1株链霉菌产ε-聚赖氨酸的结构及分子量分析

目的:研究确定1株疑似产ε-聚赖氨酸链霉菌所合成产物的化学结构和分子量。方法:采用D152树脂离子交换法分离纯化ε-聚赖氨酸;薄层色谱分析化学组成;紫外可见扫描光谱分析有机官能团;长程异核位移相关谱分析赖氨酸分子间的键连接方式;Tricine-SDS-PAGE电泳分析ε-聚赖氨酸分子量。结果:薄层色谱显示赖氨酸为纯化产物的惟一化学组成;纯化产物200nm处有最大吸收峰,260~280nm蛋白特征吸收处无吸收;长程异核位移相关谱显示纯化产物为ε-聚赖氨酸;所分离ε-聚赖氨酸分子量约为3300u左右。结论:菌株GIM8发酵产物为ε-聚赖氨酸;薄层色谱、紫外可见扫描光谱以及长程异核位移相关谱三者结合适用于ε-聚赖氨酸的化学组成和结构分析。     

ε-聚赖氨酸产生菌的筛选方法改进

改进了ε-聚赖氨酸(ε-PL)产生菌的筛选方法。在加有复合抑制剂的初筛平板上涂布土壤悬液,于30℃培养7 d后,将琼脂整体揭下,平铺到另一加有美兰的琼脂上。挑取形成透明圈的137株菌进行摇瓶发酵,发酵液与Dragendorff试剂和甲基橙反应,有50株呈阳性。通过薄板层析,确定有42株菌的产物含有赖氨酸聚合物。通过水杨醛保护氨基的化学法对产物进行了酰胺键连接方式的研究,确定了聚赖氨酸是由ε-NH2和α-COOH形成的ε-酰氨键聚合而成。通过生理生化特征和分子生物学鉴定,表明其中的一株菌为链霉菌属中的稠李链霉菌Streptomyces pade-nus,其初始菌的摇瓶产量可达0.8 g/L。     

乳酸发酵短杆菌中的赖氨酸代谢控制发酵

以本室选育的赖氨酸产生菌AL 0 39为出发菌株 ,以亚硝基胍诱变 ,筛选到一株氟丙酮酸敏感型突变株FP 0 94,其赖氨酸产量比出发菌株提高 37.5 %。进而研究了生物素、醋酸钙对该菌产赖氨酸的影响。     

ε-聚赖氨酸产生菌的鉴定及产物特性研究

对土壤中分离获得的1株ε-聚赖氨酸产生菌YB12进行形态、生理生化特征和16S rDNA分析,将其归类为白色链霉菌(Streptomyces albus).通过薄层色谱、高效液相色谱、红外光谱、1H NMR和Tricine-SDS-PAGE 等分析方法对YB12发酵产生的ε-聚赖氨酸进行产物特性和抑菌效果研究.结果表明:白色链霉菌YB12所产聚赖氨酸的单体连接方式为ε型,分子质量为4.85kDa.对其敏感菌枯草芽孢杆菌的抑菌效果明显.     

白色链霉菌聚赖氨酸抑菌作用的研究

筛选到1株聚赖氨酸(PL)产生菌白色链霉菌(Strcptomyces albus).发酵液经过Ambcrlite IRC-50离子交换粗分离和Sephadex G-25凝胶层析精制,得到纯化的白色链霉菌聚赖氨酸(PL110).SDS-PAGE分析其分子量为5kDa.应用牛津杯法分析PL110对多种病原菌的抑制作用并测定最小抑菌浓度(MIC).抑菌稳定性实验表明,高温加热后Streptomyces albus所产生PL110的抑菌作用没有下降;其在低pH值条件下有较好的抑菌效果.最后,应用扫描电镜初步探索了聚赖氨酸的抑菌机理.     

