多重实时荧光PCR快速检测转基因大豆及其加工产品

本研究运用多重实时荧光聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)对转基因大豆及其深加工制品进行筛选检测。通过设计大豆内源基因植物凝集素(Lectin)和常用的外源基因花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止(nos)的特异性引物和探针,反应条件和反应体系的优化,特异性、重复性和灵敏性的实验比对分析等开发建立了多重荧光定量PCR检测技术。以10%Roundup Ready转基因大豆标准品为材料,建立并优化转基因大豆的定量检测体系,对大豆中的转基因成分进行定量分析。结果表明:该方法重复性好,检测特异性强,扩增效率在90%～110%,标准曲线相关系数R2≥0. 98,确定了最低检测限为每20μL反应2. 4个拷贝。结论:由于使用多重实时荧光PCR技术,可实现一管多检的实际需要,降低试剂成本,缩短检测时间,为大豆及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了有效方法,为促进农产品和食品进出口提供技术保障。     

大豆深加工产品中外源基因检测灵敏度的研究

为了提高大豆深加工食品中外源基因的检测灵敏度.改良了普通PCR反应的引物,并设计了NEST-PCR反应程序.模拟食品加工中高温、高压等处理方法,将转基因大豆研磨成粉状,在高压灭菌锅内进行高温、高压处理.应用新设计的引物35SCP142、CPNOSl65进行外源基因检测,通过对引物的调整,检测灵敏度得到了明显的提高,可以检测到的转基因大豆含量仅为1%.且为经过12l℃,30min处理的样品中的外源基因.应用NEST-PCR的高灵敏度的特性.设计了NEST-PCR的两对引物35SCP318和35SCP114.并检测到外源基因的片段.将普通PCR的检测灵敏度和荧光定量PCR的灵敏度作比较,若引物设计合理,且PCR条件适合,普通PCR的检测灵敏度可以和荧光定量PCR的相媲美.     

食品中转基因成分的PCR快速检测研究

为建立食品中转基因成分的快速检测方法，针对转基因大豆、玉米、油菜的多个相对稳定的转基因元件，包括35S、NOS、EPSPS、Cry1A、NPTⅡ等基因，同时选定植物本身固有的基因：大豆Lectin、玉米IVR、油菜Napin基因作为内源参照指示基因，设计、筛选出9对引物分别组成多重PCR．结合高灵敏度的聚丙烯酰胺凝胶电泳组成快速检测体系对转基因食品进行检测，1～2d能完成整个检测过程。经测试：该检测体系稳定可靠、灵敏准确、特异性好，且操作简便、成本低廉，是一种进行转基因食品检测的良好技术模式。     

大豆加工食品中转基因成分多重PCR检测体系的建立

以大豆内源基因 (Lectin)、筛选基因 3 5S启动子 (Cauliflowermosaicvirus 3 5S ,CaMV3 5S)、Nos终止子 (Nopalinesynthase,Nos)和外源基因 (5 enolpyruvylshikimate 3 phosphatesynthase ,Ep sps)为检测对象 ,通过对PCR扩增体系中各引物终浓度及PCR扩增过程中退火温度的探讨 ,研究了不同引物终浓度配比及退火温度对转基因大豆多重PCR检测的影响 ,建立了大豆加工食品中转基因成分多重PCR检测体系。结果表明 ,当各组引物的终浓度分别为 1 0、2 0、2 0、3 0 μmol/L即引物终浓度配比为 1∶2∶2∶3 ,退火温度为 5 5 4℃时 ,所建立的多重PCR检测方法能够有效地检测出大豆中的转基因成分 ,具有特异性好 ,简便 ,快速 ,准确等优点。     

