大豆耐盐相关基因的分离及其功能鉴定

利用大肠杆菌功能表达体系,从大豆开花40d未成熟种子的cDNA表达文库中筛选获得了11个耐盐相关cDNA克隆.对其中3个克隆的插入片段进行测序.结果显示,其中的Gm1013为一尚未报道的新基因片段;GmRPS25 2编码的蛋白质序列与西红柿40S核糖体蛋白S25有91%的同源性;GmAIP 2编码的蛋白质序列与大豆根铝诱导蛋白SALI3 2有97%的同源性.其中GmAIP 2可表达分子量为30 8kD的多肽.pET GmAIP 2转化后的大肠杆菌在含800mmol/LNaCl和700mmol/LKCl的液体培养基中生长状况明显好于对照菌,即前者表现出较短的生长迟滞期和较高的生长量.     

仿刺参过氧化氢酶的克隆、表达及纯化

采用RT-PCR技术从仿刺参肠道组织中克隆了过氧化氢酶(Aj-CAT)蛋白的编码序列(CDS)。通过PCR扩增,成功构建了含有Aj-CAT编码序列的重组表达载体pET28c-Aj-CAT。通过热激法获得用于外源表达仿刺参过氧化氢酶蛋白的基因工程菌株BL21(DE3)/pET28c-Aj-CAT。IPTG诱导后,SDS-PAGE检测发现,基因工程菌能够在体外成功地表达融溶状态的仿刺参过氧化氢酶蛋白。利用镍离子亲和层析柱分离纯化,经200 mmol/L咪唑洗脱后,成功得到纯度为97.6%、能够清除过氧化氢的Aj-CAT蛋白。     

乳酸脱氢酶A(ldha)基因的克隆与原核表达

乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶,在厌氧条件下能催化丙酮酸生成乳酸;当动物体内缺乏葡萄糖时,还可氧化乳酸生成丙酮酸并经葡萄糖异生途径转变为葡萄糖。通过反转录PCR获得了Hela细胞中的ldha基因,并将它克隆到pET28a(+)载体上,获得重组表达载体pET28a(+)-ldha。重组质粒通过转化法转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中。SDS-PAGE分析表明,在1.0 mmol·L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了一条分子质量约为36 kDa的目标蛋白。     

重组仿刺参超氧化物歧化酶在大肠杆菌中表达条件的优化及分离纯化

利用基因工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)-SOD1,优化表达重组仿刺参超氧化物歧化酶蛋白(rAj-SOD1)。采用摇瓶发酵优化rAj-SOD1可溶性表达的条件,提高蛋白的表达产量。结果表明,在温度30℃、转速200 r/min、0.1 mmol/L IPTG诱导8 h条件下,菌体中rAj-SOD1蛋白表达量最大,达到315.59 mg/L。电泳检测结果表明,rAj-SOD1的纯度为96.7%,符合后续酶活要求。纯化后rAj-SOD1质量浓度为98.73 mg/L,收率为31.28%。邻苯三酚法对rAj-SOD1蛋白进行活性分析,结果表明,纯化的rAj-SOD1蛋白具有明显的抗氧化活性。     

大豆LEA蛋白Em的表达可提高大肠杆菌和烟草耐盐性

将大豆Em（LEA1）基因构建到原核表达载体pET28-Em中．转化大肠杆菌，经SDS—PAGE电泳及电喷雾质谱鉴定．结果显示，经IPTG诱导的重组菌可表达约18kDa的特异蛋白．这种蛋白具有良好的可溶性和热稳定性．在含800m mol／L NaCl培养基中，含空载体的对照菌生长迟滞期约为50h，含Em基因的重组菌生长迟滞期为32h，表明大豆Em蛋白的表达可提高大肠杆菌对盐胁迫的适应能力及耐盐性．在此基础上，构建了含Em基因的真核表达载体pBI—Em．再利用根癌农杆菌介导法将该基因转入烟草．PCR及RT-PCR结果显示，大豆Em基因已整合到转基因烟草的基因组DNA中，并能正常转录．转化率为53％．转Em基因烟草植株在含有质量分数1．5％NaCl的培养基中生长状况好于对照植株，叶片的叶绿素含量高于对照植株的叶片．结果表明，大豆Em基因的表达可提高大肠杆菌和转基因烟草的耐盐性．     

哈茨木霉丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆表达

为深入研究丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的功能,从哈茨木霉cDNA文库中克隆丝/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2A)基因,并成功构建到原核表达载体pET28a,在大肠杆菌中表达.表达产物经SDS-PAGE电泳分析,在40.5kDa处出现特异性条带.在22℃以0.5mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白大部分以可溶形式存在,在37℃以1.0mmol/L IPTG诱导时,目的蛋白则大部分以包涵体存在.全长cDNA序列为1286bp,5′非编码区91bp、3′非编码区237bp,编码327个氨基酸,没有信号肽.本研究为PP2A基因的功能验证奠定基础,以便进一步研究蛋白磷酸酶的功能,从而获得更多关于哈茨木霉蛋白磷酸酶作用机制的信息.     

