稀土元素对谷氨酸发酵产酸及其谷氨酸脱氢酶的影响

以目前我国谷氨酸发酵广泛使用的谷氨酸棒杆菌S9114 为实验菌株 ,研究了稀土元素对谷氨酸发酵产酸及其谷氨酸脱氢酶的影响。结果表明LaCl3、CeCl3和NdCl3浓度分别为 0 72 0、0 0 71和 0 0 0 7mmol/L时 ,促使谷氨酸发酵产酸水平提高 6%～ 8% ,对菌体的GDH NADPH的酶活性有显著的激活作用。实验还表明 ,稀土元素对纯化GDH NADPH的活性也有一定的调节作用     

不同溶氧条件下谷氨酸棒杆菌发酵过程代谢物及关键酶酶活分析

分别在10%和30%溶氧条件下,使用2L罐进行谷氨酸发酵,分析了这2种发酵状态下细胞外和细胞内代谢物含量和关键酶活性变化。结果表明,10%溶氧和30%溶氧情况下产酸分别达到36.02 g/L和38.22 g/L,表明高溶氧适合产酸。溶氧低时,乳酸脱氢酶在发酵中期活性很高,从酶学角度揭示溶氧低易生成乳酸,却不利于谷氨酸的积累。不同溶氧水平下,α-酮戊二酸、丙酮酸乳酸、柠檬酸、琥珀酸表现出相似的变化规律,但其在成峰时间和最大浓度有一定差别。发酵后期胞外各有机酸含量出现一定程度的下降,表明其可作为碳源被细胞重新利用。     

不同乳酸菌产谷氨酸脱羧酶特性研究

通过对发酵乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌所产谷氨酸脱羧酶(GAD)的酶学性质进行比较,分析酶反应温度、pH值、磷酸吡哆醛(PLP)浓度、酶浓度与酶活性的关系,并对高活性乳酸菌GAD酶的米氏常数进行测定。结果表明,3株乳酸菌GAD酶的最适温度为40℃,最适pH值为4.5,在PLP添加量为0.1mol/L时,对酶的促进作用达到最高,发酵乳杆菌Km值为0.05215mmol/L,最大反应速度Vmax=2.08μmol/min;短乳杆菌Km值为0.0243mmol/L,最大反应速度Vmax=1.01μmol/min。     

pH值对运动发酵单胞菌葡萄糖代谢酶活性影响的研究

以运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)ATCC31821为模式菌株,研究pH值条件对其葡萄糖代谢关键酶活力的影响.结果表明:发酵液pH5.5时,胞内乙醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力较高,而异柠檬酸脱氢酶活性较低,能促进乙醇的生成;pH 5.0时,苹果酸脱氧酶的酶活力较低,使糖酵解反应向另一个方向发生偏移,促进乙醇的形成.pH 4.0～6.5时,丙酮酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活力水平相差不大,说明pH值对这2种酶的活性影响甚微.因此,pH5.0～5.5,代谢途径(如糖酵解途径、ED途径等)中的胞内代谢酶活性增强,有利于乙醇的产生.     

细菌纤维素/γ-聚谷氨酸复合膜发酵条件的优化

在发酵培养基中添加γ-聚谷氨酸(γ-PGA),可以制备具有更优性能的细菌纤维素(BC)复合膜.采用响应面分析法优化细菌纤维素/γ-聚谷氨酸复合膜发酵生产工艺,首先通过Plackctt-Burman试验设计对影响复合膜发酵生产的8个因素进行筛选,得到3个关键影响因子:聚谷氨酸添加浓度,pH和γ-聚谷氨酸的添加时间;然后用最陡爬坡试验逼近响应值的最大区域;最后通过Box-Behnken设计及响应曲面分析确定了各考察因子的最佳取值:葡萄糖25g/L,柠檬酸6g/L,Na2HPO42g/L,γ-聚谷氨酸1.04g/L,γ-聚谷氨酸的添加时间4h,发酵初始pH5.0,温度30℃,发酵周期7d.在优化条件下复合膜的湿重达到61.07g/100mL培养基试验值与预测值误差为-3.05%,较初始培养基复合膜产量提高9 1.32%.     

