河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌的分子分型及系统发育研究

目的 了解河南省市售婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌污染情况、分子分型特征及耐药情况,分析不同菌株间的系统发育进化关系.方法 采集婴幼儿配方食品227份,按照GB 4789.40-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》方法进行克罗诺杆菌的分离鉴定,并用微量肉汤稀释法和脉冲场凝胶电泳(PF...     

添加扩增内标的PCR方法快速检测食品中的阪崎克罗诺杆菌

为了解决常规PCR方法检测阪崎克罗诺杆菌时因检测过程中环境和食品理化因素的影响而导致的假阴性结果的产生,本研究以细菌16S rRNA基因为扩增内标对照,以阪崎克罗诺杆菌特异性基因grx B为靶基因设计了一对特异性引物,并通过优化PCR反应条件,最终建立了一种添加扩增内标的阪崎克罗诺杆菌PCR检测方法,可以指示PCR过程中因存在DNA聚合酶抑制剂而导致的假阴性结果。通过对20种细菌进行PCR检测显示,该方法对阪崎克罗诺杆菌具有良好的特异性。灵敏度实验结果表明,该检测方法对阪崎克罗诺菌纯DNA模板的检测灵敏度为2.15×102fg/μL,对阪崎克罗诺杆菌纯培养物的检测灵敏度为9.4×103CFU/m L。对人工污染婴幼儿奶粉的检测结果显示,阪崎克罗诺杆菌接种量为0.94 CFU/g的婴幼儿奶粉样品经过8 h增菌培养后,即可检出。食品样品检测结果表明,不添加扩增内标的PCR检测方法中出现的假阴性结果可被本方法检出。该检测方法特异性强、灵敏度较高,能消除阪崎克罗诺杆菌常规PCR检测方法中可能出现的假阴性结果,适用于婴幼儿配方乳粉、乳制品等食品中阪崎克罗诺杆菌的快速检测。     

GABA旁路在阪崎克罗诺杆菌耐干燥胁迫中的作用

阪崎克罗诺杆菌是婴幼儿配方奶粉（Powdered Infant Formula,PIF）中常见的食源性致病菌,γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric Acid,GABA）是一种广泛存在于各种生物体内的非蛋白氨基酸,而gabT控制的氨基丁酸转氨酶是GABA代谢旁路的关键酶。该研究通过构建阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544 gabT基因敲除菌株（ΔgabT）,探讨gabT控制的GABA（γ-氨基丁酸）代谢旁路对阪崎克罗诺杆菌抵抗干燥的作用。结果表明,ΔgabT在干燥胁迫下处理一周后存活率可达到28.64%显著高于野生型菌株（WT）的存活率1.57%。此外,GABA在ΔgabT中累积量高于WT,与存活率结果呈正相关,表明GABA累积能帮助阪崎克罗诺杆菌抵御干燥胁迫。扫描电子显微镜检测结果也显示ΔgabT菌株具有较完整的细胞形态,进一步验证了GABA积累有助于阪崎克罗诺杆菌在干燥环境胁迫下的生存。该研究为阪崎克罗诺杆菌中基于GABA旁路的靶向调控奠定了基础,为阪崎克罗诺杆菌防控提供新思路。     

婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染调查及分子分型研究

目的了解温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌污染情况及分子分型特征,分析不同菌株间亲缘相关性。方法参照GB 4789.40—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》方法在食品中分离鉴定克罗诺杆菌。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)方法对克罗诺杆菌进行分型研究。结果 2013—2017年共采集737份婴幼儿食品和配方奶粉,克罗诺杆菌总检出率为6.1%(45/737)。其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高(23.4%,37/158)。45株克罗诺杆菌属于阪崎克罗诺杆菌(C.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(C.malonaticus)和莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii)。其中阪崎克罗诺杆菌最多(73.3%,33/45),其次为丙二酸盐克罗诺杆菌(24.4%,11/45)。MLST共分为25个ST型,其中ST64、ST1、ST40、ST4和ST7为优势型别。45株克罗诺杆菌PFGE分型得到38个带型,未发现有明显的优势分型和聚集现象。PFGE型和MLST型结果分析表明,绝大数具有相同PFGE型的菌株也有相同的MLST型,而相同MLST型却不一定具有较高的亲缘关系。结论温州市市售婴幼儿食品和配方奶粉中克罗诺杆菌的污染状况较轻,其中婴幼儿谷类辅助食品检出率最高。食品来源的克罗诺杆菌图谱具有高多态性和离散性。     

