无关。     

实时荧光RT-PCR检测贝类中的札幌病毒

建立检测贝类中GⅠ、GⅡ、GⅣ和GⅤ型札幌病毒的实时荧光RT-PCR新方法。首先使用PEG 8000对贝类中的札幌病毒进行富集,然后采用Tri-reagent提取材料中的总RNA,针对札幌病毒RNA 3'端含Poly A尾的特点,使用带有Poly(dT)25的磁珠对病毒RNA进行纯化,用所获的高纯度RNA进行四种型别札幌病毒的实时荧光RT-PCR检测。该方法高效、灵敏,检测下限为101数量级拷贝,能够用于日常检验。     

蓝莓中诺如病毒检测方法的优化及其在果蔬中的应用

目的:建立蓝莓等浆果类和蔬菜类食品中GII型诺如病毒(NoV GII)的有效检测方法。方法:利用已知NoV GII病毒样本对阴性的蓝莓进行人工染毒,分别比较7种洗脱液和2种浓缩方法的回收效果,优化RNA提取方法,最后采用荧光定量PCR方法进行检测。用新建立的诺如病毒浓缩检测方法,对7种市购浆果和蔬菜样品进行检测并研究其最低检出限。结果:实时荧光RT-PCR检测结果表明,人工染毒后的蓝莓等浆果样品(表皮和基质)采用TP ALK洗脱液洗脱,经酶处理后超滤法浓缩,最后采用病毒核酸提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)提取浓缩病毒的RNA,诺如病毒的回收效率达到较高的水平,其灵敏度达3.5～350 PCRU/10g。将该方法用于草莓、杨梅、葡萄、小番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜等7种水果蔬菜中诺如病毒的检测,其中杨梅和小番茄的检测灵敏度达到3.5～3 500 PCRU/10 g,草莓、生菜和胡萝卜次之,为35～35 000 PCRU/10 g,黄瓜和葡萄的灵敏度较低。结论:所建立的果蔬中诺如病毒富集方法和核酸提取方法操作简便,灵敏度较高,适合于蓝莓等浆果和蔬菜类样品中NoV GII的检测。     

一起疑似食源性诺如病毒胃肠炎事件病原分子生物学特征分析

目的研究厦门市思明区一起聚集性胃肠炎事件的诺如病毒的分子生物学特征。方法将收集到的11份肛拭子标本及1份生蚝样品,采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测诺如病毒核酸,阳性标本再进行实时荧光定量RT-PCR扩增,扩增产物经过凝胶电泳分析后,进行序列测定,确定基因型,并进行系统发育树分析。结果 11份肛拭子标本中检出5株GⅠ组诺如病毒株,2株测序成功,检出4株GⅡ组毒株,3株测序成功;1份生蚝样品中检出1株GⅠ组毒株,测序成功。对测序成功的6株毒株进行同源性分析,GⅠ.2型毒株所测序列与2014年上海株KP325648等6株参考株高度同源,GⅡ.17型毒株所测序列与2015年韩国株KT384078等8株参考株高度同源,证实这是一起由GⅠ.2和GⅡ.17型诺如病毒混合感染引起的聚集性胃肠炎事件,GⅡ.17型毒株为厦门市首次报道。结论此次聚集性胃肠炎事件是由诺如病毒引起,且为GⅠ.2与GⅡ.17型毒株混合感染引起。     