食品生物防腐剂产生菌门间远缘细胞融合研究

乳酸链球菌素(Nisin)和ε-聚赖氨酸是由微生物产生的安全的天然防腐剂,分别由乳酸链球菌和白色链霉菌产生。这两种生物防腐剂的抑菌效果不同,存在互补性。为了获得具有更广谱抑菌作用的优良性状的菌株,探索远缘细胞融合的可行性,以自主分离的ε-聚赖氨酸产生菌白色链霉菌YB12和Nisin产生菌NZ9700作为亲本菌株,通过原生质体融合技术将两个菌株进行门间的细胞融合;通过抗药性筛选、形态学观察、SRAP-PCR分子鉴定,成功获得两株稳定遗传的融合菌株。同时对融合菌株的抑菌活性进行了检测。     

微生物合成ε-聚赖氨酸的结构鉴定及其抑菌活性的研究

在对土壤中筛选获得的一株白色链霉菌Z-9发酵条件初步研究的基础上,利用高效液相色谱(HPLC)、液相-质谱联用(LC-MS)、核磁共振(NMR)、凝胶渗透色谱(GPC)等分析检测方法对该白色链霉菌发酵产生的ε-聚赖氨酸进行了结构鉴定和抑菌活性研究。研究结果表明:白色链霉菌Z-9发酵产生的聚赖氨酸是由赖氨酸单体通过ε-NH2和α-COOH形成ε-酰氨键聚合而成,平均分子质量为4 210,并且对敏感菌——枯草芽孢杆菌生长有强烈的抑制作用。     

提高ε-聚赖氨酸产量的研究进展

ε-聚赖氨酸是自然界中所熟知的由微生物产生的氨基酸同型聚合物,由于从自然界中筛选聚赖氨酸产生菌所产生的产量极低,提高产量成为亟待突破的生产难题.本文介绍了国内外已报道的通过诱变、筛选获得ε-聚赖氨酸高产菌株的方法,以及通过优化培养条件提高ε-聚赖氨酸产量的方法,通过分析各种方法的优缺点,对提高ε-聚赖氨酸产量的途径提出建议.特别对初步大量筛选ε-聚赖氨酸产生菌的方法进行综述、分析,以期得出快速高效的筛选方案.     

一株牛瘤胃微生物的分离纯化及其赖氨酸合成能力的测定

为了解决牛瘤胃微生物合成的赖氨酸不能满足小肠营养需要的问题,经赖氨酸缺陷培养基厌氧培养,成功从牛瘤胃液中分离出一株能够合成并向外界释放游离赖氨酸的菌株。经对16SrDNA基因序列的分析,该菌与阴沟肠杆菌的同源性最强,序列相似性为99%,且革兰染色镜检结果及理化性质相一致,确定其为阴沟肠杆菌;经游离赖氨酸含量检测,该菌赖氨酸合成量为4.01mg/L,明显高于对照组1.20mg/L的含量。     

杀菌温度对乳化香肠腐败菌群的影响与靶向抑制

采用90、95、100、105、110 ℃ 5 种温度对塑料肠衣灌装的乳化香肠进行杀菌,杀菌时间均为20 min,研 究25 ℃贮藏过程中不同杀菌温度乳化香肠中腐败菌的多样性变化及菌群变化规律,并测定8 种抑菌剂对分离所得菌 株的抑制效果。结果表明：随着杀菌温度的升高,以菌落总数为指标的产品货架期越长,分离得到的腐败菌菌相也 趋于简单。经比较分类,从不同杀菌温度样品中共分离得到10 株腐败菌,根据形态学、16S rDNA菌种鉴定和生理 生化特征分析,分离得到的10 株腐败菌均为芽孢杆菌属。8 种抑菌剂对10 株腐败菌表现出不同的抑制效力,其中 乳酸链球菌素（nisin）和ε-聚赖氨酸具有普遍、明显的抑菌活性;葡萄糖酸-δ-内酯、乳酸钠和双乙酸钠对多数菌株 抑制效果良好;山梨酸钾、亚硝酸钠和脱氢乙酸钠仅选择性地对个别菌株表现出一定的抑制作用。结合不同杀菌温 度乳化香肠的腐败菌菌相分析结果,90、95、100 ℃杀菌样品可以选择Nisin和ε-聚赖氨酸作为抑菌剂;105、110 ℃ 杀菌样品可以根据生产需求选择Nisin、ε-聚赖氨酸、乳酸钠和双乙酸钠4 种抑菌剂。     

