高效液相色谱法测定母乳中唾液酸含量

建立荧光高效液相色谱(fluorescence detector-high performance liquid chromatography,HPLC-FLD)测定母乳中唾液酸N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolyl neuraminic acid,Neu5Gc)含量的分析方法。利用酸水解法释放出母乳中的唾液酸,以4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺盐(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride,DMB)为衍生化试剂,50℃避光衍生150min,采用荧光高效液相色谱仪检测。色谱条件：LiChrosorb RP-18柱(250mm×4mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-超纯水(7:8:85),流速0.9mL/min,进样体积10μL,柱温30℃,荧光检测器激发波长373nm,发射波长448nm。结果表明：唾液酸在50～400μmol/L范围内与唾液酸峰面积的线性关系良好,平均回收率为94.0%,精密度的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.4%,稳定性RSD为1.0%,重复性RSD为0.8%,Neu5Ac的最低检出限为0.02μmol/L,Neu5Gc的最低检出限位0.03μmol/L。该方法简单、重复性好、灵敏度高,可广泛用于奶粉、牛奶及母乳中唾液酸含量测定。     

9种鱼卵中的游离态及结合态唾液酸含量的分析比较研究

从不同品种鱼卵中提取出游离态唾液酸和总唾液酸，采用DMB试剂对这2种唾液酸分别进行衍生化标记，再利用高效液相色谱(HPLC)系统性对比分析了9种鱼卵中N-乙酰神经氨(Neu5Ac)和N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)的存在形式及含量的差异。结果表明，游离态和结合态的Neu5Ac在鲫鱼鱼卵中含量最高，每克鱼卵干重中分别含1.61μg和4.07μg;Neu5Gc仅存在于黄花鱼、鳜鱼和鲂鱼的鱼卵中，其中鲂鱼鱼卵中游离态Neu5Gc含量最高，每克鱼卵干重中含0.57μg；而鳜鱼鱼卵中结合态Neu5Gc含量最高，每克鱼卵干重中含0.24μg。以上结果为鱼卵的深度开发利用提供理论依据。     

高效液相色谱-荧光检测法测定红肉及其加工肉中唾液酸含量

采用高效液相色谱-荧光检测法对红肉及其加工肉中两种唾液酸N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac）和N-羟乙酰神经氨酸（N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc）进行定性和定量分析。利用单因素试验对衍生化与样品酸解条件进行优化,并借助超声缩短酸解时间。结果表明,以盐酸作为酸解试剂,超声辅助酸解30 min,4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺盐作为衍生化试剂,衍生化试剂浓度为13 mmol/L,样品与衍生化试剂比值为1∶1,衍生化时间120 min时,检测效果最佳。Neu5Ac和Neu5Gc在0.1～10 μg/mL范围内线性良好,回收率为91.2%～119.7%,检出限分别为0.003 mg/kg和0.01 mg/kg,重复性的相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）为0.7%～1.8%,精密度RSD分别为1.4%和1.2%。本方法具有灵敏度高、分析时间短、重复性及准确性好等特点。     

高效液相色谱-荧光检测法测定发酵红肉制品中Neu5Gc

基于高效液相色谱-荧光检测(HPLC-FLD)技术,建立红肉发酵及制品中N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)的定量分析方法。成功搭建了以酸水解释放试样中的Neu5Gc,4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺盐(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride,DMB)为衍生化试剂,并采用安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱等系列条件的HPLC-FLD分析检测方法。该方法经验证:Neu5Gc在25～400μmol/L范围内与Neu5Gc峰面积的线性关系良好,R2=0.999 41;样品加标平均回收率在96.4%～99.07%之间;RSD为1.2%,重复性的RSD为1.5%;仪器检出限为0.001μmol/L,定量限为0.003μmol/L。检测发酵红肉样品中Neu5Gc的质量分数在9.59～20.08μg/g之间,不同的发酵红肉制品Neu5Gc的含量之间均存在显著性差异(p0.05)。本方法能有效分离Neu5Gc目标峰(分离度R1.5)、操作简单、重复性好、灵敏度和精密度高,可广泛用于发酵红肉制品中Neu5Gc的定量测定。     