海参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及活性鉴定

采用原核宿主大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了具有活性的仿刺参铜锌超氧化物歧化酶(Apostichopus japonicus Cu/Zn-superoxide dismutase,Aj-SOD1)蛋白。利用Trizol法从海参肠组织中提取总RNA,通过反转录PCR扩增获得Aj-SOD1基因的编码序列(GenBank:JX097096.1,459bp),构建克隆载体pMD18-Aj-SOD1;在目的基因两端引入(XhoⅠ/NdeⅠ)酶切位点,构建克隆载体pMD18-AjSOD1(XhoⅠ/NdeⅠ)。将此载体与表达质粒pET30a(+)分别双酶切后连接,构建重组表达载体pET30a-Aj-SOD1。转化至大肠杆菌BL21(DE3),Kan+抗性筛选阳性转化子,获得基因工程菌BL21(DE3)-pET30a-Aj-SOD1。SDS-PAGE和邻苯三酚自氧化法检测发现,经0.1 mmol/L IPTG诱导8h后,成功获得具有抗氧化活性的Aj-SOD1蛋白。     

大豆PM2蛋白及其结构域可提高烟草耐盐性

深圳市微生物基因工程重点实验室已利用大肠杆菌异源表达体系证明了大豆PM2蛋白（LEA3）的耐盐功能，并首次证实PM2蛋白序列中的22-氨基酸结构域（PM2B）为一主要耐盐结构域．为在高等植物中进一步验证PM2蛋白及22-氨基酸结构域的耐盐功能，将大豆PM2及PM2B基因克隆至植物表达载体pB1121，并利用农杆菌侵染法转化烟草叶盘，通过PCR扩增法鉴定转基因植株．结果表明PM2及PM2B基因已整合至转基因烟草的基因组DNA中，转化率分别为44．4％和62．5％．与含1．5％（质量分数）NaCl的培养基比较，转基因烟草植株的生长状况和叶片的叶绿素含量，结果表明转PM2和PM2B基因的烟草耐盐性明显高于对照（转化pB1121载体）植株．这说明转PM2和PM2B基因可提高烟草的耐盐能力．可见，PM2蛋白及22-氨基酸结构域在原核和真核细胞中的耐盐保护作用可能是相似的．     

家蚕小热休克蛋白22.6基因的生物信息学分析及其原核表达

小热休克蛋白家族成员在结构上变化很大,是细胞或生物体被多种类型的胁迫所诱导新合成的或含量增加的一类蛋白质,目前研究相对较少。从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条序列,经过Blast比对和保守结构域分析后发现该蛋白属于家蚕小热休克蛋白,将其命名为BmHSP22.6;通过PCR扩增该基因的ORF序列,将其克隆到pET28a(+)表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,获得重组质粒pET-28a-BmHSP22.6。该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得工程菌,用终浓度为1 mM的IPTG诱导目的基因表达。用镍柱分离上清裂解液,获得纯化的目的蛋白。     

补料分批培养大肠杆菌表达胸腺素α1融合蛋白

在摇瓶培养含有trymosin α1基因的重组pET32a质粒的工程菌BL21表达胸腺素α1融合蛋白的基础上,确定了分批发酵的基本培养条件.分别在B.Braun 5 L 自控发酵罐中进行了分批发酵和补料分批发酵,针对发酵过程中工程菌生长较旺盛而表达量小的情况,改变了培养方式.比较了不同的培养条件和方式下的工程菌的生长状况和融合蛋白的表达量,得到了高产量和高表达的培养条件: 在培养过程中始终保持DO值＞30%,在对数生长期溶氧供给不足的情况下,提高搅拌速度到最大并适当补充纯氧;(2)限制性流加葡萄糖;(3)培养温度35 ℃,诱导表达温度30 ℃;(4)对数中期诱导,表达时间为4～5 h;(5)在诱导前加入新鲜培养基,稀释发酵液一倍,并以稀释后的发酵液体积为准加入诱导剂.最终使菌体的干重达10 g/L,融合蛋白表达量达23.25%.     