转基因大豆DNA检测芯片的研究

为提高对转基因大豆的监督检测能力，研制了转基因大豆DNA检测芯片。根据转基因大豆(Roundup Ready)中所转入的外源基因，选择CaMV35S启动子、NOS终止子、NOSIEPSPE基因和内源Lectin基因设计特异性引物，采用多重PCR法对待测样品进行扩增，通过缺口平移法合成DIGdUTP标记杂交探针，并制备基因芯片。在对PCR反应和扩增产物与芯片杂交条件进行优化的同时，比较了芯片检测的特异性和重复性，并对检测的灵敏度进行测试。结果表明，该方法具有较好的特异性和重复性，检测灵敏度可达0．5％，由于采用了多重PCR技术，一次可同时检测多个基因，提高了检测的准确性和效率。     

转基因大豆及其制品二重荧光定量PCR的建立与验证

研究选用花椰菜花叶病毒35S启动子(P-35S)和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因终止子(T-NOS)为靶标基因,运用多重实时荧光PCR技术对转基因大豆及其制品进行快速筛选检测。实验通过样品核酸提取与质控,多重引物及荧光探针的设计与筛选,反应条件和反应体系的对比优化,摸索出二重荧光定量PCR检测的最佳反应体系。同时通过特异性、重复性、灵敏性和适用性实验验证,确保了该方法在同时检测2个靶标基因时,无荧光信号的相互干扰,不会出现假阴性和假阳性结果。结果表明,方法特异性高,可同时筛查两个靶标基因,扩增效率在90%~110%之间,标准曲线决定系数R2>0.98,确定了最低检测限为2拷贝/μL。开发和建立的二重荧光定量PCR检测技术可以实现一管多检的实际需要,降低试剂成本,缩短检测时间,为大豆及其深加工产品转基因成分的快速检测提供了有效方法,为促进食品进出口提供技术保障。     

通用引物多重PCR新技术对番木瓜转基因成分检测的研究

为了满足能够同时对多个靶标进行检测,克服传统多重PCR的引物间排斥、重现性差等缺点的要求,建立通用引物多重PCR新方法对番木瓜中转基因成分进行高效、快速的检测。选用三种转基因番木瓜(Event 55-1、"GM-YK"和"华农一号")和非转基因番木瓜("台农2号")的新鲜叶片为研究对象,根据三种转基因番木瓜的外源基因和内标木瓜蛋白酶基因(papain)序列,设计五种特异性引物。通过比较不加入接头的特异性引物的PCR验证结果,发现复合引物(带通用接头的引物)无论在单重PCR或者多重PCR的检测中的电泳条带均更为明亮清晰。而由灵敏度的对比,可以得出通用引物多重PCR灵敏度比普通引物的灵敏度提高了1个数量级。通用引物多重PCR新技术较普通多重PCR方法检测番木瓜中转基因成分拥有更低的检测限和灵敏度,为转基因成分的快速检测提供一种新技术。     

多重串联式PCR基因碟片技术检测转基因大豆GTS 40-3-2

建立多重串联式PCR(MT-PCR)的基因碟片技术用于转基因大豆GTS40-3-2的检测。针对GTS 40-3-2的常见外源基因NOS终止子、CP4-EPSPS、Ca MV35S启动子和大豆内源基因Lectin设计引物,同时针对外源基因插入位点的旁临序列设计品系特异性引物。首先进行一次循环数较少(15 cycles),引物浓度较低(0.1μmol/L)的高通量多重PCR,以均匀地扩增各基因模板,同时避免引物之间的竞争,然后利用巢式荧光定量PCR检测各个基因。根据熔融曲线分析结果,灵敏度高于普通荧光定量PCR法1个数量级。该方法能够快速、高通量、准确地检测转基因大豆GTS40-3-2中的多种转基因成分,并能对该品系进行分析,重复性好,适合转基因的高通量、定量检测,可用于特异性检测转基因大豆GTS40-3-2,具有较好的应用价值。     