超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱测定奶粉中N-乙酰神经氨酸

建立了超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱(ultra performance liquid chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry,UHPLC-MS-MS)测定奶粉中N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5AC)含量的分析方法。采用电喷雾离子源,在负离子采集模式下,利用多重反应监测Neu5AC离子对:308. 070 7(母离子)→87. 000 7(子离子)进行定性定量分析。结果表明,Neu5AC在质量浓度1. 56～50μg/mL范围内,线性关系良好(R~2=0. 999),平均回收率在86. 79%～93. 64%,RSD为3. 78%～6. 42%,检出限、定量限分别为0. 05μg/g、0. 3μg/g,|基质效应|=14. 14%。该方法预处理简单,准确性好、灵敏度、重复性高,可广泛用于奶粉中Neu5AC的分析检测。     

固相萃取-高效液相色谱-柱后衍生荧光法测定奶粉中维生素B11含量

建立了固相萃取-高效液相色谱-柱后衍生荧光法用于测定奶粉中维生素B11含量。奶粉酶解样液经固相萃取小柱纯化后,在ZORBAX SB-C18色谱柱上,以pH=3.5、浓度为0.05mol/L磷酸二氢钾-乙腈体系为流动相,流速为1.0mL/min,进样量20μL,以0.5%过硫酸钾溶液为衍生试剂,反应器温度为60℃,流速0.5mL/min,经荧光检测器(Ex=365nm,Em=440nm,增幅值100,衰减值16)检测定量。结果表明:在0.02～1.76μg/mL范围内该方法线性良好,R2=0.9999,检测限为4ng/mL,定量限为12ng/mL,灵敏度足以满足奶粉检测的需要,方法回收率在92.5%～95.7%之间,变异系数为1.32%。     

不同处理方式对红肉中N-羟乙酰神经氨酸解离的影响

应用不同方法处理红肉(猪肉与牛肉),研究能够有效解离红肉中N-羟乙酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)的预处理方式。将红肉通过水煮、微波加热和有机酸腌制等不同方式进行处理,利用酸水解法释放红肉中的两种唾液酸成分Neu5Gc和N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac),经1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧苯(1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene,DMB)衍生化后用高效液相色谱检测其含量;另外还采用β-半乳糖苷酶水解红肉,再测定水解液中的Neu5Gc和Neu5Ac。结果表明:沸水浴处理红肉后其Neu5Gc和Neu5Ac都有一定程度的解离,水煮时间越长,红肉中Neu5Gc和Neu5Ac解离效果越好,且猪肉中的Neu5Gc相比牛肉的更容易水煮解离。采用微波炉高温处理红肉也能够解离Neu5Gc,但是解离率不超过70.0%,且处理时间影响较小;而Neu5Ac的解离率都低于Neu5Gc。红肉通过不同的弱有机酸腌制处理后Neu5Gc和Neu5Ac解离率差别不大,且醋酸腌制处理后Neu5Gc解离效果较好。另外,β-半乳糖苷酶能有效解离猪肉中Neu5Gc,水解时间越长,解离率越高。对于牛肉,Neu5Gc解离率最高为84.0%,解离效果不如猪肉。     

柱前衍生-高效液相色谱法测定酒中的氰化物

目的建立柱前衍生-高效液相色谱法测定酒中氰化物含量的方法。方法采用异烟酸-巴比妥酸柱前衍生,高效液相色谱法测定。采用菲罗门Gemini C18(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以1%乙酸-乙腈(50:50)为流动相,流速为1.0 ml/min,检测波长为600 nm。结果氰化物的衍生产物的线性范围为0.5~40μg/L,相关系数大于0.9998。仪器检出限为0.5μg/L,白酒、啤酒、葡萄酒中氰化物的平均回收率分别为96.7%,95.7%,96.3%(n=9)。结论该方法准确可靠、灵敏度高、稳定性好,有较好的样品适用性,可为酒中氰化物的测定标准提升提供参考。     

