枯草芽孢杆菌BJ3-2精氨酸脱羧酶基因speA的克隆与序列分析

根据GenBank中枯草芽孢杆菌168菌株的精氨酸脱羧酶基因speA序列设计特异性引物,提取Bacillus subtilis BJ3-2基因组DNA进行PCR扩增,并克隆至pGEM-T载体后测序。序列分析结果表明,Bacillus subtilis BJ3-2 speA基因ORF长为1 473 bp,可编码490个氨基酸,分子质量为53.53ku,基因登录号为KJ561348,与已报道枯草芽孢杆菌的speA基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性均达93%以上,精氨酸脱羧酶氨基酸序列系统进化树分析,发现Bacillus subtilis BJ3-2的ADC与Bacillus subtilis 168亲缘关系最近,属于典型的III型PLP依赖型鸟氨酸/赖氨酸/精氨酸脱羧酶家族成员。speA基因序列分析及其蛋白保守结构域的分析,为有效控制水豆豉产品中生物胺含量的研究提供了理论依据。     

海洋细菌Pseudoalteromonas sp.NJ631胶原蛋白酶的克隆与表达

对交替假单胞菌Pseudoalteromonas sp.NJ631基因组中潜在的胶原蛋白酶基因进行克隆与表达,并鉴定重组蛋白PNJC的酶活力。根据NJ631基因组序列草图,利用基因组信息发掘方法获得胶原蛋白酶功能提示的编码基因,进而利用高效表达质粒p ET28a构建重组表达系统。经IPTG诱导表达、亲和层析纯化获得重组蛋白纯化产物。以不溶性Ⅰ型胶原蛋白为底物,测定胶原蛋白酶酶活力。对Pseudoalteromonas sp.NJ631基因组信息挖掘,从中发现一条疑似编码胶原蛋白酶的基因序列,命名为Pnjc。该基因全长1 359 bp,GC含量45.62%,编码由452个氨基酸残基组成的约51 000大小的胶原蛋白酶。SDS-PAGE检测表明,胶原蛋白酶PNJC在0.2 mmol/L的IPTG诱导下得到高效表达。经过亲和层析获得纯化重组蛋白PNJC,蛋白质质量浓度约为1 mg/m L。酶活检测表明,PNJC的酶活力为160.34 U/mg,为标准品的70.48%。PNJC高酶活力表明,Pseudoalteromonas sp.NJ631来源的胶原蛋白酶具有重要的研究价值与工业开发潜力。     

基因共表达对人源LysoPLD异源可溶性表达、纯化及酶学性质的影响

目的:为实现人源溶血磷脂酶D（LysoPLD）的原核异源可溶性表达。方法:通过NCBI检索,确定人源LysoPLD基因序列（GenBank: L46720.1）。采用密码子优化后的序列,克隆至pET-28a表达载体中,采用共表达麦芽糖结合蛋白融合标签（MBP）和共表达促蛋白正确折叠分子伴侣触发因子Trigger factor（tig）两种方式提高LysoPLD蛋白在大肠杆菌中的异源可溶性表达,建立对应蛋白的纯化工艺包括离子柱纯化,硫酸铵盐析,疏水柱纯化,淀粉树脂柱（Amylose Resin）纯化,分离纯化获得的重组酶,经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白纯度,以对羟基棕榈酸酯为底物对比两种蛋白的酶学性质。结果:成功构建载体pET28a-MBP-LysoPLD和pET28a-pTF16-LysoPLD,并获得工程菌BL21（DE3）-pET28a-MBP-LysoPLD和BL21（DE3）-pET28a-pTf16-LysoPLD。BL21（DE3）-pET28a-MBP-LysoPLD经0.6 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）低温诱导过夜可获得上清表达的MBP-LysoPLD蛋白;BL21（DE3）-pET28a-pTf16-LysoPLD在含有0.5 μg/mL L-Arabinose的LB培养基中培养,经0.1 mmol/L IPTG低温诱导表达,可获得可溶性表达的LysoPLD蛋白,经纯化,酶纯度可大于80%。以对羟基棕榈酸酯为底物,对比两种方法得到的蛋白的酶学性质,发现二者催化反应的最适温度、最适pH、最适Ca2+浓度、比酶活基本一致。结论:两种基因共表达方式都可实现人源LysoPLD的在大肠杆菌中的可溶性表达,且酶学性质基本相同。     

