CRISPR-Cas9技术修饰乳酸杆菌的研究进展

乳酸杆菌是一种具有促进人类健康的菌株,在食品工业中具有悠久的使用历史。近年来,基因编辑技术成为了开发利用微生物的有效工具。其中,成簇规律性间隔短回文（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及其相关因子（CRISPR-associated,Cas）所组成的CRISPR-Cas9技术由于步骤简便、效率高且准确性高等优势,已经被广泛地运用于基因编辑的研究中。将CRISPR-Cas9技术应用于乳酸杆菌将促进对其本身生理特性及其促进人体健康分子机制的研究,从而推动下一代具有定制功能乳酸杆菌的开发。本文综述了部分乳酸杆菌在食品加工中的应用以及CRISPR-Cas9技术在乳酸杆菌中的应用进展,旨在为国内乳酸杆菌生物工程化的研究与开发提供一些思路。     

CRISPR-Cas9筛选系统在病毒宿主作用因子鉴定中的优势

CRISPR-Cas9系统是细菌和古细菌中进化出的适应性免疫防御系统,称为簇状规则间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR),该系统被开发为一种基因组编辑技术并已广泛应用于病毒与宿主互作基因的筛选,2015年通过CRISPR-Cas9全基因组敲除细胞文库筛选鉴定了HRD1,EMC2等基因为西尼罗河病毒(WNV)的宿主互作基因[1]。由于病毒具有一定的传播特性,加上一些病毒的特异性受体未知,入侵机制不明,未来可能会威胁牲畜、公共卫生甚至威胁人类安全。因此,人类必须重视病毒与宿主细胞的相互作用研究,本文通过对CRISPR-Cas9系统筛选法与其他筛选方法在病毒宿主作用因子中的应用进行总结与比较,为后续科研人员在方法学上的选择提供一定参考。     

基于CRISPR-Cas9系统的Saccharomyces cerevisiae基因删除

建立CRISPR-Cas9介导的在Saccharomyces cerevisiae双倍体细胞中进行基因敲除的方法。以can1基因敲除后的表型验证该CRISPR-Cas9系统的有效性,can1基因的失活效率达到4%。利用该系统又分别敲除了pdc、adh3、adh2、adh1、 pdh等基因,单基因编辑效率分别为4/48、3/48、1/48、3/28、1/16。确定了基因连续敲除的方法流程,pdc、adh3、adh2三个基因全部敲除,整个过程用时17 d。探索了双基因一次转化同时敲除的方法,将adh5、lip两个基因同时敲除用时6 d,基因编辑效率分别为9/32和10/32。     

乳酸菌中移动基因元件的预测与分析

CRISPR-Cas系统作为获得性免疫系统能够保护乳酸菌免受噬菌体等外源基因元件的入侵,旨在对乳酸菌中CRISPR-Cas系统的活性与近期发生水平基因转移的程度是否呈负相关进行检验。预测了乳酸菌中的CRISPR-Cas系统、前噬菌体及基因岛,并分别分析乳酸菌中CRISPR与前噬菌体及与基因岛在数量上的相关性。研究发现CRISPR序列的长度(能反映该免疫系统的活性)与预测的近期发生的水平基因转移事件的数目之间没有明显的相关性。结果表明乳酸菌中的CRISPR-Cas系统并不抑制水平基因转移事件的发生。     

II型CRISPR系统在微生物中的应用

CRISPR系统是一种新兴的基因编辑技术,是存在于部分细菌中的一种免疫反应系统,利用Cas基因编码的蛋白对进入细胞中的外源DNA进行高效识别并切割,保护细菌自身免受外源基因侵害。CRISPR系统主要应用于基因的定点敲入和敲除。该系统具有操作简便,适用范围广等优点,已在各类微生物和动植物中广泛应用。在CRISPR系统中,II型CRISPR系统是应用最为广泛的系统,是目前的研究热点。它包含CRISPR/ Cas9、CRISPRa和CRISPRi系统,由于CRISPRa系统目前应用较少,本文对CRISPR/ Cas9和CRISPRi系统在微生物中的应用研究现状进行综述,并对两种系统未来的发展进行展望。     