SYBR Green实时荧光定量PCR检测大豆转基因成分

采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术,建立了食品中大豆转基因成分的定量检测方法。通过设计特异引物,扩增内源参照基因lectin和转基因靶基因CP4EPSPS,建立两种基因的拷贝数-CT标准曲线,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量,并且通过熔解曲线分析扩增反应特异性。结果表明,lectin和CP4EPSPS基因标准曲线线性关系好,R2值分别为0.9984和0.9953,方法的回收率为95%～110%,检测限为0.01%。本检测方法具有快速、灵敏、准确、特异、高通量等优点,可以作为食品中大豆转基因成分的定量检测方法。     

PCR法检测大豆加工食品中的转基因成分

通过分子生物学手段,以聚合酶链式反应(PCR)技术为基础,建立了检测大豆加工食品中转基因成分的方法。实验分别采用CTAB法和试剂盒(Kit)法对大豆锅巴、豆浆、豆奶粉、豆腐、豆腐丝等五种大豆加工食品中的DNA进行了提取,用内标基因Lectin对此两种方法的提取效果进行了比较,并以提取的DNA为模板,利用不同的引物分别对目标基因35S和NOS进行了PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明:Kit法的DNA提取效果优于改良CTAB法,上述五种大豆加工食品中均检测出35S启动子和NOS终止子,且均含有转基因成分。     

利用微滴式数字PCR技术检测大豆毛油中的转基因成分

我国是转基因大豆的进口大国,由转基因大豆加工而成的大豆油成为进入消费者生活的食用油,判定食用的大豆油是否含有转基因成分,是国家监管部门和公众消费者密切关心、关注的问题。大豆油在制备精炼过程中破坏了大豆的DNA,造成检验时DNA富集难度增加,严重影响了大豆油转基因成分检测的准确度。到目前为止,国家已经颁布的标准中没有涉及转基因大豆油的检测标准。本研究利用高灵敏度、精确度的数字PCR技术,并通过优化大豆毛油DNA提取方法和PCR反应体系,对大豆毛油样品进行外源转基因成分检测。检测结果显示,大豆毛油外源转基因成分被成功检测到。实验结果表明,本研究建立的大豆毛油转基因成分检测方法准确可靠,可进行推广应用。     

应用依赖解旋酶DNA扩增技术检测转基因大豆

目的：基于依赖解旋酶DNA恒温扩增（helicase-dependent isothermal DNA amplification,HDA）技术,建立快速检测转基因大豆的方法。方法：采用以CaMV35S、NOS、CP4-EPSPS 3 种外源基因和内源基因Lectin（大豆凝集素基因）为目的片段设计4 对特异引物,建立反应体系,通过HDA方法对内源基因和3 种外源基因的检测特异性和灵敏度进行实验,并对结果进行同源性分析。结果：建立了转基因大豆HDA检测法,检测特异性良好,3 种外源基因的检出限为0.2%。结论：转基因大豆的HDA检测方法具有普通聚合酶链式反应的特异、灵敏等特点,并且对仪器要求更低,极适合基层实验室使用,具有广阔的应用前景。     

ELISA方法定量检测转基因大豆及其产品的研究

以美国、阿根廷、巴西转基因大豆等为材料,建立了ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4 EP- SPS蛋白的方法,成功检测出美国转基因大豆含量为3.768%、阿根廷转基因大豆含量为2.820%、巴西转基因大含量为1.920%,转基因豆粉、转基因豆粕和中国大豆未检测到CP4 EPSPS蛋白。此方法具有简便、快速、稳定等优点,其检测灵敏度可达到0.0075%,并且稳定性良好,为抗草甘膦转基因大豆中CP4 EPSPS蛋白的定量检测提供了有效的手段。     