绿色木霉纤维二糖水解酶基因的克隆及其在乳酸菌中的表达与鉴定

采用乳酸菌表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ 的表达研究。参照GenBank上发表的绿色木霉（Trichoderma viride）cbhⅡ 基因（GenBank登录号：M55080）设计引物并通过聚合酶链式反应克隆获得其cDNA序列长1 441 bp。为了达到表达分泌该酶的目的,在其基因上游序列前添加了大小为80 bp的信号肽序列。进一步通过生物信息学方法将密码子按照乳酸菌的偏好性进行了优化,通过全基因合成获得了优化后的cbhⅡ 基因。将该基因与穿梭表达载体pMG36e连接, 构建原核表达载体pMG36e-S-cbhⅡ ;利用电转化方法将其转入乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中构建重组乳酸菌,纯化的重组菌蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,得到一条约为53 kD的目的蛋白条带,与预期大小相符;利用3,5-二硝基水杨酸法测定培养基上清液中水解纤维素酶的活力达到16.7 U/mL,菌体裂解液上清液和菌体沉淀几乎没有酶活力。结果表明,纤维二糖水解酶基因信号肽序列被乳酸乳球菌正确识别,并成功实现了胞外表达。     

天门冬酰胺酶基因在黑曲霉中的同源表达

根据NCBI中的黑曲霉天门冬酰胺酶基因asp序列(GI:145231287)设计特异性引物,从黑曲霉CICC2462基因组中扩增asp基因编码区,构建其黑曲霉表达载体p SZHG-Asp。通过农杆菌介导法转化黑曲霉,筛选以asp基因置换糖化酶基因gla A的同源重组转化子。对转化子的表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活检测。获得8株在gla A位点发生基因置换的同源重组转化子,并对其中4株的上清液进行检测。SDS-PAGE结果显示,在42 000处有目的蛋白质条带,重组菌株的目的蛋白质表达量为185~417μg/m L,发酵液最高酶活为21 111 U/m L。     

黑曲霉ZM-8葡萄糖氧化酶基因的克隆及其酵母表达载体的构建

以黑曲霉ZM-8基因组为模板,设计了含有6×His标签和胶原蛋白酶识别位点序列的上游引物及下游引物,通过聚合酶链式反应扩增获得葡萄糖氧化酶（GOD）基因,并与Smal酶切平末端pUC19载体连接,对蓝白斑筛选获得的重组子进行酶切鉴定及测序分析,表明该基因（HQ269422．1）大小为1749bp,编码583个氨基酸。用限制性内切酶Notl切下目的基因,插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成表达载体pPIC9K-HisGOD。该重组毕赤酵母表达载体的构建,有望获得高分泌表达、便于纯化的高活性葡萄糖氧化酶,为研制高品质的酶制剂奠定基础。     

肺炎克雷伯氏杆菌二羟丙酮激酶基因(dhaKL)克隆与表达

以肺炎克雷伯氏菌As1.1736的基因组为模板,通过PCR技术成功地扩增了dhaKL基因,并构建了pET-28a(+)/dhaKL表达载体。DNA序列分析的结果表明:dhaKL基因由2个开放阅读框架组成:ORF1全长为1017bp,编码356个氨基酸;ORF2全长633bp,编码210个氨基酸。SDS-PAGE电泳结果表明:dhaKL基因获得了有效表达,上清液中的酶活性为15.6U/mL。     

肺炎克雷伯氏杆菌二羟丙酮激酶基因(dhaKL)

以肺炎克雷伯氏菌Asl.1736的基因组为模板,通过PCR技术成功地扩增了dhaKL基因,并构建了pET-28a(+)/dhaKL表达载体.DNA序列分析的结果表明:dhaKL基因由2个开放阅读框架组成:ORF1全长为1017bp,编码356个氨基酸;ORF2全长633bp,编码210个氨基酸.SDS-PAGE电泳结果表明:dhaKL基因获得了有效表达,上清液中的酶活性为15.6U/mL.     

