保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌抗噬菌体菌株的原生质体制备及融合

为获得具有抗噬菌体功能且发酵性能优良的乳酸菌融合子,采用单亲灭活及正交分析方法,研究了保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌抗噬菌体菌株的原生质体制备及融合条件。结果表明：保加利亚乳杆菌原生质体制备的最适条件是以磷酸盐缓冲液和甘露醇制作的高渗溶液为原生质体稳定剂,1.0 mg/mL的溶菌酶36 ℃处理30 min,原生质体的形成率为（89.02±2.31）%,再生率为（4.62±0.22）%。嗜热链球菌抗噬菌体菌株原生质体制备的最适条件是以Tris-HCl和蔗糖制作的高渗溶液为原生质体稳定剂,0.1 mg/mL的溶菌酶42 ℃处理30 min,原生质体的形成率为（99.15±0.23）%,再生率为（5.79±0.17）%。单亲灭活保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌抗噬菌体菌株原生质体融合的最适条件为聚乙二醇6000（质量浓度为400 g/L,添加0.01 mol/L CaCl2、0.02 mol/L MgCl2）40 ℃促融2 min,融合率可达（1.85±0.12）×10－6。所得融合子各项性能优良,适合于酸奶生产。     

非对称灭活双亲原生质体融合法选育产果糖基转移酶的米曲霉新菌株的研究

本文以生产果糖基转移酶的米曲霉SBB201(Aspergillus oryzae SBB201)为出发菌株,通过紫外联合氯化锂诱变获得产酶性能与生长性能各自优良的米曲霉菌株UV-A与UV-B,采用非对称灭活法对这两株菌株的原生质体进行紫外以及热灭活双灭活,然后在PEG作为融合剂的介导下进行原生质体双亲融合,筛选出一株果糖基转移酶生产能力有较大提高的米曲霉新菌株,其酶活力达到了172.95 U/g,比出发菌株提高了64.57%。     

热-紫外灭活双亲原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究

对米曲霉（AS3．951）GIM3．13和CICC2339的原生质体分别进行热灭活及紫外灭活,然后对灭活双亲用PEG（6000）作融合剂进行原生质体融合。融合实验最佳PEG（6000）浓度为35％,溶液pH值为7．5,融合率为4．24％。从融合子中选出17株生长速度快、菌落直径大的融合株,接种到酪素平板上测其Hc值,并与亲本菌株进行比较。结果发现,其中8株融合株的Hc值明显比生长速度快而产酶量低的亲本菌株GIM3．13大,菌株16号的Hc值还超过了产酶量高的亲本菌株CICC2339。     

土曲霉与红曲霉双灭活原生质体融合选育洛伐他汀高产菌株

研究原生质体融合技术选育洛伐他汀高产菌株的方法。土曲霉(Aspergillus terreus)和红曲霉(Monascus anka)用混合酶液(体积分数0.5%溶菌酶,0.3%纤维素酶,0.3%蜗牛酶)分别酶解5.0h和3.5h制备原生质体,土曲霉原生质体和红曲霉原生质体在紫外线(20 W,30cm)下分别照射5min和4min灭活,灭活后混合并用PEG(体积分数30%PEG,0.05mol/LCaCl2,0.05mol/L甘氨酸)介导融合。在187株融合子中筛选得到27株洛伐他汀产量高于红曲霉出发菌株的融合子,其中有7株的洛伐他汀产量是出发菌的2倍以上。双灭活原生质体融合方法成功选育出红曲霉洛伐他汀高产菌株。     

羊奶酸奶优良发酵菌株的筛选

以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为发酵菌种,选育适合羊奶酸奶发酵的优良菌株。通过对4株保加利亚乳杆菌和4株嗜热链球菌在羊乳中发酵特性进行研究。结果表明,4株保加利亚乳杆菌中,L.b-800菌株产酸速度较快,后酸化能力较弱,且乳酸菌活菌数较高;4株嗜热链球菌中,S.t-499菌株产酸速度较快,产粘能力较强,且乳酸菌活菌数较高。优良菌株L.b-800和S.t-499配比为2:1～1:2时,羊奶酸奶发酵酸度适中,粘度适宜,无乳清析出,乳酸菌活菌数高达1×109cfu/mL以上。     

四川牧区优质乳酸发酵剂的筛选

从四川省甘孜州、阿坝州牧民家中采集自然发酵乳中分离出109株乳酸菌(杆菌59株,球菌50株),结合酸度和感官评价菌株进行剔除,筛选出其中6株乳酸菌.对这6株乳酸菌进行生理生化鉴定和酸奶发酵实验.结果表明,6株乳酸菌作为发酵剂生产酸奶感官性能优良.不同菌株发酵后酸奶酸度、黏度、感官、风味、蛋白质分解各不相同,最适合单株发酵的菌为3和5菌株,其次为4和6菌株,1和2菌株比较适合高酸度酸奶发酵生产.     