串联表达NAD激酶和谷氨酸脱氢酶基因对L-谷氨酸产量的影响

由ppnk和gdh编码的NAD激酶和谷氨酸脱氢酶是L-谷氨酸合成途径中的两个重要酶。以谷氨酸生产菌CN1021基因组为模板PCR扩增ppnk和gdh基因并转化至该菌中,检测上述两个基因单独表达和串联表达对L-谷氨酸产量的影响。结果表明,当两个基因单独过表达时,其酶活性分别提高2.4和2.1倍,L-谷氨酸产量分别提高7.9%和1.4%。当将两个基因串联表达时,其酶活性分别提高2.0和1.5倍,L-谷氨酸的产量却提高了13.2%。说明过表达ppnk和gdh能够有效提高L-谷氨酸产量,且具有协同作用。     

NCgl1221敲除和pyc过表达对谷氨酰胺发酵的影响

谷氨酰胺在生命活动中具有重要的作用,已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。谷氨酸是谷氨酰胺生物合成的前体物质,也是谷氨酰胺生产过程中最常见的副产物。研究发现,NCgl1221基因的编码蛋白是谷氨酸分泌的重要载体,丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌回补途径中的关键酶。为减少谷氨酰胺发酵过程中谷氨酸的积累量并提高谷氨酰胺产量,本研究利用同源重组技术敲除谷氨酰胺生产菌GM34的谷氨酸分泌载体编码基因NCgl1221,获得GM34ΔNCgl1221菌株;构建了丙酮酸羧化酶基因pyc过表达菌株GM34-pXMJ19pyc。5 L罐发酵实验表明,NCgl1221基因缺失可以使得谷氨酸积累量降低19.05%,过表达pyc基因使得谷氨酰胺产量和转化率分别提高5.54%和2.37%。可见,敲除NCgl1221、过表达pyc能够有效降低谷氨酸分泌并提高谷氨酰胺产量。     

发酵玉米粉酶解液制备天然鲜味料

本研究以玉米粉为主要原料,利用谷氨酸棒杆菌发酵生产新型天然鲜味料。首先通过单因素实验和正交试验优化玉米粉酶解工艺;然后在摇瓶水平对谷氨酸棒杆菌GL-6发酵产谷氨酸的条件进行优化,确定最佳氮源及含量和最佳玉米粉酶解液添加量,然后在20 L发酵罐水平进行验证,将5%的麦芽糊精加入发酵液上清中喷雾干燥得到鲜味料样品,最后对样品进行成分检测及评定。结果表明,玉米粉最佳酶解工艺为固液比1:4,酶添加量1%,温度90 ℃,时间3 h,在该条件下酶解度DE值达到60.84%;谷氨酸棒杆菌GL-6发酵产谷氨酸的最佳氮源为酵母抽提物FIG12LS 30 g/L,玉米粉酶解液最佳添加量为50%（v/v）;天然鲜味料样品MJ谷氨酸含量为43.9 g/100 g,氨基酸总含量为44.8 g/100 g,相较于不添加玉米粉酶解液发酵而得的鲜味料样品CK谷氨酸和氨基酸含量分别提高了24.0%和23.4%。此外,样品MJ富含坚果及咖啡风味的吡嗪类物质,相较于样品CK鲜味含量和营养价值均有提高,风味也更加丰富。本研究为用天然植物原料发酵生产鲜味料提供了新思路,提高了产品的市场竞争力。     

大豆分离蛋白酶解工艺优化及在发酵调味料中的应用

为了提高大豆分离蛋白的加工附加值,采用单因素实验和响应面试验方法,以水解度和蛋白回收率为评价指标优化大豆分离蛋白的酶解条件,并利用谷氨酸棒杆菌发酵大豆分离蛋白酶解液制备调味料,通过谷氨酸含量和感官评价对调味料进行评估。结果表明,FH17&ZF01双酶酶解体系最佳,最优酶解条件为酶添加量2.0 g/100 g、pH7.0、底物浓度15 g/100 mL、温度54.0℃、酶解时间13.0 h,优化后的酶解液水解度（37.1%）和蛋白回收率（70.3%）较优化前分别提高了1.7倍和0.8倍。摇瓶发酵条件下,酶解液发酵的谷氨酸含量（32.1 g/L）较优化前提高了32.1%。20 L罐分批补料条件下,谷氨酸产量为（83.6 g/L）较优化前提高了10.0%。以分批补料发酵制备的调味料的感官评定结果表明,发酵调味料的鲜味显著提高（P<0.05）,苦味显著降低（P<0.05）,整体滋味更加鲜美,风味更加协调。研究结果大大提高了大豆分离蛋白的利用价值。     