环介导等温扩增-无电加热法检测乳中阪崎克罗诺杆菌

设计了一个无电加热器,利用氧化钙和水的化学反应提供热源,建立一种检测乳中阪崎克罗诺杆菌的环介导等温扩增无电检测体系,同时以阪崎克罗诺杆菌的ITS序列为靶基因,设计特异性引物,使其能够实现快速、高效的现场检测婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌,最终通过琼脂糖凝胶电泳法对检测结果进行判定。利用上述建立的无电检测体系,进行阪崎克罗诺杆菌灵敏度实验并与传统用电加热器法进行对比,在不同环境温度下进行测试。结果表明,利用该无电检测体系和基于传统电加热器检测阪崎克罗诺杆菌纯培养物的灵敏度均为2.6×10~2CFU/m L,且人工污染的婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的灵敏度均为4.2×10~2CFU/g。该无电检测体系稳定性好,在环境温度为4~37℃时,灵敏度均能达到10~2CFU/g。     

婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌解旋酶恒温基因扩增检测方法的建立

目的：建立一种检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的解旋酶恒温基因扩增方法。方法：根据阪崎克罗诺杆菌ITS基因设计特异性引物,优化解旋酶恒温基因扩增法反应条件UvrD helicase、T4 gp32的浓度,人工添加阪崎克罗诺杆菌确定检出限,多种致病菌在建立的解旋酶恒温基因扩增体系中扩增验证特异性,电泳检测扩增产物。结果：解旋酶恒温基因扩增法检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌得到与设计序列长度一致的100 bp基因片段,检出限为10 CFU/g,优化反应条件UvrD helicase、T4 gp32的终浓度分别为0.1、5.0 μg。结论：解旋酶恒温基因扩增法用于检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的特异性强、灵敏度高、耗时短,为婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的快速检测提供了新的方法。     

实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌方法的建立

目的建立实时荧光单引物等温扩增(SPIA)检测阪崎克罗诺杆菌的方法。方法本文以阪崎克罗诺杆菌Omp A基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,对4株不同来源阪崎克罗诺杆菌和21株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA特异性分析,通过不同浓度梯度阪崎克罗诺杆菌菌悬液灵敏度的检测和添加有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方奶粉样品检出限的确定,评价方法的准确度。结果除4株阪崎克罗诺杆菌外,其他细菌均未出现特异性荧光扩增曲线,具有良好的特异性。在40 min内,实时荧光SPIA检测阪崎克罗诺杆菌纯培养基因拷贝灵敏度为每反应1 copies,相应活菌数为1.6×10-1cfu/ml;对婴儿配方奶粉模拟样品中阪崎克罗诺杆菌的检出限是1.5×100cfu/100 g。结论本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点,适用于实验室快速检测阪崎克罗诺杆菌Omp A基因。     

婴幼儿配方食品中阪崎肠杆菌的计数结果不确定度评定

[目的] 了解专项抽查的婴儿配方食品中的阪崎肠杆菌指标状况,并探讨阪崎肠杆菌的计数结果的不确定度评定方法。[方法] 按照GB 4789.1-2010 《食品微生物学检验 总则》和GB 4789.40-2016 《食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验》进行了抽样和检测, 依据JJF1059.1-2012 《测量不确定度评定与表示》及贝塞尔统计学方法对计数结果进行不确定度评定。[结果]22批次婴儿配方食品中有1批次检出阪崎肠杆菌,检出率为4.55%, 该批次样品中阪崎肠杆菌平均计数为25.5MPN/100g,计数结果扩展标准不确定度为2.72MPN/100g。[结论] 本次评估依据阪崎肠杆菌检计数检验国家标准,对4次保温培养节点进行了分析,结果表明固液混合过程,酵液取样体积,阪崎肠杆菌显色平板上可疑菌落选择和MPN法重复计数的四个不确定度较大,是记数检验过程中的重要环节。     