舟山市海产贝类和食源性腹泻病例中肠道腹泻病毒监测

目的了解肠道腹泻病毒在舟山市海产贝类的分布和食源性腹泻病例中的感染特征以及两者相关联系,为预防和控制食源性疾病提供有效的对策和措施。方法采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法对466份舟山市海产贝类和422份食源性腹泻标本中诺如病毒(NoV)GⅠ型/GⅡ型、轮状病毒(RV)、札如病毒(SPV)、星状病毒(AsV)和肠道腺病毒(AdV)5种主要肠道腹泻病毒核酸进行检测。结果 466份海产贝类样品病毒总阳性率为18.03%(84/466),其中NoV GⅡ型为4.08%(19/466),SPV为9.67%(45/466),AsV为2.79%(13/466),AdV为1.50%(7/466);春季和冬季病毒阳性率较高,农贸市场的牡蛎病毒阳性率最高(24.75%,25/101),养殖毛蚶病毒阳性率最低(10.12%,17/168),不同的病毒阳性率以及不同来源和不同季节贝类的病毒阳性率差异均有统计学意义(P0.05)。422例腹泻患者粪便标本总阳性率为15.64%(66/422),NoV为4.74%(20/422,以GⅡ为主),RV为4.74%(20/422),SPV为3.55%(15/422),NoV GⅡ型、RV和SPV的阳性率相对较高,春季和冬季病毒阳性率较高,不同病毒阳性率和不同季节病毒阳性率差异有统计学意义(P0.05)。结论舟山市海产贝类中肠道腹泻病毒的污染状况较为严重,与食源性腹泻病例中的病毒感染特征存在相关联系,其流行季节和优势病毒类型相同。     

猪胃黏蛋白偶联磁珠和聚乙二醇富集检测青葱和葡萄中诺如病毒的比较研究

目的:以青葱与葡萄为材料,建立以猪胃黏蛋白偶联磁珠(PGM-MB)和聚乙二醇8000(PEG8000)富集检测水果、蔬菜中诺如病毒的方法。方法:确定病毒原液中的相对病毒量,梯度稀释病毒原液并进行实时荧光-聚合酶链式反应检测,以每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数值与病毒量(实时荧光-聚合酶链式反应单位数)的常用对数值绘制标准曲线和线性方程;人工接种诺如病毒于青葱与葡萄表面,洗脱后,分别用PEG8000和PGM-MB富集诺如病毒,实时荧光-聚合酶链式反应扩增,用标准曲线对回收的病毒进行相对定量。结果:基质为青葱时,高接种量条件下,两种富集方法的病毒回收效果相当,低接种量下,PGM-MB法的富集回收率高于PEG8000法,且PGM-MB的检测下限更低;基质为葡萄时,PGM-MB法的富集回收率均高于PEG8000法,且检测下限更低。结论:PGM-MB富集效果良好,快速方便,适合应用于水果和蔬菜中的诺如病毒的富集检测。     

贻贝中诺如病毒荧光定量反转录PCR检测及北京市污染情况调查

目的监测北京市市售贻贝中诺如病毒(NoV)的污染率及污染浓度,为贝类样品中诺如病毒的风险评估提供基础数据。方法解剖并分离贻贝的内脏团,将内脏团研磨至均质,加入磷酸盐缓冲液振荡60 min,提取病毒颗粒。提取病毒RNA,荧光定量反转录PCR检测诺如病毒,并进行定量分析。结果共检测293份贻贝样品,总阳性率为9.22%(27/293),其中诺如病毒基因组Ⅰ(GGⅠ)占阳性样品数的37.04%(10/27),基因组Ⅱ(GGⅡ)占阳性样品数的62.96%(17/27),未检测到同时携带GGⅠ和GGⅡ的样品。阳性样品中诺如病毒浓度范围在6.20×10~3~3.15×10~5基因拷贝/g(内脏)之间。结论北京市市售贻贝中存在诺如病毒污染。     

2015~2016年河北省贝类水产品中诺如病毒污染状况研究

目的 对2015~2016年河北省6个设区市的市售牡蛎、海虹、血蚶样品中的诺如病毒进行连续一年的检测, 了解河北省贝类水产品中诺如病毒污染状况。方法 分离贝类水产品消化腺, 用蛋白酶K消化后进行前处理, 提取RNA, 用一步法实时荧光逆转录聚合酶链式反应法检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒。对河北省贝类水产品的诺如病毒污染状况进行分析。结果 共采集691份贝类样品进行检测, 其中仅检出GⅠ型阳性样品16份, 阳性率2.32%; 仅检出GⅡ型阳性样品22份, 阳性率3.18%; 同时检出GⅠ和GⅡ型的阳性样品4份, 阳性率0.58%; 总阳性率6.08%。2016年6~7月阳性率最高。沿海地区样品阳性率为内陆地区的2.35倍, 有统计学差异(χ2=8.58, P<0.01)。结论 河北省市售贝类水产品中部分存在诺如病毒污染, 需要加强对贝类水产品的诺如病毒污染检测和控制, 特别是沿海地区, 降低诺如病毒引起的食源性腹泻的疾病负担。     