N-丙酰-唾液酸衍生物的化学酶法合成及在测定禽蛋中唾液酸含量的应用

为实现禽类蛋黄和蛋清中N-乙酰神经氨酸（N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac）的准确定量,消除禽蛋样品中分析物以外的物质产生的基质效应对分析结果造成的影响,本研究以甘露糖胺为底物采用化学酶法合成了非天然唾液酸衍生物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷-N-丙酰-唾液酸（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside-N-propionyl-sialic acid,X-Gal-α-2,6-Neu5Prop）,对该衍生物在酸性条件下的水解特性以及稳定性进行研究,并以该衍生物为内标测定了鹌鹑、鹅、珍珠鸡、鸵鸟、鸭、鸽子、火鸡等9种禽类蛋黄和蛋清中Neu5Ac的含量。禽蛋样品和内标物在酸性条件下处理,唾液酸糖缀合物被解离为游离的唾液酸后经荧光标记物邻苯二胺衍生,采用高效液相色谱-荧光检测器对样品进行分析。结果表明,相同浓度的X-Gal-α-2,6-Neu5Ac和X-Gal-α-2,6-Neu5Prop在2 mol/L的醋酸溶液80℃的水解条件下水解程度相当,90 min后能够完全转化为游离的唾液酸。Neu5Ac和Neu5Prop在10 h内仍保持相似的稳定性。蛋清中Neu5Ac的含量在不同物种之间表现出很大的差异。鹌鹑蛋清中Neu5Ac的含量最低（0.13 mg/g）,而鸵鸟蛋清中的最高（2.20 mg/g）,比鹌鹑蛋清Neu5Ac含量高出近17倍。该方法能够消除生物样品中的基质效应,实现对Neu5Ac的准确定量,且样品前处理简单。因此,适合常规食品中Neu5Ac的检测与分析。     

高效液相色谱法测定粮食中苯并芘残留的研究

建立了粮食中苯并芘残留的高效液相色谱测定法.方法采用C18(5μm,4.6mm×250mm i.d)反相色谱柱,流动相为甲醇 水(95∶5),流速1.0mL/min,激发波长365nm,发射波长410nm,柱温35℃,进样量5μL.方法的检出限0.5μg/kg,线性范围0～1000 ng/mL,加标回收率83.3%～88.3%,相对标准偏差为1.86%(n=5).该法具有样品预处理简单,毒性小,灵敏度高,分析时间短等优点,可用于粮食样品的直接测定.     

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆及表达

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(AGE)是合成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)的关键酶。该酶的高效表达是提高全细胞细胞催化法合成Neu5Ac的有效途径。根据集胞藻(Synechocystis sp. PCC 6803)AGE编码基因slr1975序列信息和大肠杆菌密码子偏好性,优化密码子并人工合成目的基因序列slr975-co。将该基因克隆到表达载体pET28a中,构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-slr并实现了目的基因的诱导表达。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白质的相对分子质量在43 000左右,与预期大小一致,纯化产物蛋白质质量浓度约为1.7 g/L。重组AGE的最适反应温度为42℃,最适反应pH为6.0。AGE对GlcNAc、ManNAc的Km值分别为39.0、46.5 mmol/L。以分别表达AGE和N-乙酰神经氨酸裂合酶(NanA)的重组大肠杆菌作为催化剂,以N-乙酰-D-葡萄糖胺为底物,实现了N-乙酰-D-神经氨酸的全细胞催化合成。结果表明,对AGE密码子进行优化实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为全细胞催化法高效合成N-乙酰-D-神经氨酸奠定了坚实的基础。     

柱前衍生法测定茶叶中L-茶氨酸的含量

本文研究了柱前衍生测定茶叶中L-茶氨酸含量的方法。茶叶中的L-茶氨酸用热水提取后,经2,4-二硝基氟苯衍生后上高效液相色谱法测定。色谱条件为:色谱柱(Kromasil C18柱4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:乙腈︰磷酸盐溶液(pH=6.5)=15︰85梯度洗脱;检测波长:360 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:35℃;进样:5μL。本方法检出限4 mg/kg,在1.0~50.0μg/mL呈现良好的线性关系(r=0.999 9),衍生后的样品室温25℃放置6天内稳定,重现性试验相对标准偏差0.16%(n=6),回收率为96.4%~102.2%。本高效液相色谱法可以准确地测定茶叶中L-茶氨酸的含量。     