婴幼儿食品源阪崎克罗诺杆菌的3种分型方法

阪崎克罗诺杆菌污染婴幼儿食品可能导致新生儿和婴幼儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎,对其健康造成严重威胁。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)和肠杆菌间保守重复序列PCR(ERIC-PCR)对分离于婴幼儿配方乳粉、米粉和辅食中的阪崎克罗诺杆菌进行分子分型,计算3种分型方法的辛普森多样性指数(DI)值,评价3种方法的分型效率,以便精确和快速开展阪崎克罗诺杆菌流行病学研究。PFGE、MLST和ERIC-PCR可分别将37株阪崎克罗诺杆菌分为35个PFGE基因型、28个ERIC-PCR型和23个序列(ST)型,分型结果的DI值分别为99.55%,96.40%和98.05%。3种方法对阪崎克罗诺杆菌均具有较高的分型能力,其中PFEG分型能力最高,分型效率最佳。     

生鲜蔬菜中阪崎克罗诺杆菌的分离与鉴定

从上海市售蔬菜中共采集样品102份,按照国标方法GB 4789.40—2010进行阪崎克罗诺杆菌的分离与鉴定。采用生化实验、PCR检测方法、BAX System Q7全自动病原微生物检测仪、API 20E试剂条鉴定和16S rDNA序列的测定对分离到的可疑菌株进行鉴定与确证。根据国标法的鉴定结果,102份样品中共有18份样品分离到可疑阪崎克罗诺杆菌菌株,进一步结合其他4种鉴定方法确定13份样品中分离到的可疑菌株为阪崎克罗诺杆菌菌株,分离率达13%(13/102)。通过研究说明生鲜蔬菜也是阪崎克罗诺杆菌比较常见的宿主或者污染源之一。     

乳粉中阪崎肠杆菌检测能力验证结果与分析

目的提升实验室检测乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的速度和准确性。方法依据GB4789.40-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》和经优化的SN/T1632.3-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法第3部分:荧光PCR方法》以及能力验证作业指导书对乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)进行检测和结果判断。结果通过实时荧光PCR法的快速初筛,初步判断样品CODE29为阴性,样品CODE95为阳性;再经显色平板分离和VITEK2生化鉴定,结果显示:样品CODE29检出肺炎克雷伯杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌;样品CODE95检出阪崎肠杆菌和大肠埃希氏菌。结论本次乳粉样品中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测能力验证结果合格,为提高相关微生物实验室的检测能力提供参考。     

克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的分离与鉴定能力验证结果与分析

目的 通过参加“奶粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力验证计划”,验证实验室对克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力,提高实验室检测技能。方法 依据GB 4789.40-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》中的第一法,对能力验证样品进行检验,对分离出的可疑菌落进行生化鉴定,同时用BIOLOG鉴定系统对可疑菌落进行鉴定。 结果 编号G785和编号V995的两个能力验证样品皆检出克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌) 结论 本次能力验证获得满意结果,证明本实验室具备克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)的检测能力。在本次能力验证实验过程中,在以国标法检测的同时,辅以BIOLOG进行鉴定,与传统生化鉴定结果互为印证,提高了检测结果的准确性,对以后的检测工作具有一定的参考价值。     

Rapid detection of Cronobacter spp. with a method combining impedance technology and rRNA based lateral flow assay

Cronobacter spp. is an important release test parameter for powered infant formula (PIF). An impedance method is proposed for the rapid detection of this pathogen in PIF. An impedance based method (BacTrac 4300 Microbiological Analyzer) combined with a RNA hybridisation assay (RiboFlow?) was evaluated using 23 strains in PIF samples and compared to a culture based reference method (ISO/TS 22964). The influences of competitive flora, heat and dry stress on the reliability of the impedance method were investigated. Seven different Cronobacter species were included in the evaluation, among them are strains with high susceptibility to low pH and high temperatures. Compared to the reference method, a higher sensitivity (85%) and specificity (100%) was observed using the impedance method, combined with the commercial rRNA based lateral flow test kit as a confirmation tool. The detection time was substantially shortened by using the impedance technique and RiboFlow?. Cronobacter could be detected within maximally 29h, while the reference method takes up to five days when including confirmation of positive results.     