梨果棒曲霉素产生菌的分离及ITS区鉴定

以莱阳仕梨、阳信鸭梨腐败果为材料,分离棒曲霉素产生菌并对其进行形态及ITS区鉴定。试验采用高效液相色谱法(HPLC)检测棒曲霉素含量,确定所分离菌株产毒能力,通过对产毒菌株保守区域ITS扩增测序,得到的序列号与GenBank中核酸数据库进行对比,初步确定了各菌株的亲缘菌,建立系统发育树。结果表明:分离得到10株不同能力的棒曲霉素产生菌,7株为青霉属,2株为曲霉属,1株为镰刀菌属;进化发育关系为:P-9菌为一类群,其他9株菌为另一类群,彼此之间存在不同程度的进化关系。易污染梨果的产毒霉菌主要为青霉菌,分离得到P-1菌株的产毒能力最强。     

微生物发酵生产腺苷的研究

以肌苷产生菌BacillussubtilisJSIM 10 19为出发菌株[1] ,用物理、化学诱变剂对亲株进行诱变处理 ,获得了 3株黄嘌呤营养缺陷型突变株MG 16、H 12、AD 6 ,获得的黄嘌呤营养缺陷型突变株经单菌分离后 ,36℃培养 72h在培养基中最高积累 10 g/L腺苷 ,一般产腺苷7～ 8g/L     

ε-聚赖氨酸及其生物合成的研究进展

综述ε-聚赖氨酸的研究情况,包括ε-聚赖氨酸的发现和用途,ε-聚赖氨酸产生菌的筛选和生物合成机理的研究,ε-聚赖氨酸的产生菌的改造以及发酵生产等。     

赖氨酸生产菌种黄色短杆菌XQ782生理生化特性和发酵生产的研究

前言国外工业发酵法生产赖氨酸主要采用谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌等的变异株.国内生产赖氨酸的单位采用的是北京棒状杆菌AS1.299的突变株. 我国采用棒状杆菌(钝齿棒状杆菌AS1.542和北京棒状杆菌AS1.299)或它们的突变株发酵生产谷氨酸钠(味精)多年,味精厂环境中或多或少存在着能感染北京棒状杆菌的噬菌体。如果在味精厂用北京棒状杆菌AS1.299的突变株进行赖氨酸生产,遭受这种噬菌体感染的潜在危机是存在的。要发展多种氨基酸生产,有必要选育在分类学上属于另一个种的赖氨酸生产菌种。一九八一年三月,无锡轻工业学院选育得黄色短杆菌抗药性突变株FRR’961。在适宜的培养基中,该菌能在摇瓶条件下发酵累积L—赖氨酸单盐酸盐44.5g/l,此时L—赖氨酸单盐盐酸对葡萄糖的转化率为35.6%(均为补足摇瓶发酵液体积后的校正数据)。一九八二年五月至一九八三年四     

ε-PL聚赖氨酸产生菌原生质体的制备与再生

本实验对ε-聚赖氨酸产生菌-白色链霉菌的原生质体制备、再生条件进行了研究,建立了白色链霉菌原生质体诱变体系.在此基础上,通过对原生质体进行脉冲光诱变,氦氖激光诱变,筛选得到一株高产菌株;通过双层平板实验证明比出发菌株抑菌圈的H/C大0.28～0.45cm;通过发酵证明比出发菌株产ε-聚赖氨酸的能力提高40%以上.     