高效液相色谱-串联质谱法测定母乳中的 N-乙酰神经氨酸

目的建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定母乳中N-乙酰神经氨酸的分析方法。方法用盐酸对样品进行酸水解释放出母乳中的结合态N-乙酰神经氨酸,高速离心后,采用C_(18)柱进行分离。以0.1%甲酸-乙腈溶液和0.1%甲酸-水溶液作为流动相进行梯度洗脱,电喷雾质谱检测,正离子多反应监测模式(MRM)进行定性和定量分析。结果在优化的条件下,N-乙酰神经氨酸在0.01~0.5 mg/L范围线性关系良好(r=0.9997)。以10、50、100 mg/kg 3个添加水平进行加标回收试验,N-乙酰神经氨酸的平均回收率为95.0%~98.7%,相对标准偏差为11.6%~14.5%,N-乙酰神经氨酸的检出限为0.21μg/kg。结论该方法简单、快速、重复性好、灵敏度高,可广泛用于母乳中N-乙酰神经氨酸的测定。     

肉制品中唾液酸含量和形态分析及在加工中的变化

本文主要运用了高效液相色谱法测量了我国牛肉、猪肉等常见肉类及常见熟食制品如火腿、香肠、卤牛肉、风干羊肉、香辣鸭脖中的两种唾液酸N-羟乙酰神经氨酸（N-Glycolylneuraminic acid,Neu5Gc）、N-乙酰神经氨酸（N-Acetylneuraminic acid,Neu5Ac）的含量、存在形式以及不同加工方式对其含量及存在形式的影响。结果表明红肉中Neu5Gc含量：牛肉46.57±2.53 μg/g>猪肉28.69±1.03 μg/g>羊肉29.09±2.32 μg/g,红肉中同时含有结合态Neu5Gc和游离态Neu5Gc,结合态Neu5Gc含量普遍高于游离态Neu5Gc。红肉中Neu5Ac含量：羊肉200.15±24.96 μg/g>猪肉110.89±5.71 μg/g>牛肉80.97±5.60 μg/g。白肉中不含Neu5Gc,鸭肉的Neu5Ac含量最高,为185.73±23.11 μg/g。熟食肉制品中,牛肉制品的Neu5Gc含量仍高于其他红肉熟食制品,并在白肉熟食制品中检测出了Neu5Gc的存在。对红肉进行蒸煮、油炸及腌制处理后Neu5Gc和Neu5Ac含量都有所下降,其中经过油炸处理的样品Neu5Gc和Neu5Ac含量下降最为明显,其次是腌制、蒸煮。本文还研究了蒸煮时间对猪肉中唾液酸含量的影响,即随着蒸煮时间的增加,Neu5Gc、Neu5Ac含量变化的总体趋势减少,蒸煮45 min后结合态唾液酸明显减少,游离态增多。即红肉中特异性含有Neu5Gc,白肉类熟食制品中也可能含有Neu5Gc,通过加工可改变肉制品中唾液酸的含量和形式,但是每种加工方式对于唾液酸含量及形式的改变不同。     

高效液相色谱法快速测定乳粉中叶黄素的质量分数

建立一种测定配方奶粉中叶黄素质量分数的高效液相色谱方法。采用Diamonsil C18色谱柱(5μm,250 mm×4.6 mm),流动相为甲醇-水(97∶3),流速1.0 mL/min,检测波长445 nm,采用空白基质加标实验绘制标准曲线,该方法在0.5～100 mg/L的质量浓度范围内线性关系良好(R=0.9987),加标水平为0.50,1.00,5.00μg/g时,回收率分别介于96.8%～98.4%之间,相对标准偏差介于4.27%～6.73%之间,该方法检测限低于0.10μg/g。该方法操作简便,灵敏度高、准确度高、重现性好,适合于配方奶粉中叶黄素的测定。     