嗜热链球菌抗噬菌体菌株的选育及其发酵特性

为了筛选到适合酸奶生产的抗噬菌体菌株,采用双层平板法及自然选育的方法,从酸奶异常发酵液中分离到3种不同的噬菌体,并获得了4株具有抗这些噬菌体能力的非溶源性抗性菌株St1、St2、St3、St4,对这4株抗性菌株进行20次传代和酸奶发酵实验,结果表明其抗性稳定,其中St3发酵酸奶产酸可达110°T,凝乳时间与出发菌株基本相当,在高噬菌体浓度下发酵,产酸正常,黏度、硬度、口感较好,凝乳时间较短、乳清析出较少并且富集培养后菌体浓度可达1010CFU/mL,适宜于工业生产。     

单亲灭活德氏乳杆菌和乳酸乳球菌原生质体融合条件优化

利用单亲灭活原生质体技术对德氏乳杆菌FQ菌株和乳酸乳球菌FL菌株的原生质体进行融合,考察原生质体制备、再生和融合条件的影响因素。结果表明:制备德氏乳杆菌FQ菌株原生质体最适条件为温度37℃,在含有10μg/mL变溶菌素和1mg/mL溶菌酶溶液中超声处理90min。在此条件下,原生质体再生率可达6.36%。乳酸乳球菌FL菌株添加1mg/mL甘氨酸处理后,用10mg/mL溶菌酶37℃恒温酶解90min,原生质体形成率可达99.97%。65℃处理乳酸乳球菌FL菌株原生质体120min,原生质体灭活率可达96.89%。融合实验结果表明,在PEG6000 400g/L(含0.02mol/L MgCl2和0.01mol/L CaCl2)、融合时间5min、融合温度20℃、pH6.5的条件下促融,德氏乳杆菌FQ菌株和乳酸乳球菌FL菌株原生质体的融合率可达2.72×10-6。     

利用原生质体融合技术构建梨酒酵母工程菌

以菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae YDJ05及产香酵母Issatchenkia orientalis YS03为融合亲本X和Y,通过原生质体融合技术构建适合梨酒酿造的酵母工程菌,研究结果表明:利用EMS诱变亲本菌株Y,得到了一株精氨酸营养缺陷型菌株,亲本菌株X和Y采用蜗牛酶液在35℃下处理100min,得到菌株X、Y的原生质体融合率分别为93.6％、94.2％,再生率分别为27.8％、31.6％.以加热的方式灭活亲本菌株X,灭活时间为14min.在以PEG为促融剂的条件下对两株菌进行原生质体融合,经过优选得到融合子D J02,其产酒精率、产香率等指标最优,分别达到了9.87％、0.37g/L.     

嗜热链球菌抗噬菌体菌株的选育

研究以酸奶生产菌株嗜热链球菌S2为出发菌株。采用自然选育的方法筛选出其抗噬菌体突变株。获得4株生产性能较好的抗噬菌株KS21、KS22、KS23、KS24,溶源性检测其为非溶源菌。对4株抗性菌株进行20次传代和酸奶发酵实验,结果表明抗性稳定,其中KS23发酵酸奶产酸达109°T,凝乳时间与出发菌株相当。细胞全蛋白SDS-PAGE电泳分析显示突变菌株与出发菌株在某些蛋白表达上有所差异,可能是抗性产生的原因。     

传统藏式牦牛酸奶中优良乳酸菌筛选与产香性能分析

本研究旨在从我国传统发酵乳制品中筛选发酵性能和产香性能优良的乳酸菌。从四川阿坝藏族羌族自治州采集传统藏式牦牛酸奶样品并分离乳酸菌,经遗传稳定性、发酵时间及感官评价等初筛,并结合固相微萃取顶空气相色谱-质谱联用分析菌株产香性能进行复筛。结果显示,在26份样品中有5株发酵性能较优良的菌株,发酵时间为4.5~7.5 h,发酵终点酸度为74.0~78.4 °T,各菌株发酵乳感官评价良好。顶空气质结果发现菌株AB1504产生的乙醛(1.13 mg/L)、双乙酰(4.90 mg/L)等关键风味物质含量最高。研究结果表明从传统藏式牦牛酸奶中筛选到的嗜热链球菌AB1504发酵性能和产香性能优异,具有商业应用的潜力。     

灭活原生质体融合技术提高豆豉纤溶酶菌产酶量

以豆豉纤溶酶产生菌株蜡状芽孢杆菌UV-101和MW-101作为亲本菌株,首先对亲本原生质体进行紫外灭活,然后用PEG(6000)作为融合剂对灭活双亲进行原生质体融合.通过对再生平板上长出的融合子进行平板初筛和摇瓶复筛,最终获得一株高产菌株PF-101,其酶活比亲本菌株分别提高了74.47%和86.36%,并且该菌株具有良好的遗传稳定性.     