婴幼儿奶粉中阪崎克罗诺杆菌隐性污染状况分析及针对性检测技术研究进展

婴幼儿奶粉中存在的阪崎克罗诺杆菌对婴幼儿危害性极强,卫生标准中对该微生物有严格限制,但检出现象仍然时有发生。存在许多因素导致阪崎克罗诺杆菌在婴幼儿奶粉生产线中的潜伏,本文阐述了其在生产空间中的暴露特征,重点论述逆境胁迫下该菌耐受表型和活的非可培养表型形成的隐性污染对监测和清除污染残留的不利影响。讨论了各类检测技术的优缺点,强调检测灵敏度、回收率和区分活的非可培养状态菌对于控制隐性污染的重要性。以期为阪崎克罗诺杆菌的监测和防控提供新思路,为保障婴幼儿奶粉生产安全提供参考和建议。     

食品中3M™克罗诺杆菌属分子检测系统评价研究

目的：用不同来源的克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）、不同来源的非目的菌及不同来源的人工染菌食品样品,考核评估3M? MDS分子检测系统（以下简称3M? MDS）对克罗诺杆菌属的检出限、灵敏度、特异性和准确度,以及与国标法（GB4789.40-2016）检验结果的一致性。方法：用3M? MDS对实验室保存的50株已确认克罗诺杆菌属、40株非目的菌株进行检测,确定该试剂盒的检出限、灵敏度和特异性;对240份人工污染不同浓度目的菌样品,用3M? MDS和国标法同时检验,分析方法的准确度和检验结果的一致性。结果：3M? MDS对50株不同来源的克罗诺杆菌属的检测灵敏度为100%,平均检出限为1.79×103CFU/mL;对40株非目的菌检测结果均为阴性,特异性为100%。用3M? MDS与国标方法对人工污染101 CFU/100g、100 CFU/100g 、10-1 CFU/100g克罗诺杆菌属FC718的240份不同来源乳粉、糊精、乳清和乳糖样品进行检测,结果一致性均大于95%,方法准确度为97.5%。结论：3M? MDS方法具有低检出限、高灵敏和特异性特点,在不同食品样品基质中,检验结果呈现良好的准确度,与国标方法检验结果具有高度一致性,是一项适合基层、企业推广的快速、可靠方法。     

Direct Real-Time PCR with Ethidium Monoazide: A Method for the Rapid Detection of Viable Cronobacter sakazakii in Powdered Infant Formula

The goal of this study was to establish a rapid assay for the specific detection of viable Cronobacter sakazakii in powdered infant formula (PIF). Samples were subjected to treatment multiple times with ethidium monoazide with a concentration gradient (gEMA) prior to PCR to discriminate viable from dead C. sakazakii cells. To improve the current detection limits, we developed a new buffer for direct quantitative real-time PCR (DqPCR) without DNA isolation. Using 17 PIF samples, our rapid assay was compared with the new U.S. Food and Drug Administration (FDA) method published in the Bacteriological Analytical Manual in 2012. Although both the new FDA method and our rapid assay, which consists of DqPCR combined with gEMA (gEMA-DqPCR), produced negative results for all 17 PIF samples, 5 of the 17 PIFs were positive by DqPCR when they were not treated with EMA. Furthermore, for PIF samples artificially contaminated with viable C. sakazakii, gEMA-DqPCR successfully detected between 1 and 9 CFU of viable C. sakazakii in 300 g of PIF within 9 h, including a 6-h preincubation. Our results indicate that multiple EMA treatments are required to avoid false-positive results due to the contamination of commercial PIF with dead or injured C. sakazakii cells. Our rapid assay may also improve the sensitivity of the screening portion required by the new FDA method published in the Bacteriological Analytical Manual in 2012.     

婴幼儿配方粉生产中克罗诺杆菌溯源研究

结合陕西省两个婴幼儿配方乳粉加工厂婴配粉生产工艺,对生产原辅料、车间环境、加工设备及工厂周边土壤进行采样,检测克罗诺杆菌的污染状况,并对菌株进行脉冲场凝胶电泳(Pulse field gel electrophoresis,PFGE)分型溯源,定位克罗诺杆菌在生产过程的污染点.结果 表明,采集的1246份样品中检出14...     

克罗诺杆菌分型技术研究进展

克罗诺杆菌原名阪崎肠杆菌,是婴儿配方乳粉中主要的致病菌之一,能感染新生儿,并导致严重的坏死性小肠结肠炎、菌血症和脑膜炎等疾病,致死率高达40%~80%。本文综述了克罗诺杆菌常见的表型分型和分子分型方法,包括生化分型、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分型、血清型分型、脉冲场凝胶电泳分型、多位点序列分型、随机多态性扩增DNA基因分型、核糖体分型、特殊基因分型和全基因组分型,以期增加人们对克罗诺杆菌分型方法的认识,为全面揭示克罗诺杆菌的表型特征和遗传多样性提供方法和依据。