HPLC法测定诺尼果汁中两种环烯醚萜类成分的含量

建立了一种高效液相色谱法同时测定诺尼果汁中车叶草苷酸和去乙酰车叶草苷酸含量的方法。采用Shimpack VP-ODS-C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,乙腈-磷酸水溶液为流动相,流速为0.5 min/mL,检测波长为237 nm。在此条件下,车叶草苷酸和去乙酰车叶草苷酸分离良好,浓度分别在5μg/mL~50μg/mL和25μg/mL~250μg/mL范围内线性关系良好,平均加样回收率为99.02%和102.15%,RSD值为1.58%和2.40%。西沙诺尼果汁车叶草苷酸和去乙酰车叶草苷酸平均含量为0.204 mg/mL和1.640 mg/mL。     

HPLC法测定橙子中L-抗坏血酸含量的研究

建立高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法对橙子中L-抗坏血酸进行含量测定研究。20 g/L偏磷酸溶液作为橙子中L-抗坏血酸的提取剂,超声5 min提取。液相色谱柱采用Inertsil ODS-3C_(18)(5μm,4.6 mm×250 mm),柱温25~℃,0.05 mol/L磷酸溶液-甲醇(90∶10)作为流动相,流速0.800 m L/min,检测波长245 nm。L-抗坏血酸标准品以不同浓度进样,获得标准曲线Y=60 408.6x+38 583.7,相关系数R~2=0.999 6;在1μg/m L~50μg/m L范围内L-抗坏血酸有良好的线性关系;检出限为0.5μg/m L;精密度相对标准偏差RSD=0.67%。     

HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中维生素C

建立婴幼儿配方奶粉中Vc的高效液相色谱测定法.方法采用C18(5μm,4.6mm×250mmi.d)反相色谱柱,流速1.0 mL/min;柱温30℃;流动相:v(甲醇):v(6.8 g/L KH2PO4水溶液,用盐酸调pH2.3)=1:99;进样量5 μL;检测波长215 nm.方法的检出限50μg/g,线性范围20～200 μ/mL,加标回收率80.4～86.2%,相对标准偏差为2.90%.该法具有样品预处理简单、灵敏度高、分析时间短等优点,可用于婴幼儿配方奶粉中Vc的直接测定.     

HPLC法测定婴幼儿配方奶粉中香兰素

建立了婴幼儿配方奶粉中香兰素的高效液相色谱测定法。方法采用C18（5um,4.6mm×250mm i.d）反相色谱柱,流动相为乙腈和0.02moL/L磷酸二氢钠溶液（调pH值4.0）,流速1.0mL/min,检测波长276nm,柱温30℃,进样量20μL。方法定量限10mg/kg,加标回收率96.9%～102.8%,线性范围1.00～50.00μg/mL,相对标准偏差为2.15%。该法具有样品预处理简单,灵敏度高,分析时间短等优点,适用于婴幼儿配方奶粉中香兰素的快速测定。     

超高效液相色谱法测定婴幼儿乳粉中的色氨酸

目的建立婴幼儿乳粉中色氨酸的超高效液相色谱检测方法,并考察乳粉中色氨酸含量与蛋白质含量的相关性。方法样品在145℃下碱性水解4 h,经C18色谱柱(50 mm×4.6 mm,1.8μm)分离。以100 mmol/L KH2PO4-NaOH缓冲溶液-甲醇为流动相,40%甲醇(v:v)等度洗脱,流速为0.5 mL/min,进样量5μL,柱温45℃。荧光检测器检测,激发波长280 nm;发射波长350 nm。结果方法在1~1000μg/L范围内线性关系良好(r=0.999);定量限为1μg/L。添加浓度在0.2、0.5、1.5 mg/g时,色氨酸的回收率介于110.7%~116.3%之间。结论本方法操作简便,可应用于市售乳粉样品中色氨酸含量的测定。对市售样品的测定结果表明,部分婴幼儿乳粉样品的色氨酸含量低于国家限量,此外,乳粉中色氨酸含量与蛋白质含量之间并不呈线性相关。