双亲灭活的原生质体融合株啤酒酵母DR9-2的构建及其特性的研究

啤酒酵母菌株JW1-1发酵液中的双乙酰、总高级醇的含量较低,但发酵度较低,发酵液中的乙醛含量较高;啤酒酵母菌株NW7-45发酵度较高,发酵液中的乙醛含量较低,但发酵液中的双乙酰、总高级醇的含量较高.为了得到优良的菌株,以紫外线灭活的菌株JW1-1原生质体和热灭活的菌株NW7-45原生质体为亲本进行融合.经三角瓶发酵筛选,得到较优良的融合株DR9-2和DR9-24.其中融合株DR9-2以12°Bx麦芽汁为培养基,用500L的发酵罐在12℃下发酵,发酵11d发酵液的发酵度为69.5%,发酵液中的双乙酰、乙醛和总高级醇的含量分别为0.0124mg/L、7.70mg/L和61.88mg/L.从融合株DR9-2的主要发酵特性和啤酒口感品评的结果表明,该菌株在啤酒酿造工业中具有应用前景.     

原生质体融合选育乳清发酵生产燃料乙醇的酵母菌种

以酿酒酵母AY-5和克鲁维酵母TY-13为出发菌株进行原生质体融合选育乳清发酵优良菌种。通过对原生质体融合条件的优化获得152株初筛菌株,经麦芽糖和乳糖杜氏管试验复筛得4株融合子。对4株融合子进行乳清发酵实验,从中选出1株发酵优良的菌株R-1,与亲本比较,发酵速度明显提高。     

德氏乳杆菌保加利亚亚种抗噬菌体菌株的选育

从酸奶异常发酵液中分离纯化保加利亚乳杆菌Lb2噬菌体LP5。以自然选育方法筛选出其抗噬突变株,再经紫外线诱变,获得3株产酸与出发菌株相当的抗噬株N491,N492,N761。对三抗株进行多次传代和酸奶发酵试验,结果表明,三抗株的抗噬性稳定,其中N761酸奶发酵产酸达94°T,酸奶的组织状态及风味优于Lb2,可应用于酸奶的发酵生产。     

甘南牧区酸奶中乳酸菌的分离与发酵性能研究

从甘南牧区牧民家中采集自然发酵的酸奶,用选择性培养基分离出12 株乳酸菌菌株,通过传代培养,筛选出A、B、C、D、E5 株优良乳酸菌菌株,经初步鉴定,其中4 株为球菌,1 株为杆菌。对这5 株菌进行发酵性能测定,并对其发酵生产的酸奶进行感官评价。结果表明,这5 株菌作为发酵剂生产酸奶的感官性能优良,其中最适合单菌株发酵的是杆菌C 和球菌A。     

高产酸性能乳酸菌的筛选及产酸机理研究

为选择产酸性能优良的乳酸菌用于酸奶生产,本实验对生产酸奶常用的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的产酸能力进行了研究,测定了其发酵过程中滴定酸度和pH的变化,并对其产酸机理进行了初探。研究结果表明,乳酸菌各菌株的产酸能力各不相同,菌株TM111-S产酸速度较快,pH下降速度较快,发酵凝乳最终pH较低。乳酸菌产酸能力与菌体细胞内β-半乳糖苷酶的量相关。筛选性能优良乳酸菌菌株对生产高质量的酸奶,提高工业化生产效率具有一定的意义。     

利用全基因组改组技术提高SubtilosinA的产量

以Bacillus subtilis nja A1B2-2为出发菌株,在最佳的原生质体形成、再生和融合条件的基础上,将前期经过理化诱变筛选的四株高产菌株进行两轮基因组改组。结果表明,当以0.6mol/L Na Cl为高渗洗涤液,0.1mg/m L溶菌酶酶解40min后,涂布在以SMM为高渗体系的NB再生培养基上,原生质体形成率达到95.49%,再生率为89.25%。优化原生质体的融合条件,融合率达到了1.39×10-3。在此基础上将四株高产Subtilosin A菌株进行两轮全基因组改组,结合双亲灭活的筛选方法,挑选出一株遗传性状稳定的高产菌株R2-264,产量达17.59mg/L,比出发菌株提高了3.58倍。     

紫外灭活原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究

对米曲霉AS3.951和CICC2339的原生质体进行紫外灭活,然后对灭活双亲用PEG作融合剂进行原生质体融合。从融合子中选出10株生长速度快、菌落直径大的融合株,接种到酪素平板上测其Hc值,并与亲本菌株进行比较。结果发现,10株融合株的Hc值均比生长速度快而产酶量低的亲本菌株AS3.951大,菌株AC211、AC214、AC215、AC217、AC219的Hc值还超过了产酶量高的亲本菌株CICC2339。     

运用紫外线灭活原生质体融合技术选育高产酯酒精酵母的研究

本文运用紫外线灭活原生质体融合技术，在对酒精酵母（Ｋ酵母）和产酯酵母（Ｆ２）的原生质体形成率及紫外线灭活条件进行研究的同时，通过筛选不影响亲株代谢性能的天然耐药性为遗传标记，简化融合子检出步骤，成功地对酒精酵母和产酯酵母进行了属间细胞融合，获是６株遗传性状稳定的融合子。经发酵实验，最终获得既具有酒精酵母的高产酒特性，又具有产酯酵母的高产酯特民生的发酵性能稳定的融合子ＦＫ３－２７。