CRISPR-Cas12a在食源性致病菌检测中的应用

食源性致病菌快速检测方法对食源性疾病的高效预防和控制具有重要意义。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)及相关蛋白(CRISPR-associated protein, Cas)构成的CRISPR-Cas系统是一种强大的基因编辑工具, 基于其对靶标核酸的特异性识别及切割活性, 应用于食源性致病菌检测中, 已成为快速检测方法研究的热点。CRISPR-Cas12a检测技术具有特异性强、灵敏性高的优点, 在食源性致病菌的检测中有着巨大的应用前景。本文主要介绍了CRISPR-Cas12a的作用机制, 重点综述了CRISPR-Cas12a结合多种核酸扩增技术在食源性致病菌检测中的研究进展, 进一步讨论了CRISPR-Cas12a在致病菌检测中存在的问题和不足, 对未来的研究前景进行了展望, 以期为更好地开发准确、快速灵敏的食源性致病菌检测技术提供参考和依据。     

美农业部确认不监管基因编辑作物

正美国农业部28日发表声明,表示不会对使用一些新技术育种的农作物进行监管,其中包括基因编辑技术。只要这些新技术没有利用植物害虫,农业部现在不会、也没有计划别使用这些新技术培育的农作物进行监管。与通常所说的转基因作物需要转入外源遗传物质有所不同的是,基因编辑育种使用CRISPR-Cas9或锌指核酸酶(ZFN)等技术对植物基因进行编辑,可设计出不含外源DNA     

解脂耶氏酵母作为微生物细胞工厂的应用研究进展

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种重要的工业微生物菌种，被公认为食品级安全微生物。近年来，随着合成生物学和基因编辑技术的快速发展，科学家们利用合成生物学及基因编辑技术已经成功构建出了能够生产生物化学品、生物燃料、香料、药物、工业酶和药用蛋白等多种高附加值工业产品的解脂耶氏酵母细胞工厂，使得该酵母在食品、药品和生化能源等领域均具有巨大的应用潜力。本文将重点介绍解脂耶氏酵母表达系统、合成生物学元件和基因编辑方法的最新研究进展和应用情况，并对近年来以解脂耶氏酵母作为微生物细胞工厂生产高附加值产品的应用实例进行总结，希望为研究人员进一步利用解脂耶氏酵母进行底盘细胞设计、构建和优化相关合成途径并最终实现目的产物的高效合成提供有用的信息。     

CRISPR-Cas系统在食源性致病菌中的结构与功能研究进展

规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas）构成的CRISPR-Cas系统是存在于细菌和古细菌中的免疫系统的组成部分,能有效防御外源移动遗传元件,如噬菌体的侵袭。研究发现该系统可以阻止携带特征基因的外源核酸整合到细菌基因组中,同时还有调节其它功能基因表达的作用,对细菌毒性、耐药性、生物膜形成等生物学特征也有影响。本文解析常见食源性致病菌CRISPR-Cas系统的结构,综述CRISPR-Cas系统与细菌毒性、耐药性、生物膜形成、分型等的相关性,为后续CRISPR-Cas系统功能研究以及食源性致病菌的溯源、控制提供参考。     

变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术在食品微生物研究中的应用

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种分析微生物区系的分子指纹技术.概述DGGE的基本原理、发展和应用现状,着重阐述该技术在评价发酵食品的细菌群落组成和动态变化、区分发酵食品、控制食品质量、检测食源性致病微生物等食品微生物研究领域中的应用,进一步展望了DGGE技术在食品研究领域的应用前景.     

食源性致病微生物检测技术研究进展

食源性致病微生物是引起食品安全问题的重要因素。针对食源性致病微生物,快速而准确的检测是保障食品安全的关键举措。随着微生物学、分子生物学技术的发展,基于新型基因组编辑技术和先进的生物传感器的检测技术不断涌现,食源性致病微生物的检测技术展现出多样性和综合性的特点,并得到了广泛的应用和商业化的发展。本文从食源性致病微生物分类出发,深入总结和探讨了传统培养分离法、免疫学检测技术、核酸检测技术和生物传感器检测技术的优缺点,并重点介绍了近年来开发的基于核酸等温扩增技术和CRISPR基因编辑技术的核酸检测新方法。通过对最新的针对食源性致病微生物检测方法综述,为研究者开辟食源性致病微生物检测新方法提供重要的理论参考。     