谷氨酸清洁发酵工艺研究

为了解决谷氨酸发酵培养基中色素、杂质多所引起的发酵过程稳定性差、产酸低等问题,该研究采用生物氮素对发酵培养基中的主要氮源（玉米浆和豆粕水解液）进行替代,并通过单因素试验和正交试验对清洁发酵培养基中的关键因素生物氮素、生物素、VB1和甲硫氨酸的添加量进行优化,进而获得谷氨酸清洁发酵培养基,进行谷氨酸的清洁发酵工艺研究。结果表明,清洁发酵培养基中关键成分的最佳添加量为生物氮素2.0 g/L、生物素7 μg/L、VB1 10 mg/L、甲硫氨酸0.6 g/L。在最优工艺条件下,清洁发酵菌液OD600 nm值为84.2,谷氨酸产量为171 g/L,糖酸转化率为68.5%,分别较对照提高16.14%、12.50%、4.74%,发酵上清液透光率由0.9%提高至31%,说明清洁发酵培养基能够较好地提升谷氨酸发酵性能。     

溶氧浓度对谷氨酸发酵关键酶的影响

谷氨酸发酵中,不同溶氧条件对产物谷氨酸和主要副产物乳酸的生成积累影响很大。文中研究了不同溶氧条件下和几种非正常条件下的谷氨酸发酵中主要关键酶(谷氨酸脱氢酶和乳酸脱氢酶)的变化规律,为谷氨酸发酵的进一步优化和控制提供了基础数据。     

Changes in enzyme activities at the pyruvate node in glutamate-overproducing Corynebacterium glutamicum

Glutamate is industrially produced by fermentation using Corynebacterium glutamicum. The key factor for efficient glutamate production by this microorganism has been considered to be a metabolic change at the 2-oxoglutarate dehydrogenase (ODH) branch point caused by a decrease in ODH activity under glutamate-overproducing conditions. However, this change would be insufficient because the ODH branch is merely the final branch in the glutamate biosynthetic pathway, and efficient glutamate production requires a balanced supply of acetyl-CoA and oxaloacetate (OAA), which are condensed to form a precursor of glutamate, namely, citrate. Therefore, there must be another (other) change(s) in metabolic flux. In this study, we demonstrated that a decrease in pyruvate dehydrogenase (PDH) activity catalyzes the conversion of pyruvate to acetyl-CoA. It is speculated that carbon flux from pyruvate to acetyl-CoA decreases under glutamate-overproducing conditions. Furthermore, an increase in pyruvate carboxylase (PC) activity, which catalyzes the reaction of pyruvate to OAA, is evident under glutamate-overproducing conditions, except under biotin-limited condition, which may lead to an increase in carbon flux from pyruvate to OAA. These data suggest that a novel metabolic change occurs at the pyruvate node, leading to a high yield of glutamate through adequate partitioning of the carbon flux.     

响应面法优化谷氨酸亚铁的制备工艺

以氯化亚铁和谷氨酸钠为原料,在单因素试验的基础上,利用响应面分析法优化谷氨酸亚铁的固液相法制备工艺条件,选定介质pH值、反应温度和反应时间,通过中心组合试验,建立二次回归方程。结果表明,反应物物质的量比、介质pH值、反应时间及温度对反应产物产率均有一定的影响。优化的制备工艺条件为谷氨酸与Fe2＋物质的量比1∶1、介质pH 5.76、反应时间0.75 h、反应温度58.9 ℃,产率为77.79%。反应产物谷氨酸亚铁螯合物的组成为Fe(C5H7NO4)·2H2O。     

谷氨酸温度敏感突变株发酵过程中丙氨酸浓度近红外模型的建立

丙氨酸是谷氨酸发酵过程中的副产物之一,对谷氨酸产量及转化率有显著影响,因此及时准确监测丙氨酸浓度变化对谷氨酸发酵过程控制有重要意义。为实现谷氨酸发酵过程中丙氨酸浓度的快速检测,采用近红外光谱技术结合偏最小二乘的方法,通过不同光谱预处理和波长范围,建立并优化谷氨酸温度敏感突变株强制发酵过程中丙氨酸浓度预测模型。优化后的模型交叉验证误差均方根、决定系数和剩余预测偏差分别为0.21 g/L、0.97和5.55。以谷氨酸温度敏感突变株强制发酵作为外部检验进一步验证模型的准确性和可靠性,并将预测值与实际值进行对比,经分析其决定系数和平均相对误差分别为0.97和5.83%,表明该模型具有很好的预测能力。本文所建预测模型能够准确快速地对发酵过程中丙氨酸进行预测,可为谷氨酸温度敏感突变株强制发酵过程的实时控制及其优化提供理论基础和借鉴。     