哈茨木霉Cu-ZnSOD的克隆表达及活性鉴定

为研究哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的生物防治机制并获得与生物防治相关基因,通过构建哈茨木霉菌丝生长期的cDNA文库及对部分表达序列标签序列的测定与生物信息学分析,成功获得了哈茨木霉超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)基因的全长cDNA序列.该基因的编码框长度为465 bp,编码154个氨基酸,理论分子量为15.7 ku.将该基因构建到表达载体pET28上,转化到大肠杆菌BL21菌株中,通过诱导表达条件的优化后,经裂解菌体取上清进行酶活鉴定,确定在蛋白水平上得到了表达.蛋白质表达的最佳条件为:IPTG浓度为0.125 mmol/L,OD600为0.600,培养温度37℃,诱导时间为4 h.目的蛋白SOD的粗酶活为26.69 U/mL.该研究结果为进一步研究哈茨木霉的抗逆境胁迫分子生物学机制奠定基础.     

HCV e2-3pcx融合基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

构建了丙型肝炎病毒e2-3pcx融合基因的原核表达载体pET28b(+)-e2-3pcx,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。IPTG诱导融合蛋白高效表达。经SDS-PAGE电泳分析,结果表明在43 ku处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致。     

人参皂苷葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及包涵体的变复性

将人参皂苷葡萄糖苷酶的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。对该基因进行诱导表达,并对包涵体进行变性和复性。结果显示,经终浓度为0.5mmol/L IPTG在30℃下诱导表达4h,进行SDS-PAGE分析,目的蛋白主要以包涵体形式存在并确定其分子质量约为75ku,与理论值基本相符,表明该基因得到了表达。包涵体经过变性和稀释复性后,经TLC活性检测,能够水解底物Rb1,表明具有人参皂苷葡萄糖苷酶的活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)VR2332株ORF7的全长基因序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR扩增出完整的ORF7基因,并将PCR产物克隆至pMD-18T载体进行测序分析.双酶切测序后重组质粒pMD-18T-N得到目的片段连接至原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-N....     

人血清淀粉样蛋白A1原核表达及胶体金检测方法的建立

通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的SAA1定量检测新方法.利用大肠杆菌BL21(DE3)原核表达人血清淀粉样蛋白A1(SAA1),根据BL21(DE3)表达偏好性设计并合成SAA1蛋白基因片段,构建表达载体pET-28a-SAA1,采用CaCl2法制备BL21(DE3)感受态,热激转化法将pET-28a-SAA1转入到BL21(DE3).经表达条件优化,获得重组蛋白最佳诱导表达条件:温度30℃,时间6h,转速180rpm/min,培养基pH 7.0,IPTG浓度0.4mM,诱导表达后目的蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定,Ni柱纯化、透析、浓缩从而获得浓度为8.09mg/ml,纯度为85%的SAA1.同时,结合胶体金标记技术,建立了SAA1胶体金免疫层析试纸检测方法,线性范围0.16~500μg/ml,最低检测限0.16μg/ml,该研究为临床体外诊断SAA1快速检测提供技术基础.     

HPV16 E6基因在大肠杆菌中的表达

在大肠杆菌中表达HPV16 E6重组蛋白.利用自行构建的重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6,经IPTG诱导表达HPV16 E6重组蛋白.实验结果表明,重组质粒pET28a(+)-HPV16 E6在大肠杆菌中经IPTG诱导成功表达出HPV16 E6重组蛋白.HPV16E6重组蛋白的制备为宫颈组织中HPV16型感染的早期诊断和宫颈癌治疗性疫苗的研制奠定了物质基础.     

哈茨木霉Chiv基因的原核表达及优化

通过筛选哈茨木霉的DNA文库,克隆到Chiv基因的cDNA全长序列.以连接有哈茨木霉Chiv基因的质粒pBK902为模板,设计含有EcoRI和XhoI酶切位点引物,采用PCR方法扩增得到具有完整开放阅读框的目的基因;将目的基因连接到表达载体pET28上并转化大肠杆菌BL21菌株中,成功地获得了大量的阳性转化子.质粒通过EcoRI和XhoI酶切鉴定及测序鉴定,证明Chiv基因成功地转化到大肠杆菌中.重组大肠杆菌经IPTG诱导表达及SDS-PAGE检测后,发现特异的蛋白表达条带,其分子量为50 kDa左右.通过对诱导剂量与诱导时间等因素的优化,结果显示几丁质酶的最佳诱导时间为13 h,最佳诱导剂浓度为1 mM,为几丁质酶的工业化生产奠定基础.