传统发酵牦牛酸奶中马克斯克鲁维酵母菌的分离鉴定及系统发育分析

对川西北部分牧区的10 份传统发酵牦牛酸奶样品进行酵母菌的分离,通过常规形态特征和26S rRNA基因测序分析鉴定出16 株马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）。同源性分析显示16 株分离菌与已知马克斯克鲁维酵母的同源性高达99.3%～100%。16 株分离菌中形成明显的两种序列类型,其中10 株分离菌与另外6 株分离菌相比在扩增片段的第537位点上发生碱基缺失、第554位点上碱基由G突变为A、第564位点上碱基由A突变为T。系统进化分析显示两种序列类型的分离株也形成两个独立进化分支。     

利用抗性筛选和基因组重排技术选育ε-聚赖氨酸高产菌株

聚赖氨酸产生菌Streptomyces albulus M-Z18的摇瓶产量较低,仅为1. 60 g/L。利用抗性筛选和基因组重排技术对S. albulus M-Z18进行菌种选育以获得高产ε-聚赖氨酸菌株。通过引入巴龙霉素抗性到S. albulus M-Z18中,获得两株性状优良的菌株S. albulus P-1和S. albulusP-2,ε-聚赖氨酸产量分别为2. 20 g/L和2. 16 g/L,单位菌体ε-聚赖氨酸合成能力分别为0. 41g/g和0. 39 g/g,作为基因组重排的亲本菌株;运用正交实验优化实验条件,最终获得一株高产ε-聚赖氨酸的融合子S. albulus G12,产量为2. 73 g/L,相比M-Z18提高了70. 63%。     

ε-聚赖氨酸高产菌的新型筛选模型

建立了一种简单、快速筛选ε-聚赖氨酸高产菌的新模型.结果表明,在筛选培养基中添加终浓度为0.0015％的中性红,ε-聚赖氨酸产生菌周围形成明显的色素透明圈,且色素透明圈圈径大小和ε-聚赖氨酸含量呈正性相关,从而可以通过色素透明圈径大小简单快速地筛选出ε-聚赖氨酸高产菌株.综合来看,ε-聚赖氨酸高产菌的新型筛选模型简单直观而且经济高效,可大大减小筛选工作量,提高筛选效率,为ε-聚赖氨酸产生菌株和高产菌株的筛选工作提供了方便.     

1株唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在湿米粉中的产毒规律分析

目的:了解防腐剂(脱氢乙酸、ε-聚赖氨酸盐酸盐)和培养温度对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌在湿米粉培养基上生长及产毒的影响。方法:以1株自食物中毒事件样品中分离得到的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(椰毒假单胞菌酵米面亚种)菌株为研究对象，分别接种至添加脱氢乙酸(1.0 g/kg)、添加ε-聚赖氨酸盐酸盐(0.25 g/kg)以及未添加防腐剂的湿米粉培养基中，置于10，26，36 ℃条件下培养，研究其在湿米粉中生长及产毒情况。采用修正的 Gompertz 模型构建初级生长模型。结果:在10 ℃条件下该菌生长缓慢且未产生米酵菌酸；在26 ℃条件下培养至96 h，该菌对照组和各试验组产生的毒素均超过500 μg/kg，在添加脱氢乙酸的样品中最早产生米酵菌酸，其最高质量浓度(1 484 μg/kg)略低于对照组(2 561 μg/kg)和ε-聚赖氨酸盐酸盐组(2 762 μg/kg)；在36 ℃条件下该菌生长最为快速，各组产毒量均低于350 μg/kg。结论:湿米粉在10 ℃贮存可有效降低产生米酵菌酸的风险，脱氢乙酸、ε-聚赖氨酸盐酸盐均未能阻止唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的生长和产毒，需进一步探索能起作用的防腐剂，制定多手段结合的控制措施。     

从土壤中分离L-色氨酸生产菌株及其高产诱变选育的研究

根据微生物菌株生物合成L-色氨酸代谢途径的特性,设计了产色氨酸的细菌选择性分离筛选培养基,对从土壤中分离得到的832株细菌通过初筛和复筛,筛选到6株L-色氨酸产生菌株,并对其进行了初步分类鉴定,确定了这6株菌均为为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutanicum)。其中1株可产L-色氨酸0.85g/L,进一步通过NTG以及紫外线照射多重诱变育种得到苯丙氨酸和酪氨酸双重营养缺陷型与多种色氨酸结构类似物抗性突变株,遗传性状稳定,产酸量达到10.82g/L。