分子生物学技术在预测微生物学中的应用与展望

预测微生物学是食品微生物学的重要组成部分,其本质在于利用数学模型描述特定环境条件下微生物的生长和死亡规律。预测微生物模型既能应用于预测食品的货架期、控制腐败菌的滋生,又有助于完善食品微生物风险评估体系,减少致病菌的患病风险,对保障食品安全和改善公共卫生状况具有十分重要的意义。本文以综述的形式,概述预测微生物学的发展历史,并分析当前预测微生物学的研究热点。在此基础之上,着重介绍分子生物学技术在预测微生物学中应用的最新研究进展,阐述分子预测模型的概念和构建方法,并对其他分子生物学技术在预测微生物学中应用的可行性以及分子预测模型的应用前景进行展望,以期为全面推动预测微生物学这一学科的进步提供理论参考。     

A history of genome editing in Saccharomyces cerevisiae

Genome editing is a form of highly precise genetic engineering which produces alterations to an organism's genome as small as a single base pair with no incidental or auxiliary modifications; this technique is crucial to the field of synthetic biology, which requires such precision in the installation of novel genetic circuits into host genomes. While a new methodology for most organisms, genome editing capabilities have been used in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae for decades. In this review, I will present a brief history of genome editing in S. cerevisiae, discuss the current gold standard method of Cas9‐mediated genome editing, and speculate on future directions of the field.     

预测微生物学及其在食品科学中的应用

预测微生物学是运用微生物学、工程数学以及统计学进行数学建模,利用所建模型,通过计算机及其配套软件,预测和描述处在特定的环境下微生物的生长和死亡规律。预测微生物学模型按Whiting和Buchanan的分类方法分为初级模型、次级模型和三级模型,文中按该分类方法分别对预测微生物学及其模型的发展进行了系统的介绍,并对预测微生物学在食品科学中的应用进行了综述,为在食品工业中更好的利用预测微生物学提供帮助。     

CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑体系的应用

CRISPR/Cas9是一种新型的基因组定向编辑技术,近年来在烟草基因组的定向编辑中得到了广泛应用。CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在许多物种中表现出很大的潜力,为了探索CRISPR/Cas9介导烟草多基因编辑的技术体系,本文针对烟草PCS1、HMA2、eIF4E、TOM3、TOM1 5个不同性状相关的基因构建了多靶点敲除的CRISPR/Cas9系统,并借助农杆菌介导的遗传转化技术转化烟草品种K326。对阳性植株的筛选、靶位点基因组的PCR扩增与测序分析表明,构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统成功转化到烟草中,能够同时靶向突变5个基因。5个基因同时突变的检出率为53.8%,单基因的突变检出率在76.9%与92.3%之间。进一步的脱靶检测分析显示,在所预测脱靶的候选位点上均未发生脱靶现象。本文构建的CRISPR/Cas9多基因编辑系统可将多个基因进行有效突变,为烟草基因功能研究和基于CRISPR/Cas9技术的多性状改良奠定了基础。      

New vectors for simple and streamlined CRISPR–Cas9 genome editing in Saccharomyces cerevisiae

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)–Cas9 technology is an important tool for genome editing because the Cas9 endonuclease can induce targeted DNA double‐strand breaks. Targeting of the DNA break is typically controlled by a single‐guide RNA (sgRNA), a chimeric RNA containing a structural segment important for Cas9 binding and a 20mer guide sequence that hybridizes to the genomic DNA target. Previous studies have demonstrated that CRISPR–Cas9 technology can be used for efficient, marker‐free genome editing in Saccharomyces cerevisiae. However, introducing the 20mer guide sequence into yeast sgRNA expression vectors often requires cloning procedures that are complex, time‐consuming and/or expensive. To simplify this process, we have developed a new sgRNA expression cassette with internal restriction enzyme sites that permit rapid, directional cloning of 20mer guide sequences. Here we describe a flexible set of vectors based on this design for cloning and expressing sgRNAs (and Cas9) in yeast using different selectable markers. We anticipate that the Cas9–sgRNA expression vector with the URA3 selectable marker (pML104) will be particularly useful for genome editing in yeast, since the Cas9 machinery can be easily removed by counter‐selection using 5‐fluoro‐orotic acid (5‐FOA) following successful genome editing. The availability of new vectors that simplify and streamline the technical steps required for guide sequence cloning should help accelerate the use of CRISPR–Cas9 technology in yeast genome editing. Vectors pT040, pJH001, pML104 and pML107 have been deposited at Addgene ( www.addgene.org ). Copyright © 2015 John Wiley & Sons, Ltd.     

CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae

Cpf1 represents a novel single RNA‐guided CRISPR/Cas endonuclease system suitable for genome editing with distinct features compared with Cas9. We demonstrate the functionality of three Cpf1 orthologues – Acidaminococcus spp. BV3L6 (AsCpf1), Lachnospiraceae bacterium ND2006 (LbCpf1) and Francisella novicida U112 (FnCpf1) – for genome editing of Saccharomyces cerevisiae. These Cpf1‐based systems enable fast and reliable introduction of donor DNA on the genome using a two‐plasmid‐based editing approach together with linear donor DNA. LbCpf1 and FnCpf1 displayed editing efficiencies comparable with the CRISPR/Cas9 system, whereas AsCpf1 editing efficiency was lower. Further characterization showed that AsCpf1 and LbCpf1 displayed a preference for their cognate crRNA, while FnCpf1‐mediated editing with similar efficiencies was observed using non‐cognate crRNAs of AsCpf1 and LbCpf1. In addition, multiplex genome editing using a single LbCpf1 crRNA array is shown to be functional in yeast. This work demonstrates that Cpf1 broadens the genome editing toolbox available for Saccharomyces cerevisiae. © 2017 The Authors. Yeast published by John Wiley & Sons, Ltd.     

乳酸克鲁维酵母作为微生物细胞工厂的应用研究进展

乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）是一种典型的非常规酵母,在微生物基础研究和应用研究方面都有着非常重要的用途。该酵母具有食品安全级别高、蛋白分泌能力强、整合表达能力高效及大规模发酵能力优异等特点,因此,工业应用前景较为广阔。目前,乳酸克鲁维酵母作为蛋白表达系统已在食品和医药等行业中得到了广泛应用。近年来,国内外生物技术领域的科研人员以乳酸克鲁维酵母作为底盘细胞,利用合成生物学技术已经成功构建出了能够生产各种生化产品的微生物细胞工厂,该技术展示出了极大的发展潜力。本文主要对乳酸克鲁维酵母的菌种特点、合成生物学元件、遗传操作工具、基因编辑策略进行介绍,并综述乳酸克鲁维酵母作为细胞工厂的应用研究进展,可以为今后利用合成生物学方法在乳酸克鲁维酵母底盘中构建生产各种高附加值产品的高效微生物细胞工厂提供理论指导。     

Application of predictive modelling techniques in industry: from food design up to risk assessment

In this communication, examples of applications of predictive microbiology in industrial contexts (i.e. Nestlé and Unilever) are presented which cover a range of applications in food safety from formulation and process design to consumer safety risk assessment. A tailor-made, private expert system, developed to support safe product/process design assessment is introduced as an example of how predictive models can be deployed for use by non-experts. Its use in conjunction with other tools and software available in the public domain is discussed. Specific applications of predictive microbiology techniques are presented relating to investigations of either growth or limits to growth with respect to product formulation or process conditions. An example of a probabilistic exposure assessment model for chilled food application is provided and its potential added value as a food safety management tool in an industrial context is weighed against its disadvantages. The role of predictive microbiology in the suite of tools available to food industry and some of its advantages and constraints are discussed.     

食品微生物追踪溯源网络分析探讨

随着食品工业化、集团化进程的飞速发展,我国乃至全球的食品生产和消费模式都发生了巨大转变,食品微生物安全也从地域性问题向全国、全球性问题转变。如何通过可靠的溯源手段将不同地区散发病例识别为同一微生物来源污染食品引起的食品安全事件爆发,幵将污染食品准确召回,对政府监管部门和技术部门提出了挑战。本文主要从食品安全微生物溯源技术现状、发展趋势和我国食品安全微生物溯源技术应用存在的问题进行了概述,幵提出了建立食品安全监管系统微生物收集和溯源平台,构建实物与基因组溯源数据库等建议,以期给我国政府监管部门及相关技术人员提供更多的信息和借鉴。