2019年连云港市农贸市场双壳贝类中诺如病毒污染状况调查

目的了解连云港市农贸市场双壳贝类中诺如病毒污染状况。方法于2019年6、8和11月在连云港三县三区各采集10份双壳贝类食物,共180份,及时分离消化腺于-75℃保存,采用实时荧光定量PCR检测诺如病毒基因型。结果 5种双壳贝类中诺如病毒基因总检出率为26.67%(48/180),基因型分型中GⅠ型检出率为5.00%(9/180)、GⅡ型检出率为17.78%(32/180)、GⅠ+GⅡ型检出率为3.89%(7/180);诺如病毒基因检出率在采样月份、地区分布无差异;帘蛤科诺如病毒检出率最高。结论连云港市农贸市场双壳贝类诺如病毒携带形势严峻,分布特征具有特殊性,亟需明确本地的诺如病毒传播模式并采取相应防控措施。     

顺义区市售双壳贝类中副溶血性弧菌和诺如病毒的耐药性及分型研究

目的了解北京市顺义区部分市售双壳贝类中副溶血性弧菌及诺如病毒的污染情况,为相关感染性腹泻的防治提供依据。方法 2017年7～10月采集顺义区市场的双壳贝类,取适量样品分离其消化腺,进行样品前处理,提取病毒RNA后采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测诺如病毒。剩余样品按照GB4789.7—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》进行副溶血性弧菌的分离鉴定。对检出的副溶血性弧菌进行毒力基因(tlh,tdh,trh)检测、耐药性分析和脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型。结果 50份双壳贝类样品中有18份检出副溶血性弧菌(18株),检出率为36.0%;有8份样品携带诺如病毒。分离的副溶血性弧菌17株为tlh+tdh-trh-型,1株为tlh-tdh-trh-型;所有副溶血性弧菌均对氨苄西林耐药,对其他抗生素均敏感;PFGE图谱聚类后呈现多态性,存在多个克隆群。诺如病毒只在10月份检出,分布于牡蛎、蛏子和扇贝中,均为GⅡ型核酸阳性。结论顺义区市售双壳贝类中存在副溶血性弧菌和GⅡ型诺如病毒,需警惕感染风险。分离的副溶血性弧菌呈现多态性,但毒力基因携带率较低,对大多数抗生素敏感。     

广西养殖牡蛎中诺如病毒的污染状况及风险评估

目的研究广西养殖场、农贸市场及餐饮场所牡蛎中诺如病毒的污染状况,对广西养殖牡蛎中诺如病毒可能引发的发病风险进行评估。方法采用荧光逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法对广西养殖场、农贸市场、餐饮场所牡蛎样品中诺如病毒污染状况进行检测,采用Risk Ranger软件对牡蛎中诺如病毒进行半定量风险评估。结果 480份牡蛎样品中诺如病毒总检出率为11.04%(53/480),其中养殖场及农贸市场检出率分别为15.83%(38/240)、12.50%(15/120),餐饮场所牡蛎样品未检出诺如病毒;基因分型结果显示检出的诺如病毒均为GⅡ型。风险评估结果显示,加工后食用和生食的风险评分为44和67分,分别为中度和高度风险,预计食用者每人每天患病的可能性分别为3.29×10~(-6)和3.29×10~(-2),预计广西每年患病人数分别为3.10×10~3和3.10×10~7人。结论广西养殖场及农贸市场牡蛎中诺如病毒污染情况较为严重,污染的诺如病毒基因型均为GⅡ型,不生食牡蛎及食用前有效的加工处理是减少诺如病毒食源性疾病发生的有效方法。