谷氨酸生产菌S_(9114)中依赖于NADPH谷氨酸脱氢酶的纯化及性质

利用DEAE 纤维素离交柱层析、疏水柱层析和凝胶过滤层析等从谷氨酸棒杆菌S9114 中分离纯化出依赖于NADPH的谷氨酸脱氢酶 (GOH NADPH )。经HPLC测定 ,该酶的分子量为 188ku ;经SDS -PAGE电泳测得该酶的亚基分子量为 3 2ku。提示该谷氨酸脱氢酶由 6个亚基组成。该酶对NADPH具有高度专一性 ,在pH 7 5、3 7℃下 ,以α 酮戊二酸、NH4Cl和NADPH为底物时的米氏常数Km 分别为 9 2 2mmol/L、5 2 7mmol/L和 2 3 1× 10 -3mmol/L。最适反应pH为 7 5 ,最适反应温度为 42℃ ,并对热比较稳定。此外 ,KCl对GDH NADPH的活性具有激活作用。     

利用味精废水发酵生产苏云金芽孢杆菌的发酵条件研究

利用搅拌转速为 1 80r/min的 5L发酵罐 ,研究了 1株驯化后的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)在味精废水中发酵生产生物农药的适宜工艺条件 ,并对发酵过程中的各个指标进行了检测。在 1 2m3规模的发酵罐中发酵菌数可达 68 7× 1 0 8/mL ,毒力效价与标准品相当。     

732阳离子交换树脂对屎肠球菌谷氨酸脱羧酶活性的促进作用

通过对732阳离子交换树脂对屎肠球菌谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD,EC4.1.1.15）活性的影响进行探讨,构建了732阳离子交换树脂-细胞GAD复合转化体系。结果表明：经含0.2?mol/L?L-谷氨酸（L-glutamic acid,L-Glu）的0.2?mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH?4.2）平衡的732阳离子交换树脂可显著提高屎肠球菌细胞GAD的转化活性,γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）产量较对照组增加了32.30%;L-Glu/谷氨酸一钠（monosodium glutamate,MSG）（2∶1）固体混合物能有效调节反应体系的pH值和维持反应液的底物浓度,显著增加GABA产量,当添加量为30?g/L时,GABA产量较不添加L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物的对照组提高了52.40%;732阳离子交换树脂与L-Glu/MSG（2∶1）固体混合物对细胞GAD的转化活性具有协同促进作用,适宜的732阳离子交换树脂-细胞GAD复合转化体系组成为732阳离子交换树脂10?g、0.3?mol/L?MSG溶液（溶于0.2?mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液,pH?4.2）10?mL、100?mg/mL屎肠球菌细胞悬液10?mL和L-Glu/MSG（2∶1）混合物30?g/L。在该反应体系下,80?r/min、40?℃水浴振荡器反应24?h,GABA产量为（4.57±0.11）mmol,较对照组GABA产量（（2.29±0.08）mmol）提高了99.56%。     

味精母液处理工艺的优化

介绍了几种不同处理工艺下味精母液的特点 ,并对多种母液处理方法进行了比较。结合工厂实际经验 ,讨论味精末道母液处理工艺的优化问题 ,指出具有发酵车间的大规模味精生产工厂 ,味精末道母液的处理宜采用酸水解法 ,水解液用于中和发酵液 ;以商品谷氨酸为原料的小型工厂可采用碱解 谷氨酸中和法 ;采用再结晶法回收味精 ,减少母液处理量是可行的。     

基于基因组挖掘技术的新型谷氨酸脱羧酶基因挖掘及表达鉴定

采用基因组挖掘技术,以来源于Lactobacillus brevis活性较高的谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase,GAD）LbGAD为探针,从乳酸菌（Lactococcus lactis、Lactobacillus senmaizukei）和肠球菌（Enterococcus sulfureus）的基因组中挖掘到了3 个假定的GAD基因（LlGAD、LsGAD和EsGAD）。借助pET28a质粒分别实现了这4 个基因在大肠杆菌BL21中的表达,其中LsGAD和LlGAD的表达产物可溶性较好,相应发酵液中GAD活力分别为34.17、38.91 U/mL。LsGAD的比活力、温度特性、pH值特性和Kcat/Km值也明显优于其他几个酶。此外,初步研究了全细胞催化L-谷氨酸制备γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）的工艺,6 g/L的L-谷氨酸经过24 h转化后,GABA得率最高可达58%。本研究实现了GAD从基因组数据到真实酶的跨越,获得了1 个性能优良的GAD,并初步实现了GABA的生物合成,为实现GABA低成本、规模化的生物合成提供了科学依据。