菠萝泛菌β-1,4-内切葡聚糖酶基因克隆、表达与酶活性分析

利用分子克隆的方法,对一种源于菠萝泛菌的内切葡聚糖酶(即β-1,4-内切葡聚糖酶)基因进行克隆、原核表达,利用Ni-NTA吸附柱对表达的重组内切葡聚糖酶进行纯化,分析重组酶的活性。研究结果显示,此重组内切葡聚糖酶含1个1 002 bp的开放阅读框,编码334个氨基酸序列,重组酶在大肠杆菌细胞中的表达量占可溶性蛋白的50%以上,经过纯化获得了纯度高于95%的内切葡聚糖酶蛋白,酶活力可以达到2 245 U/m L。     

蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus LJ01中亚硝酸盐还原酶的基因克隆、表达和纯化

利用克隆表达技术,对一种蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus LJ01的亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase,NiR）基因进行克隆、原核表达,利用Ni柱亲和层析和DEAE Sepharose Fast Flow交换层析对表达的重组NiR进行纯化,分析重组酶的性质。研究结果显示,该NiR含有一个1?623?bp的开放阅读框,编码540?个氨基酸序列,重组NiR的分子质量约为67?ku;该酶中同时存在铁离子和铜离子,且含量分别为51.0?mg/kg和184.5?mg/kg;圆二色谱结果显示α-螺旋结构在重组NiR中所占比例最大。     

马鲛鱼中精氨酸脱羧酶的基因克隆及生物信息学分析

本研究以马鲛鱼贮藏期内腐败产胺菌-霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)为研究对象,通过基因工程和生物信息学多种分析方法,探究马鲛鱼种霍氏肠杆菌精氨酸脱羧酶的理化性质。通过T-A克隆并测序得到ADC基因,将其翻译成蛋白序列,然后预测蛋白质一级结构、二级结构以及三维构象,分析ADC蛋白质的理化性质及其功能。结果显示:ADC蛋白由93个氨基酸构成,预估分子量大小约为10.82 ku、理论等电点是8.64、原子组成为C₄₉₂H₇₄₆N₁₃₆O₁₃₅S₃、半衰期>10 h(大肠杆菌,体内)、脂肪系数是86.02;总平均亲水性是-0.35整体表现为亲水性,是可溶性蛋白;不稳定系数为48.57,且ADC蛋白不存在信号肽,不是分泌蛋白。这些结果以及同时预测的ADC蛋白的二级结构和三维构象,为后续的深入研究提供参考,今后在基因克隆的基础上,将进行蛋白质的表达、分离纯化和性质研究,进一步解析精氨酸脱羧酶。     

重组牛乳铁素融合表达质粒的构建及其抑菌活性分析

为建立生物合成牛乳铁素的方法,根据牛乳铁素氨基酸序列确定其编码序列,利用PCR 技术获得基因扩增产物,接着将该产物与编码鱼腥蓝细菌Anabaena sp. PCC 7120 的DNA 聚合酶基因dnaENI 中断裂的内含肽基因Asp dnaEIn 的PCR 产物进行重组PCR,将获得的重组融合基因再克隆到表达载体pET-28a 构建重组融合表达质粒。结果显示,融合表达质粒转化大肠杆菌后经诱导能在大肠杆菌表达宿主Escherichia.coli BL21(DE3) 中大量表达,且细胞裂解液与纯化的Anabaena sp. PCC 7120中含断裂内含肽Asp DnaEIc的DNA聚合酶蛋白DnaECI混合反应后对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。     

枯草芽孢杆菌胺氧化酶基因的克隆与表达

以细菌型豆豉工业发酵菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BJ3-2为材料,根据NCBI中菌株B. subtilis 168的胺氧化酶（AMO）基因序列设计同源引物,克隆获得菌株B. subtilis BJ3-2的胺氧化酶基因YobN序列。测序结果显示,YobN基因开放阅读框（ORF）长为1 437 bp,编码478个氨基酸,分子质量为53.79 ku,与菌株B. subtilis 168同源性达98%。目的基因克隆至原核表达载体,获得重组菌pET28a-YobN/BL21,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果显示,浓度为1.0 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）22 ℃诱导5 h,表达量最高达1.30 mg/mL。该研究为AMO活性的研究奠定了基础,对豆类发酵食品中生物胺的控制具有重要意义。     

黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母中的克隆和表达

从高产糖化酶的黑曲霉的cDNA文库中筛选出糖化酶基因,并研究在毕赤酵母中的表达情况。运用RT-PCR从黑曲霉cDNA文库中克隆糖化酶基因的cDNA片段与载体pPIC9K相连,构建重组载体,电转化毕赤酵母GS115,筛选阳性克隆并进行研究。阳性克隆在MM培养基中发酵72 h和1%的甲醇的诱导的情况下,重组毕赤酵母产生的糖化酶酶活最大为15.6 U/mL。测定结果显示,其糖化酶大小为1 908 bp,编码636个氨基酸残基组成的蛋白质。经柱分离纯化其发酵上清液后,用SDS-PAGE电泳方法,测得分子质量大约为80 ku。黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母GS115中成功得到了表达。     

构建人Cu,Zn-SOD毕赤酵母转化子及其高表达研究

设计人Cu,Zn-SOD酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的人Cu,Zn-SOD基因真核表达载体,通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得的重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,基因拷贝数提高2～8倍,活性检测显示提高2～4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,其分子质量为40kD左右,低糖基化,均为分泌表达。Western blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定;Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0、30℃、体积分数1.5%甲醇诱导72h测得上清的目的蛋白表达最好,表明构建了高表达菌株。     

马槟榔甜蛋白基因(MabinlinⅡ)的密码子优化及其在大肠杆菌中的表达

本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性,对马槟榔甜蛋白基因MabinlinⅡ(A链+B链)的密码子进行优化,并将优化后的马槟榔甜蛋白基因命名为MabinlinⅡ(AB)Plus。将MabinlinⅡ(AB)Plus基因与大肠杆菌表达载体pET-28a(+)片段连接,构建重组表达载体pET-28a(+)-MabinlinⅡ(AB)Plus,进而转化到大肠杆菌宿主表达菌株BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达。结果表明,密码子优化后的基因MabinlinⅡ(AB)Plus在大肠杆菌中最佳表达条件为:最适IPTG浓度1.4 mmol/L,最佳诱导剂温度为37℃,最适菌株起始生长量OD₆₀₀为0.7,最佳诱导时间8 h。在最佳诱导表达条件下,目的蛋白表达量占菌体总蛋白约33.0%,与优化前约有提高7%。目的蛋白的上清液经过亲和纯化,在19 kDa处有单一的目的条带。经过感官评定,目的蛋白的甜度约为2%标准蔗糖溶液的400倍。这为研发以马槟榔甜蛋白为基础的新型甜味剂提供了科学的理论依据。     

铜绿假单胞菌脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达

利用PCR方法从分泌脂肪酶的铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增得到了脂肪酶基因,并测定其核苷酸序列,利用基因重组技术构建了脂肪酶基因的分泌表达载体,并在枯草芽孢杆菌中进行了分泌表达。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳表明,表达蛋白占发酵液中蛋白的25%,采用NaOH碱滴定法测定其发酵液酶活为15.26U/mL。     

人乙醛脱氢酶2与NusA的融合表达

通过将乙醛脱氢酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2,ALDH2）与NusA-tag融合表达,以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先,根据Aldh2的基因序列设计引物,引入EcoRI和XhoI的酶切位点,聚合酶链式反应扩增出Aldh2基因片段,连接到pMD19-T-simple载体,并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后,双酶切处理,将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b（＋）上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位点之间,得到pET44b（＋）-NusA-Aldh2重组载体,转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导,表达的融合蛋白具有良好的溶解性,主要存在于上清液中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37 ℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37 ℃,在pH 7.0时达到最好的催化效果。不同金属离子如Ca2＋、K＋、Na＋、Mg2＋、Mn2＋都对酶有激活作用,且Mg2＋效果最好,最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在,复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达,实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达,且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。