多品系混杂转基因大豆样品中复合品系的检测

摘要：目的 确认一份多品系混杂转基因大豆样品中是否含有复合性状转基因大豆。方法 采用实时荧光定性PCR方法对实验室留存的一份转基因初筛阳性大豆样品进行品系筛查检测，后分别采用单粒多靶点筛查检测和清洗后单粒多靶点筛查检测方法进行复合性状品系的确认。结果 经鉴定，该大豆样品中混杂了5种转基因大豆品系，检出复合性状转基因大豆为MON87708×MON89788品系，该品系为中国未经批准进口的转基因大豆品系。结论 鉴于目前缺乏完整的检测技术体系和技术标准，这种多品系混杂样品中掺杂未批准复合性状品系的行为非常具有隐蔽性和欺骗性，国内的农业安全监管部门和海关检疫部门都应该对此高度重视。     

The construction of pMD18-HT-Soybean as a calibrator plasmid and nested PCR assay for herbicide-tolerant soybeans

A multiple-target plasmid designated as pMD18-HT-Soybean, comprising part of a junction region of genetically modified soybean events A2704-12, A5547-127, MON89788 and GTS-40-3-2, and the endogenous soybean-specific lectin gene were constructed. The limit of detection for quantification of these four event-specific genes using pMD18-HT-Soybean plasmid was 20 copies. Furthermore, a nested PCR detection method was developed for the above four genetically modified soybean events. LOD value of nested PCR detection was 0.005 %. The above results demonstrated that the plasmid pMD18-HT-Soybean DNA represents a valuable alternative to genomic DNA as a calibrator for the quantification of soybean event GTS-40-3-2, MON89788, A2704-12 and A5547-127 in food and feed products. And the validated results also indicated that the developed nested PCR method can be used for identification and quantification of four genetically modified soybean events and its derivates.     

实时荧光PCR技术定量检测转基因豆粉的研究

本实验以美国、阿根廷、巴西豆粉、中国豆粉和转基因大豆粉标准品为材料,利用设计的特异性引物和探针,建立了实时荧光定量PCR 技术检测抗草甘膦转基因豆粉的方法,成功检测出美国、阿根廷、巴西抗草甘膦转基因豆粉和中国豆粉的转基因含量分别为5.37%、3.96%、2.26% 和0,确定了荧光PCR 技术检测抗草甘膦转基因豆粉的灵敏度为0.001%,稳定性良好。     

转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法的建立

为实现转基因大豆MON89788的标识管理,针对转基因大豆MON89788的品系特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立转基因大豆MON89788实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测。结果显示：建立的转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法能扩增出127 bp的产物,特异性强,灵敏度达到0.1%,约为40 个单倍体基因组拷贝,检测重复性好,可成功应用于实际样品检测。因此,建立的转基因大豆MON89788实时荧光PCR检测方法可以应用于转基因大豆MON89788大豆及其制品的检测。     

植物源食品DNA制备方法的比较研究

目的：探索可用作PCR方法检测和鉴定植物源转基因食品模板的DNA抽提方法。方法：分别用改良CTAB法、SDS法制备黄豆、玉米、土豆和番茄及其加工产品的DNA，PCR扩增叶绿体基因片段及黄豆、玉米的内参照基因lectin和zein10。结果：改良CTAB法所得DNA作为PCR扩增模板，叶绿体基因片段及lectin和zein10均呈阳性，SDS法所得DNA作为模板时，部分样品内参照基因lectin或zein10扩增阴性。结论：PCR方法检测转基因食品时，应用改良CTAB法制备DNA模板。     

聚合酶链式反应方法检测豆制品中转基因成分的研究概述

大豆作为种植极广的农作物,在人们的生活中占据了重要位置,能加工成多种多样的产品,满足日常需要。 随着生物技术的 快速发展,转基因大豆以其高产量、低成本的优势迅速占领市场。 由于转基因产品的安全性未知,各国对其用途都有严格规定和监 管。该文从我国大豆制品的市场状况、核酸的残留、现行检测标准及实验过程中存在的问题等方面进行了总结和讨论,以期对转基因 产品的市场监管检测体系能够有所裨益。